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Bioengineering

고형암의 병리학적 진행을 재구성하기 위한 3D 세포 인쇄 저산소암-온-어칩

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/61945
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1,3
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University
* These authors contributed equally

Summary

저산소증은 종양 미세 환경의 특징이며 암 진행에 중요한 역할을합니다. 이 문서에서는 3D 세포 인쇄 기술을 기반으로 저산소 암 온 어 칩의 제조 과정을 설명하여 저산소증 관련 암 병리학을 재구성합니다.

Abstract

암 미세 환경은 질병의 진행에 중요한 영향을 미칩니다. 특히 저산소증은 암 생존, 침략 및 화학 저항의 핵심 동인입니다. 저산소증 관련 암 병리학을 연구하기 위해 여러 체외 모델이 개발되었지만, 생체 내에서 관찰된 암 미세 환경의 복잡한 상호 작용은 정확한 공간 제어의 부족으로 인해 아직 재현되지 않았습니다. 대신, 3D 생체 제조 접근법은 암 생태학의 더 나은 에뮬레이션및 정확한 항암 치료 평가를 위한 미생물 계통을 만들기 위하여 제안되었습니다. 본원에서, 우리는 저산소암을 제조하기 위하여 3D 세포 인쇄 접근을 제안합니다- 에-a-칩. 칩내저산소유도 성분은 산소 분포의 컴퓨터 시뮬레이션에 기초하여 결정되었다. 암-스트로마 동심링은 교모세포종 세포와 내피 세포를 포함하는 바이오 잉크를 사용하여 인쇄하여 고형암의 유형을 재구성하였다. 결과 칩은 대표적인 병리학 적 마커의 형성과 암에 중앙 저산소증과 악화 악성 을 실현. 전반적으로, 고체 암-미량 미생물 계통을 만들기 위한 제안된 접근은 암 연구를 위한 생체 내 및 체외 모델 사이 격차를 해소할 것으로 예상됩니다.

Introduction

암 미세 환경은 암 진행을 이끄는 중요한 요소입니다. 생화학, 생물리, 세포 단서를 포함한 여러 구성 요소는 암의 병리학적 특징을 결정합니다. 이들 중 저산소증은 암 생존, 증식 및 침입 1과 밀접한 관련이있다. 암세포의 무한한 성장과 분열로 인해 영양소와 산소가 지속적으로 고갈되고 저산소 그라데이션이 생성됩니다. 낮은 산소 조건에서, 세포는 저산소증 유도할 수 없는 전사 인자 (HIF)-관련 분자 캐스케이드를 활성화합니다. 이 과정은 괴사 코어를 유도하고, 신진 대사 변화를 유발하며, 혈관 증식 및 전이2,3을개시한다. 그 후, 암세포에 있는 저산소증은 이웃한 정상 조직의 파괴를 일으키는 원인이 됩니다. 더욱이, 저산소증은 다인성 매너에서 고형 종양의 치료 저항과 강하게 연관된다. 저산소증은 반응성 산소 종1,4로인해 방사선 반응이 제한되기 때문에 방사선 요법을 심각하게 방해할 수 있다. 또한, 약물 축적을 감소시키는 암 미세환경의 pH 수준을 감소시키는1. 따라서, 체외에서 저산소증과 관련된 병리학적 특징을 재현하는 것은 과학적 및 전임상 연구 결과를 위한 유망한 전략입니다.

암의 특정 미세 환경을 모델링하는 것은 암 발달을 이해하고 적절한 치료를 탐구하는 데 필수적입니다. 동물 모델은 강한 생리적 관련성 때문에 널리 사용되었지만 종 차이 및 윤리적 문제와 관련된 문제는5. 더욱이, 기존의 2D 및 3D 모델은 심층 분석을 위해 암세포의 조작 및 실시간 이미징을 허용하지만, 그들의 건축 및 세포 복잡성은 완전히 재구성될 수 없다. 예를 들어, 암 스페로이드 모델은 스페로이드에서 암세포 응집이 코어에서 저산소증을 자연적으로 생성할 수 있기 때문에 널리 사용되고 있다. 더욱이, 균일한 크기의 셀룰러 스페로이드의 다수는 플라스틱 또는 실리콘 기반 멀티웰 시스템을 사용하여 생산되었다6,7. 그러나, 종래의 플랫폼을 통해 암 조직의 정확한 이질적 구조를 포착하는 것과 관련하여 유연성이 낮을수록 암 연구를 개선하기 위한 고생물학적 플랫폼을 구축하기 위한 첨단 생체 제조 기술의 확립이 요구되고있다 8.

3D 미생물학적 시스템(MPS)은 암세포9의복잡한 기하학적 및 병리학적 진행을 재구성하는 유용한 도구이다. 암세포가 생화학적 그라데이션을 감지함에 따라 성장인자와 케모키인의 생화학적 그라데이션과 시스템에서 재현된 기계적 이질성, 암 발달의 중요한 특징은 시험관내에서 조사될 수 있다. 예를 들어, 암 생존가능성, 전이성 악성, 및 다양한 산소 농도에 따른 약물 내성은 MPSS10,11을사용하여 연구되고 있다. 최근의 발전에도 불구하고, 체외 모델의 저산소 조건을 생성하는 것은 물리적 가스 펌프와의 연결을 포함하여 복잡한 제조 절차에 의존합니다. 따라서 암별 마이크로 환경을 구축하는 간단하고 유연한 방법이 필요합니다.

3D 세포 인쇄 기술은 토착 생물학적 구조를 재구성하기 위해 생체 재료의 공간 적 배치를 정밀하게 제어하여 상당한 주목을 받고있다(12) 특히, 이 기술은 암 미세 환경의 공간 적 특징을 구축하기 위한 높은 제어력과 타당성으로 인해 3D 저산소증 모델의 기존 한계를 극복한다. 또한 3D 프린팅은 층별 공정을 통해 컴퓨터 지원 제조를 용이하게 하여 실제 조직 아키텍처를 모방하기 위해 복잡한 형상을 신속하고 정확하며 재현 가능한 시공을 제공합니다. 3D MPS에 대한 기존 제조 전략의 장점 외에도, 암 진행의 병리학적 특징은 생화학적, 세포 및 생물물리학성분(13,14)을패턴화하여 재현될 수 있다.

