Summary
Aqui descrevemos o sistema RatWalker, construído redesenhando o aparelho MouseWalker para acomodar o aumento do tamanho e peso dos ratos. Este sistema usa reflexão interna total frustrada (FTIR), captura de vídeo de alta velocidade e software de análise de acesso aberto para rastrear e quantificar os parâmetros da marcha.
Abstract
A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo causado pela perda de neurônios dopaminérgicos (DA) na substância negra pars compacta. Anormalidades na marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos são comuns em pacientes com DP e aparecem no início do curso da doença. Assim, a quantificação de padrões motores em modelos animais de DP será importante para a caracterização fenotípica durante o curso da doença e no tratamento terapêutico. A maioria dos casos de DP é idiopática; no entanto, a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais. Enquanto os ratos são resistentes à neurodegeneração após a perda de Pink1 e Parkin (deleção única e combinada), em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e ao comprometimento motor. Aqui, relatamos a utilidade da imagem FTIR para descobrir alterações na marcha em ratos machos jovens (2 meses de idade) com perda combinada de Pink1 e Parkin antes do desenvolvimento de anormalidade motora visualmente aparente grosseira à medida que esses ratos envelhecem (observada aos 4-6 meses), caracterizada pelo arrasto dos membros posteriores, conforme relatado anteriormente em ratos Pink1 knockout (KO).
Introduction
A DP, o distúrbio do movimento neurodegenerativo relacionado à idade mais comum, é causada pela perda de neurônios DA na substância negra pars compacta. Essa perda de neurônios DA nigral e as entradas de DA no estriado levam aos comprometimentos da função motora observados em pacientes com DP 1,2. As características motoras definidoras de pacientes com DP, conhecidas coletivamente como parkinsonismo, incluem rigidez, tremor de repouso, bradicinesia, instabilidade postural e micrografia3. Além disso, os distúrbios da marcha, comuns em pacientes com DP, aparecem precocemente no curso da doença 1,4,5. Embora certos estilos de vida sejam sugeridos para ajudar a retardar a progressão da DP, como alimentação saudável e exercícios regulares, atualmente não há cura para a DP, apenas medicamentos para gerenciar os sintomas. Isso deixa espaço para a necessidade de uma investigação mais aprofundada na esperança de melhorar a terapêutica. Assim, a caracterização do padrão de marcha em modelos animais de DP é uma ferramenta crucial para caracterizar a relevância do modelo, bem como como os tratamentos terapêuticos voltados para o controle da DP estão prevenindo ou melhorando os comprometimentos motores.
Existem vários modelos animais de DP que têm sido utilizados para testar tratamentos terapêuticos, no entanto, cada um tem suas limitações. Por exemplo, modelos animais tratados com a neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) produziram uma grande riqueza de informações sobre processos importantes para a perda do neurônio DA nigral e subsequentes adaptações estriatais, e apontaram para o papel das mitocôndrias na patogênese da DP; no entanto, o contexto patogênico do modelo MPTP é de natureza tóxica e não neurodegenerativa, como na DP humana6. Modelos quimicamente induzíveis adicionais incluem 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e rotenona. A 6-OHDA foi o primeiro agente usado para induzir a DP pelo acúmulo seletivo da droga nos neurônios DA, o que eventualmente mata os neurônios e leva a sintomas semelhantes aos da DP. Este modelo foi usado pela primeira vez para o rastreamento da depleção de DA, examinando o comportamento em resposta à anfetamina e apomorfina7. Esse método de indução da DP tem se mostrado útil para o rastreamento de agentes farmacológicos que impactam a AD e seus receptores8. Embora o modelo 6-OHDA seja um ótimo modelo para rastrear déficits motores quantificáveis, esse modelo não mostra como a perda gradual de neurônios e a formação de corpos de Lewy afetam o animal. O outro método de indução, a rotenona, demonstrou ter degeneração progressiva dos neurônios nigrostriatais com a perda de tirosina hidroxilase e transportador DA, permitindo um melhor modelo para rastrear a perda de neurônios ao longo do tempo9. Os ratos tratados com rotenona apresentaram bradicinesia, instabilidade postural e marcha instável10. No entanto, esse método tem se mostrado amplamente variável entre diferentes cepas de ratos, o que tem provocado questionamentos se a rotenona é ou não um modelo confiável de DP11,12,13. Embora a análise da marcha tenha demonstrado ser impactada pela indução de DP em ratos, até o momento, os modelos de ratos com DP geneticamente induzidos não foram prontamente usados para análise de marcha andando livremente por uma pista.
Uma maneira de analisar o comprometimento motor em roedores que caminham livremente é a análise cinemática da marcha, que pode ser realizada utilizando imagens FTIR. Esse método estabelecido utiliza um sensor óptico de toque baseado em FTIR, que registra e rastreia as pegadas dos roedores à medida que eles se movem pela pista14,15,16. Em comparação com outros métodos, o FTIR não depende de nenhum marcador no corpo do animal que possa interferir nas impressões das patas. A geração dos dados de vídeo produz impressões digitais de todas as quatro partes que podem ser combinadas para criar um padrão de caminhada dinâmico e reprodutível para vários modelos de roedores. O princípio da análise de marcha baseada em imagens é pegar cada pata individual e medir a área de contato ao longo do tempo enquanto o roedor caminha pela pista. Cada postura é representada por um aumento na área da pata (na fase de frenagem) e uma diminuição na área da pata (na fase de propulsão). Isso é prosseguido pela fase de balanço, que é quando não há sinal de pata detectado. Após a avaliação do vídeo, são gerados vários parâmetros que podem ser usados para comparar o tipo selvagem (WT) versus o modelo PD. Alguns exemplos dos parâmetros são o comprimento do passo (distância que a pata cobre em um passo), a duração do balanço (duração do tempo em que a pata não está em contato com a pista), a velocidade do balanço (comprimento do passo em função da duração do balanço) e o padrão do passo (passos diagonais, degraus laterais ou passos de cinto).
Para demonstrar a utilidade do FTIR para descobrir mudanças precoces no padrão de marcha em ratos, usamos um modelo genético de DP em ratos. Enquanto a maioria