본 명세서에서, 고형암의 이질성을 회수하기 위한 저산소암-온-어칩을 위한 3D 세포 인쇄 전략을 제시한다(도1)15. 제조 파라미터는 시스템의 중앙 저산소형성의 전산 시뮬레이션을 통해 결정되었다. 암-스트로마 동심링은 교모세포종 세포와 내피세포를 함유한 콜라겐 바이오잉크를 사용하여 인쇄하여 고형암의 일종인 교모세포종의 병리생리학을 모방하였다. 방사형 산소 그라데이션의 형성은 강화 된 공격성을 나타내는 암 악성 종양을 악화시켰다. 또한, 당사는 환자 별 전임상 모델에 칩의 적용에 대한 미래의 관점을 나타냅니다. 고체 암-미량 미생물 시스템을 만들기 위한 제안된 접근법은 암의 생체 내 및 체외 모델 사이의 격차를 해소할 것으로 예상된다.

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Protocol

1. 산소 그라데이션 형성의 컴퓨터 시뮬레이션

  1. 저산소암 온더칩 프린팅을 위한 3D 지오메트리 모델 생성
    1. 3D CAD 소프트웨어를 실행합니다.
    2. 저산소암의 기하학 모델을 스케치합니다. 스케치를 클릭하고 원하는 평면을 선택하여 형상을 그립니다. 각 부품의 상세 척도에 대한도면(도 2A)을참조하십시오.
    3. 피처-돌출 보스/베이스를클릭하여 형상의 두께를 설정합니다. 빈 상자에 원하는 두께(그림 2A참조)를 입력하고 녹색 확인 아이콘을 선택하여 3D 형상을 형성합니다.
      참고: 암 에 칩의 치수는 원하는 양의 미디어 및 하이드로겔을 기반으로 정의됩니다. 본 실험에서, 압출 기반 바이오프린터의 해상도를 위한 이전의 실용적인 경험을 바탕으로 각각 약 1,500μL 및 500 μL의 미디어 및 하이드로겔이 있었다.
    4. 형상 파일을 3D CAD 파일 형식(.prt 또는 .stl)으로 저장합니다.
  2. 저산소 코어 유도를 위한 세포 밀도 결정
    1. 물리적 확산 시뮬레이션 프로그램을 실행합니다.
    2. LiveLink를 클릭하고 사용된 CAD 프로그램을 선택합니다. 동기화를 클릭하여 시뮬레이션 프로그램에서 저산소암의 형상을 가져옵니다. 챔버의 내부 공간이 실제 실험 환경에서 배양 배지로 채워질 것이기 때문에 산소는 챔버의 내부 공간과 세포 구성을 가로질러 확산되며, 이는 세포가 함유된 하이드로겔로 구성됩니다.
      참고: 물리적 매개 변수15에대한 자세한 내용은 이전 스터디를 참조하십시오.
    3. 가져온 3D 형상을 산소 확산을 관측하는 공간의 제어 부피로 정의하고, 세포는 산소를 소비한다(도2B).
    4. 사용자 가이드 및 이전에 확립된방법(16,17)에따라 가스 확산 분석을 위한 컴퓨터 분석을 실행한다.
    5. 컴퓨터 분석 결과에서 사용자 가이드 다음 각 시점에서 섹션 A-A를 통해 추정된 산소 농도 데이터를 내보냅니다. 지배 방정식은 피크의 첫 번째 법칙을 기반으로, Eq. (1)(그림 2C)에표현.
      Equation 1
      여기서 c는 농도이고, D는 산소 확산 계수이고, N세포는 세포의 Equation 2 밀도이고, 산소의 최대 상승속도이며, Km은 마이클리스-멘텐 상수이다. 상수는 이전간행물(15)에설명된 대로 적용되었다.
      참고: 각 시간 지점은 시간이 지남에 따라 산소 확산 변화를 관찰하는 단계 지점을 의미합니다.
    6. 최소한의 산소 수준이 저산소증의 임계값에 도달했는지 여부를 평가하고 세포 밀도의 증분 또는 감소로 컴퓨터 분석 프로세스를 반복합니다.
      참고: 하이드로겔 영역에서 80%의 산소 레벨이 24시간 후 0.02mMM 미만인 경우 저산소분해 그라데이션이 구체에서 형성된다는 것을 정의한다.
    7. 1.2.5단계에서 의 첫 번째 법칙에서 중앙 지역에서 산소 그라데이션 유도 저산소증을 생성하는 데 필요한 세포의 수를 확인하고 시뮬레이션 결과는 1.2.6단계로부터 발생한다.
      참고: 이 프로토콜에서 셀 수는 2 × 106 개의 세포 / 각 구조였습니다.

2. 암세포및기질세포의 세포 배양

  1. 생리적 스트레스를 피하기 위한 세포 배양 매체의 준비
    1. U-87 MG 세포(불멸의 인간 교모세포종 세포주)의 경우, 10% 태아소 혈청을 함유한 고혈당 덜벡코의 수정된 독수리 배지 12mL을 배치하고, 100 U/mL 페니실린, 및 T-75 세포 배양에서 100 μg/mL 연쇄 절제술은 37°C에서 플라스크, 5%CO2 가습된 인큐베이터는 30분 동안 세포상에 있는 배지의 열 및 알칼리성 효과를 최소화한다.
      참고: 교모세포종은 저산소 환경에서 공격적인 특성을 가지고 있기 때문에 고형암의 일종으로 선택되었다. 다른 다양한 유형의 암은 이 모델에 적용될 수 있다.
    2. 인간 적인 배빌루칼 정맥 내피 세포(HUVEC)의 경우, T-75 세포 배양소에서 내피 세포 성장 배지 12mL을 37°C에서 37°C에서 37°C로 37°C로 배치한다.
      참고: HUVECs는 가장 대표적인 내피 세포주 중 하나이기 때문에 선택되었습니다. 기질 세포의 다양한 유형은 또한이 모델에 적용 될 수있다.
  2. 냉동 보존 암세포와 기질 세포 및 유지 보수의 신속한 해동
    1. 액체 질소 용기에서 라미나르 플로우 캐비닛으로 5 x 105 U-87 MG 세포 및 HUVEC를 포함하는 극저온을 이동합니다. 캡을 즉시 풀고 다시 조이면 내부 압력을 해제합니다.
    2. 냉동 보존 된 세포를 37 °C의 수조에 조심스럽게 2 분 동안 놓고 캡을 물 밖으로 유지합니다. 오염을 방지하기 위해 라미나르 흐름 아래 70 % 에탄올로 바이알을 헹구십시오.
    3. 해동된 세포를 2.1단계에서 기재된 준비된 세포 배양 배지를 함유한 플라스크로 옮기고 세포 회수를 위해 37°C에서 5%CO2 가습된 인큐베이터에 세포 함유 플라스크를 배치한다.
    4. 세포 배양 배지를 2일마다 새로 고치고 세포 성장을 유지한다.
    5. 해동 후, 세포 배양 매체를 대체하여 세포 동결에 사용된 디메틸 설옥산화물(DMSO)의 세포 독성을 피한다. 6개 미만의 구절을 거친 HUVEC를 사용하십시오.

3. 콜라겐 프리젤 용액 의 준비

  1. 0.1N 염산(HCl)을 가진 콜라겐 스폰지의 용해성
    1. 0.1 N HCl의 용액을 준비하고 0.2 μm 주사기 필터로 필터링합니다.
    2. 1% (w/v) 중화 콜라겐 프리 젤 용액의 3mL의 경우 5 x 5mm2 개로 자른 콜라겐 스폰지와 무게 30 mg을 준비하십시오.
    3. 절단 된 콜라겐 조각을 멸균 10 mL 유리 유리 바이알로 옮길.
      참고: 콜라겐 용액의 끈적끈적한 특성으로 인해 하이드로겔의 손실을 고려하여 필요한 콜라겐 하이드로겔의 1.5배 의 부피를 준비한다.
    4. 콜라겐 함유 유리 바이알에 0.1 N HCl의 2.4mL을 넣고 3일 동안 15rpm 및 4°C로 로커에 배양한다.
      참고: 0.1 N HCl 용액의 부피는 필요한 콜라겐 하이드로겔의 최종 부피의 4/5였다. 이 경우 콜라겐 3mL이 준비되었다.
    5. 소화 후 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 소화되지 않은 콜라겐 입자를 체질합니다. 산성 콜라겐 용액을 4°C에 저장하고 7일 이내에 사용하십시오.
  2. 1% 중화 콜라겐 프리젤 용액에 대한 pH 조정
    1. 산성 콜라겐 용액을 4°C에서 5분 동안 1224 x g에서 원심분리합니다.
    2. pH 지표로서 페놀 레드 용액 30μL을 1%(v/v) 및 10배 인산완충식염식염수(PBS) 버퍼300을 콜라겐 프리젤 용액에서 10%(v/v)의 최종 농도로 추가한다.
    3. 1N 나트륨 수산화(NaOH)로 pH를 7로 중화하여 색 변화를 확인합니다.
      참고 : 수식에 따라, 두더지 H+ = 어피에 H+ X 볼륨 H+ = 두더지 OH-= 어피도 OH- x 볼륨 OH-NaOH의 240 μL을 추가합니다.
    4. 증류수를 추가하여 총 3mL의 부피를 얻습니다.
    5. pH 조정 후 중화 콜라겐 프리젤 용액을 4°C에 저장하고 3일 이내에 사용하십시오.
      참고: 중화 콜라겐 프리젤 용액의 겔화를 미리 검사하려면, 양성 변위 피펫을 사용하여 작은 접시에 50 μL 콜라겐 방울을 만들고 1h에 대한 37°C 인큐베이터에 배양한다. 콜라겐 물방울의 교차 연결을 확인하는 다음 세 가지 방법을 참조하십시오.
    6. 콜라겐의 색상이 투명한 색상에서 불투명한 흰색으로 변경되었는지 확인합니다.
    7. 용기를 기울이고 콜라겐이 용기의 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다.
    8. 물방울에 1x PBS를 붓고 콜라겐 구조가 용액에서 파손되지 않았는지 확인합니다.

4.3D 가스 투과성 장벽 인쇄

  1. 희생 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트) (PEVA) 몰드의 3D 프린팅
    1. 3D CAD소프트웨어(도 3A)를이용하여 1단계에서 정의된 희생PEVA 몰드의 3D 형상을 생성한다.
      참고: 치수, 단위 및 선 유형을 포함한 3D 형상 및 상세 모델 스케일이 그림 2A에표시되었습니다.
    2. 파일 | 클릭하여 3D CAD 파일을 STL 파일 형식으로 변환합니다. 파일 형식을 STL로 저장합니다. 또한 옵션 | 클릭하십시오. G 코드 생성을 위한 ASCII로 출력 양식.
    3. 파일 | 클릭하십시오. STL 파일을 열고 저장된 STL 파일을 선택하여 생성된 STL 파일을 가져옵니다. STL-CAD 교환기의 슬라이스 모델을 클릭하여 희생 PEVA 금형(그림3B,C)의G 코드를 자동으로 생성합니다.
      참고: 인쇄 경로는 STL 파일의 기본 그림과 슬라이싱 평면(예: 레이어)사이에 교차된 점을 연결하여 생성됩니다. 기본적으로 STL 파일의 조각의 기본 그림은 3D 좌표를 포함하는 삼각형입니다. 삼각형과 레이어 사이의 교차점을 얻은 후, 인쇄를 위한 G 코드는레이어(18)에겹치는 경로 없이 각 점을 연결하여 생성된다. 모든 G코드 생성 알고리즘을 탑재한 소프트웨어는 칩 제작을 위한 인쇄 경로를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
    4. 멸균 접착제 및 친수 성 히스토릭 슬라이드를 준비합니다.
      참고: 친성 슬라이드 유리는 유리에 폴리디메틸실록산 (PDMS)의 영구 결합과 암세포와 기질 세포를 캡슐화 하는 콜라겐 구조의 접착에 대 한 중요 하다.
    5. 110°C에서 500kPa의 공압으로 50G 정밀 노즐로 슬라이드에 희생 PEVA 몰드를 인쇄합니다.
      참고: 선 너비는 재료의 이송 속도, 노즐 게이지 및 온도의 영향을 받습니다. 50G 노즐을 사용하였고, 희생벽에 대해 500 μm 선 폭을 생성하기 위해 400의 이송속도를 적용했다. 노즐 게이지, 공압 및 공급 속도는 실제결과(19)로정의됩니다. 희생 벽은 다음 제조 단계인 PDMS 용액을 보유하기에 충분히 두껍게 해야 합니다.
  2. 폴리디메틸실록산(PDMS) 장벽 주조
    1. 6 mL PDMS 베이스 엘라스토머와 0.6 mL 경화제를 플라스틱 저수지에 5분 이상 균일하게 혼합합니다. 이것은 PDMS의 끈적끈적한 특성 때문에 손실을 고려하여 6 개의 저산소 암 온 칩을 제조 할 수 있습니다.
    2. 혼합 된 PDMS 솔루션을 10 mL 일회용 주사기에 로드하고 주사기 헤드에 20 G 플라스틱 테이퍼 디스펜스 팁에 맞춥니다.
    3. 주사기에 혼합 된 PDMS 용액으로 희생 PEVA 금형을 채웁니다. 혼합 된 PDMS는 희생 PEVA 금형을 볼록한 표면으로 채웁니다. PDMS 장벽의 높이는 PEVA 금형의 높이보다 높을 것입니다.
    4. PEVA의 용융을 피하기 위해 36 시간 이상 40 °C에서 오븐에서 PDMS 장벽을 치료하십시오. PEVA의 용융 온도인 온도를 88°C 이상으로 높이지 마십시오.
    5. 희생PEVA 몰드를 정밀 핀셋으로 분리하고 오토클레이브에서 120°C에서 가스 투과성 장벽을 살균합니다.

5. 세포 캡슐화된 콜라겐 바이오 잉크 준비

  1. 준비된 암세포 및 기질 세포의 분리
    참고: 셀 생존 가능성을 고려하여 셀을 분리한 후 가능한 한 빨리 전체 인쇄 공정을 완료해야 합니다.
    1. 혈청 피펫을 사용하여 1x PBS의 10mL로 암 및 기질 세포를 씻는다; 피펫을 사용하여 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 2mL로 치료하고 37°C에서 3분 동안 배양한다.
    2. 세포 배양 배지의 3mL로 트립시화 세포를 중화; 세포의 현탁액을 15mL 원심관으로 수집하고 원심분리기는 516 x g에서 20°C에서 5분 동안 수집합니다.
    3. 수퍼날레를 천천히 흡인한다. 5mL 세포 배양 배지에서 세포 펠릿을 재일시 중단하고 혈종계를 사용하여 세포의 수를 계산한다.
    4. 새로운 15 mL 원판 튜브로 각 세포 유형의 5 x 106 세포를 전송하고 20 °C에서 5 분 동안 516 x g에서 원심 분리기.
    5. 슈퍼 네티퍼를 흡인하고 젖은 얼음에 놓습니다.
  2. 각 세포 유형의 혼합을 1% 중화 콜라겐 프리젤 용액과 혼합
    참고: 1% 중화 콜라겐 프리젤 용액의 열 응고를 피하기 위해 젖은 얼음에서 이 공정을 수행해야 합니다.
    1. 각 유형의 세포 배양 배지를 20 μL로 5.1.4 단계로 회수한다.
    2. 1% 중화 콜라겐 프리젤 용액1mL을 각 재일시 중단된 세포 현탁액에 넣고 양변위 파이펫을 사용하여 균질하게 혼합합니다. 각 세포 유형의 최종 농도는 5 x 106 세포/mL입니다.
    3. 세포 캡슐화된 콜라겐 바이오잉크를 포지티브 일회용 파이펫을 사용하여 3mL 일회용 주사기로 옮기고 3D 셀 프린팅까지 주사기를 4°C에 저장한다.

암 스트로마 동심 고리의 6.3D 세포 인쇄

  1. 암세포와 기질 세포를 캡슐화하는 콜라겐 바이오잉크의 3D 세포 인쇄
    1. 3D CAD 소프트웨어를 사용하여 1.2 단계에서 정의된 암 스트로마 동심 고리의 3D 형상을 생성합니다.
      참고: 암 스트로마 동심 링의 치수는 시뮬레이션 된 매개 변수를 통해 정의됩니다. 최종 차원 매개 변수 치수는 그림 3A에표시됩니다.
    2. 3D CAD 파일을 STL 파일 형식으로 변환하고 STL-CAD 교환기를 사용하여 암 스트로마 동심 링의 G 코드를 생성합니다.
      참고: G 코드 생성 알고리즘의 경우 4.1.2 단계의 메모를 참조하십시오.
    3. 3mL 일회용 주사기에 포함된 셀 캡슐화된 콜라겐 바이오잉크를 3D 프린터의 머리에 적재하고 헤드와 플레이트의 온도를 15°C로 설정한다.
      참고: 프린터의 헤드 와 플레이트의 온도가 37°C 이상에 도달하면 바이오잉크가 교차 연결되고 더 이상 인쇄되지 않습니다.
    4. 생성된 인쇄 경로를 3D 프린터의 제어 소프트웨어에 로드합니다.
    5. 시작 버튼을 클릭하여 15°C에서 약 20kPa의 공압으로 18G 플라스틱 바늘을 장착한 G 코드에 이어 암세포와 기질 세포를 가스 투과성 장벽에 캡슐화하는 콜라겐 바이오잉크를 인쇄합니다.
    6. 모든 인쇄 작업이 끝나면 가스 투과성 장벽 위에 멸균 된 22mm x 50mm 유리 커버를 수동으로 배치하여 저산소 그라데이션을 생성합니다.
      참고: 저산소 그라데이션의 생성을 확인하기 위해 유리 커버(GR+) 및 부재(GR-)의 존재에 따라 두 그룹을 비교합니다.
    7. 3개의 저산소암 온칩을 생성한 후, 칩을 37°C에서 인큐베이터로 이송하여 콜라겐 바이오잉크를 교차 연결한다.
  2. 저산소암의 제조 공정 및 유지 보수 완료
    1. 저산소암온칩의 모든 3D 세포 인쇄 공정을 완료한 후, 단단한 접합을 위해 세포 스크레이퍼로 가스 투과성 장벽 위에 커버 안경을 부드럽게 문지릅니다(도4A,B).
      참고: 커버 글래스와 가스 투과성 장벽은 화학 접착제 없이 소수성 결합을 통해 조립되어 커버 유리와 PDMS 장벽 사이의 접합 부분을 긁어냅니다.
    2. 각 칩에 내피 세포 성장 배지의 1.5 mL을 소개합니다. 암 구조의 분리를 피하기 위해 칩의 한쪽에서 세포 배양 배지를 소개합니다. 칩을 기울여 세포 배양 매체가 파이펫을 사용하여 흐를 수 있도록 합니다.
    3. 일주일 동안 매일 세포 배양 매체를 새로 고칩니다. 피펫을 사용하여 세포 배양 배지를 흡인하는 경우; 압력 펌프를 사용하지 마십시오.

7. 인쇄 후 셀 생존 가능성 평가

  1. 칼신 AM 및 EthD-1 용액으로 샘플 및 치료 준비
    1. 37 °C에서 수조에 1 배 PBS를 따뜻하게.
    2. 칼세인 아세톡시메틸(calcein AM)의 0.75 μL과 에티듐 호모디머(EthD-1)의 3μL을 1.5mL에 1.5mL의 사전 따뜻하게 한 PBS에 추가하여 분석 용액을 준비한다.
    3. 조심스럽게 파이펫을 사용하여 칩에서 모든 미디어를 흡인.
    4. 미리 따뜻해진 PBS로 암 구조를 세척합니다. 파이펫을 사용하여 칩에 1.5 mL PBS를 채우고 실온에서 10 분 동안 방치하십시오. 암 구조의 변형을 피하기 위해 칩의 한쪽에서 1x PBS를 도입하고 1x PBS가 흐를 수 있도록 칩을 기울입니다.
    5. 칩에서 PBS를 흡인; 1.5mL 분석 용액을 처리하고 빛으로부터 보호하기 위해 호일을 사용하여 20 분 동안 37 °C에서 칩을 배양하십시오. 파이펫을 사용하여 1x PBS를 흡인합니다. 흡입 펌프를 사용하지 마십시오.
  2. 형광 현미경을 이용한 세포 생존가능성의 이미징
    1. 형광현미경(도 4C)을사용하여 표지된 세포를 보고 캡처합니다.
      참고 : Calcein AM은 녹색 형광 (파장 ~ 488 nm)을 가진 살아있는 세포를 표시합니다. EthD-1은 적색 형광을 가진 죽은 세포의 신호를 나타낸다(파장 ~594 nm).
    2. 이미징 소프트웨어, 오픈 소스 이미지 처리 프로그램을 사용하여 라이브 및 죽은 셀의 수를 계산하고 숫자로 생존 가능성을 계산합니다.

8. 중앙 저산소증의 형성과 암 악성종양에 미치는 영향을 검증하기 위한 면역형광

  1. 암 구조의 고정, 투과성 및 차단
    1. PBS 1배, 파라포름데히드(PFA), 0.1% (v/v) 트리톤 X-100, 실온에서 소 세럼 알부민(BSA)을 2% 준비한다.
    2. 조심스럽게 파이펫을 사용하여 칩에서 모든 미디어를 흡인하고 1x PBS로 칩을 세 번 헹구세요. 암 구조의 변형을 피하기 위해 칩의 한쪽에서 1x PBS를 도입하고 1x PBS가 흐를 수 있도록 칩을 기울입니다. 각 세척 단계 사이에 칩이 1x PBS로 5분 동안 서서 잔류 용액을 제거하십시오.
      참고: 1x PBS는 압력 펌프가 아닌 파이펫을 사용하여 흡입되었습니다.
    3. 파이펫을 사용하여 칩의 암 구조에 4% PFA의 500 μL을 추가; 15 분 동안 두고 암 구조의 세포를 해결하기 위해 1 x PBS로 세 번 씻습니다.
    4. 500 μL의 0.1% 트리톤 X-100의 암 구조를 5분 동안 실온에서 파이펫을 사용하여 치료하고 세포막을 용해시키고 투과화하기 위해 1x PBS로 세 번 세척합니다.
    5. 반응성 전형을 차단하기 위해 실온에서 파이펫을 사용하여 2% BSA의 500 μL로 암 구조를 치료합니다.
      참고: 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 칩을 덮습니다.
    6. 1 시간 후, 1 x PBS로 칩을 세 번 씻으시다.
  2. 1 차적인 항체를 가진 처리, 이차 항체, 및 DAPI 및 공초점 현미경을 사용하여 구조의 화상 진찰.
    1. 1x PBS에서 항체를 원하는 각 작업 농도로 희석시킴으로써 동위형 대조군 항체 및 1차 항체의 칵테일을 준비한다.
      참고: 항체의 특정 세부 사항은 재료 표에나열됩니다. 일차 항체와 동일한 작업 농도의 동형 조절 항체를 사용해야 한다.
    2. 피펫을 사용하여 칩에서 모든 1x PBS를 조심스럽게 흡인하고 칩을 200 μL 1차 항체 용액으로 하룻밤 사이에 4°C로 처리한다. 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 칩을 덮습니다.
    3. 1차 항체 용액을 흡인하고 1x PBS로 칩을 세 번 세척합니다.
    4. 원하는 작업 농도에 1x PBS에서 이차 항체 및 DAPI를 희석.
      참고: 녹색 형광-컨쥬게이드 이차 항체는 이 경우 1:200의 비율로 사용된다. DAPI는 1:1000의 비율로 사용되었습니다.
    5. 피펫을 사용하여 칩에서 모든 1x PBS를 조심스럽게 흡인시키고 칩을 4°C에서 4°C에서 200 μL 이차 항체-DAPI 용액으로 3시간 동안 처리한다. 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 칩을 덮은 다음 알루미늄 호일로 감싸광표백을 방지합니다.
    6. 이차 항체-DAPI 용액을 흡인하고 1x PBS로 칩을 세 번 세척합니다.
    7. 염색 단계를 마친 후, 포셉을 부드럽게 잡아서 암 구조를 공초점 접시로 옮기다.
    8. 공초점현미경(도 5)을사용하여 표지된 세포를 시각화하고 캡처합니다.
      참고: 공초점 현미경의 파장이 형광 마커의 종류에 따라 조정되었습니다. 항체의 특정 세부 사항은 재료표에기재되어 있다. 세포 위치를 효율적으로 검출하기 위해, 처음에 분분의 DAPI 염색 핵을 관찰하는 것이 더 좋을 것이다. 형광 신호의 검출 흥분/방출 파장은 358/461 nm(DAPI, 블루), 494/517 nm(녹색), 590/617 nm(빨간색)이었다. 배율은 4배, 10배, 20배로 가장 낮은 배율에서 가장 높은 배율을 조절했다.

9. 통계 분석

  1. 이미지 처리 프로그램을 갖춘 셀 카운팅
    1. 이미지 처리 프로그램을 실행하여 라이브 셀 및 죽은 셀 수를 계산합니다.
    2. 형광 이미지 파일을 엽니다. 파일 | 클릭하십시오. TIFF 이미지를 열고 가져옵니다.
    3. 이미지를 16비트 회색 크기 이미지로 변환합니다. 이미지 | 클릭 | 유형 16 비트 그레이 스케일.
    4. 이미지 | 클릭하여 임계값 조정 조정 | 임계값을 선택한 다음 검정색으로 셀의 색상을 선택합니다.
    5. 프로세스 | 클릭하여 병합된 셀을 잘라냅니다. 바이너리 | 정확한 세포 계산을 위한 분수령.
    6. 분석 분석을 클릭한 다음 파티클 분석에서 세 번 계산합니다. 평균을 계산하고 데이터를 표준 오류로 ± 평균으로 제시합니다.
      참고: 면역형광마커는 형광 강도를 비교하여 분석하였다.

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Representative Results

저산소암-온-어칩은 저산소증 및 암 관련병리학(그림 1)을재구성하기 위해 컴퓨터 보조 3D 세포 인쇄 기술을 사용하여 개발되었다. 산소 수송 및 소비는 3D 형상 모델을 사용하여 시뮬레이션되었습니다. 칩은 항암조직(도 2A)에서방사형 산소 확산 및 고갈을 모방하기 위해 동심 고리의 형태로 설계되었습니다. 산소가 분산되어 세포에 의해 소비된 공간의 제어 부피를 정의한 후, 중앙 저산소증 생성에 적합한 세포 밀도는 전산 유한 요소분석(도 2B,C)을통해 결정되었다.

저산소암에 대한 3D 프린팅 경로 코드는 이전 결과에 기초하여생성되었다(그림 3). 희생PEVA 금형 및 암 구조의 CAD 파일은 STL 파일 형식(그림3A,B)으로변환되었다. 인쇄 경로는 사내 소프트웨어프로그램(그림 3C)을사용하여 다중 인쇄 시스템으로 코딩및 전송되었습니다.

저산소암온칩은 3D 세포 인쇄 기술을 사용하여 제조되었다. 고형암의 구조적, 생화학적 및 생체물리학적 이질성을 회수하기 위해, 산소가 시스템에 침투할 수 있는 유일한 방법인 암 구조 및 가스 투과성 장벽을 위해 단계적 제조 과정이 수립되었다(도4A). 구획화된 암-스트로마 동심고리 구조는 고형암(도4B)의해부학적 특징을 재현하기 위해 만들어졌다. 암 조직의 이질적인 기하학은 3D 세포 인쇄 기술을 사용하여 시험관 내에서 실현되었다. 세포 생존력은 제조 공정 중 화학적 및 기계적 응력을 확인하기 위해 인쇄 후 평가되었다. 녹색 염색 된 살아있는 세포의 비율은 적색 염색 죽은 세포의 비율보다 상당히 높았다. 정량적으로, 인쇄 후 셀 생존가능성은 96.92% ± 2.46%(그림4C)였다. 이 결과는 제조 조건이 암세포 및 기질 세포에 적정했다는 것을 확인합니다.

2개의 그룹은 암 진행에 저산소 그라데이션의 효과를 확인하기 위해 산소 그라데이션의 존재(GR+)및 부재(GR-)에 따라 비교하였다(도5A). 두 조건 모두에서, 성숙한 CD31+ 내피 세포는 3D 바이오 프린팅 기술을 사용하여 공간적으로 패턴된 살아있는 구조가 생산되었다는 것을 나타내는 주변 지역에 존재하였다. GR-조건에 비해,GR+상태는 HIF1α(도5B)의점진적발현을 나타내는 저산소그라데이션을 보였으며, 여기서 SHMT2+ 의사팔리세이딩 세포 및 SOX2+ 다능성 세포가 관찰되었으며, 이는 고형암의 공격적인 병리학적 특징을 나타냈다(도 5C). 즉, 교모세포종의 병리학적 특징은 설계된 저산소상태(15)하에다시 수피되었다.

Figure 1
그림 1: 저산소암 의 발달의 회로도- 온-칩. 이 수치는 자연 생물 의학 공학15 (저작권, 2019)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 저산소암온칩에 산소그라데이션 형성의 전산 시뮬레이션. (A)저산소암의 3D 기하학- 온-칩. (B)산소 분배 분석을 위한 영역을 나타내는 회로도. 이 수치는 자연 생물 의학 공학15 (저작권, 2019)에서 수정되었습니다. (C)산소 분포 프로파일의 제트 컬러 맵 이미지. 이 수치는 자연 생물 의학 공학15 (저작권, 2019)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 저산소암에 칩을 위한 3D 프린팅 경로 코드의 생성. (A)희생 PEVA 금형의 3D 기하학. (B)STL 파일 형식으로 희생 PEVA 금형의 이미지. (C)희생 PEVA 금형의 G 코드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 저산소암의 3D 세포 인쇄-온-어칩. (A)저산소암온칩의 제조 과정의 회로도. (B)인쇄된 저산소암-온-칩 및 구획화된 암-스트로마 동심고리의 구조; 스케일 바는 200 μm을 나타낸다.(C)생존가능성을 평가하기 위한 3D 세포 인쇄암 구조의 형광 영상; 스케일 바는 200 μm을 나타냅니다.

Figure 5
도 5: 저산소 그라데이션의 생성 및 설계 된 고형암의 병리학적 특징의 평가. (A)두 가지 다른 산소 투과성 조건 하에서 실험 군. (B)HIF1α를 이용한 산소 그라데이션 생성의 대표적인 면역염색 영상; 스케일 바는 SHMT2, SOX2 및 CD31을 사용하여 저산소암의 병리학적 특징을 나타내는 200 μm.(C)대표적인 면역염색 영상을 나타낸다. 스케일 바는 200 μm을 나타냅니다. 이 수치는 자연 생물 의학 공학15 (저작권, 2019)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 연구에서는 3D 세포 인쇄 기술을 기반으로 하는 저산소암 온어칩의 제조 과정을 설명합니다. 설계 된 칩의 저산소 그라데이션의 형성은 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 예측되었다. 이질저산소그라데이션을 유도할 수 있는 환경은 3D 프릭 가스 투과성 장벽과 유리 커버를 결합한 간단한 전략을 통해 재현되었다. 암 줄기 세포의 의사 팔래산염 및 작은 인구를 포함하여 교모 세포종의 저산소 관련 병리학적 특징은 칩의 저산소 그라데이션 조건하에서 다시 항복하였다.

생산성과 반복성을 향상시키기 위해 이전에 게시된모델(15)에비해 두 가지 주요 제작 단계가 순차적으로 수정되었습니다. 첫째, PDMS 장벽은 1단계 직접 인쇄 방법보다는 실시간으로 경화되는 경화를 포함하는 PDMS의 인쇄성이 떨어지는 것을 극복하기 위해 간접적으로 생성되었다. 따라서, 생체 적합성 PEVA는 더 높은 인쇄성을 갖는 희생 금형 및 PDMS를 제조하여 가스 투과성 장벽을 생성하도록 첨가되었다. 둘째, 슬라이드 유리의 종류는 생체 잉크 증착 및 모양 충실도를 지원하는 유리한 친성 코팅 슬라이드 유리로 변경되었습니다. 마지막으로, 칩 의 양끝에 중간 저수지를 구축하는 것이 가능했다 효율적인 중간 교환.

3D 바이오 프린팅을 통한 저산소암의 각 제조 단계에서 중요한 요소는 신중하게 제어되어야 합니다. 주조 하는 동안, PDMS의 높이 희생 PEVA 금형의 보다 큰 해야 한다, 그렇지 않으면 커버 유리로 조여 칩 느슨한 되 면, 저 산소 코어 생성에 부정적인 영향을 미칠. 콜라겐을 인쇄하는 동안, 열에 민감한 하이드로겔, 인쇄 헤드의 온도는 솔겔 전이 현상으로 인한 노즐 막힘을 방지하기 위해 15°C에서 유지되어야 한다. 하이드로겔이 일시적으로 교차 연결되면, 차단된 노즐은 높은 공압과 날카로운 바늘을 사용하여 쉽게 세척할 수 있다. 그러나 차단이 심한 경우 하이드로겔을 다시 준비해야 합니다. 또한 셀 실행 가능성을 고려하여 셀 인쇄 프로세스를 1 시간 이내에 완료해야 합니다.

3D 바이오프린팅 기술은 암의 근본적인 메커니즘을 연구하고 다양한 고형 종양의 치료 저항을 예측하는 데 사용될 수 있는 저산소암 온어칩의 엔지니어링을 용이하게한다(15). 특히 압출 기반 3D 바이오프린팅 기술을 사용하면 높은 수준의 자유로이 빠르고 반복적인 생산을 가능하게 했습니다. 더욱이, 암 모델링을 위한 재현성 및 빠른 시간 프레임은 제약 분야가 암 치료를 위한 약물 조합 후보자의 데이터 세트를 구축할 수 있게 한다. 그러나, 기술의 제한된 해상도로 인해, 인쇄 된 저산소 암 - 온 - 어 칩은 수백 마이크로미터의 범위에서 생산되어 많은 양의 물질을 필요로합니다. 또한, 공간구속(20)에따라 높은 처리량 약물 스크리닝 플랫폼을 개발하기는 어렵다. 따라서 제한된 자원과 공간 적 범위로 다중 매개 변수 연구를 지원할 수있는 모델을 개발하기 위해 기술을 개선해야합니다.

개발된 저산소암-온-칩은 세포외외매트릭스(ECM)로부터 유래된 하이드로겔과 같은 조직 특이적 물질을 채용함으로써 조직별 암 모델링에 적용될 수 있다. ECM의 생화학적 및 생리적 변이는 세포 기능에 영향을 미치기 때문에 장기 특이적 암 미세 환경을 가진 수많은 암 유형의 우수한 에뮬레이션을 실현할 수있다 21. 또한, 암 발달에 중대한 영향을 미치는 엔지니어링 혈관을 포함한 다른 엔지니어링 조직 구조와 결합하여 혈관 신생, 면역원성 및 전이성 특성의 동적 병원생리학적 변화를 연구할 수 있다. 더욱이, 개인화된 암 치료는 환자 유래세포(15)를채용함으로써 개발된 칩으로 달성될 수 있다. 임상 적 치료 전에 약물 감도를 테스트하는 것은 시간에 개별 환자에 대한 적절한 치료 요법을 찾는 과정에서 치료의 효능을 향상시키는 중요한 단계가 될 것이다. 환자 유래 소스를 가진 환자 특이적 암 모델은 각 환자의 병리생리학 및 화학반응성의 차이를 예측하기 위해 환자 프로파일링을 개선할 것으로 기대된다. 이전 연구에서는, 다양한 약물 조합에 대한 환자 특이적 치료 효과는 3D 프린팅 저산소암 온-칩을 사용하여 합리적인 기간(1-2주) 내에 예측되었으며, 이는 다른 방법에 비해 상대적으로 빠른 결론을 초래하여 환자 특이적 전임상모델(15)에대한 가능성을 시사한다.

요약하자면, 3D 세포 인쇄는 이질성 암 미세 환경을 재구성하는 데 유리하다. 모방된 미세 환경은 저산소증으로 인한 괴사 코어형성을 포함하여 암의 병리학적 진행을 유도합니다. 이 프로토콜은 항암제 검사 및 환자 별 암 모델에 적용될 수 있다. 이와 관련하여, 우리는 이 높게 통제할 수 있는 접근이 각종 암 모형을 건축을 위해 유익할 지도 모르다 기대합니다.

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Disclosures

저자는 공개가 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 교육부(2020R1A6A1A03047902호) 및 NRF-2018H1A2A1062091호와 한국정부(MSIT)가 지원하는 한국국가연구재단(NRF)의 지원을 받았다. NRF-2019R1C1C1009606 및 NRF-2019R1A3A3005437).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
Human umbilical vein endothelial cells Promocell C-12200
U-87 MG cells ATCC ATCC HTB-14
Disposable
0.2 μm syringe filter Sartorius 16534-K
10 mL disposable syringe Jung Rim 10ml 21G32
10 mL glass vial Hubena A0039
10 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91010
15 mL conical tube SPL lifescience 50015
18G plastic needle Musashi engineering PN-18G-B
20G plastic tapered dispense tip Musashi engineering TPND-20G-U
22x50 glass cover MARIENFIELD 0101142
25 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90125
3 mL disposable syringes HENKE-JET 4020-X00V0
40 µm cell strainer Falcon 352360
5 mL Serological pipette tip SPL lifescience 91005
50 mL conical tube SPL lifescience 50050
50 mL Serological pipette tip SPL lifescience 90150
50N precision nozzle Musashi engineering HN-0.5ND
Aluminum foil SINKWANG
Capillary tips Gilson CP1000
Cell-scrapper SPL lifescience 90030
Confocal dish SPL lifescience 200350
Parafilm Bemis PM996
Pre-coated histology slide MATSUNAMI MAS-11
Reservoir SPL lifescience 23050
T-75 cell culture flask SPL lifescience 70075
Equipment
3DX printer T&R Biofab
Autoclave JEIOTECH AC-12
Centrifuger Cyrozen 1580MGR
Confocal laser microscopy Olympus Life Science FV 1000
Fluorescence microscope FISHER SCEINTIFIC O221S366
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Hand tally counter KTRIO
Hemocytometer MARIENFIELD 0650030
Incubator Panasonic MCO-170AIC
Laminar flow cabinet DAECHUNG SCIENCE CB-BMMS C-001
Metal syringe IWASHITA engineering SUS BARREL 10CC
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Oven JEIOTECH OF-12, H070023
Positive displacement pipette GILSON NJ05652
Refrigerator SAMSUNG CRFD-1141
Voltex Mixer DAIHAN scientific VM-10
Water bath DAIHAN SCIENTIFIC WB-11
Water purifier WASSER LAB DI-GR
Materials
0.25 % Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
10x PBS Intron IBS-BP007a
4% Paraformaldehyde Biosesang
70% Ethanol Daejung 4018-4410
Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
Anti-HIF-1 alpha antibody Abcam ab16066
Anti-SHMT2/SHMT antibody Abcam ab88664
Anti-SOX2 antibody Abcam ab75485
Bovine Serum Albumin Thermo scientific J10857-22
Collagen from porcine skin Dalim tissen PC-001-1g
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermofisher D1306
Endothelial Cell Growth Medium-2 Promocell C22011
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Theromofisher A-11001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Theromofisher A-11012
High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) Hyclone SH30243-0
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 311413-100ML
Live/dead assay kit Invitrogen L3224
Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control Abcam ab170190
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Poly(ethylene-vinyl acetate)  Poly science 06108-500
Polydimethylsiloxane Dowhitech sylgard 184
Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control Abcam ab37415
Sodium hydroxide solution Samchun S0610
Triton X-100 Biosesang TRI020-500-50
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
Software
COMSOL Multiphysics 3.5a COMSOL AB
IMS beamer in-house software
SolidWorks Package Dassault Systems SolidWorks Corporation

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References

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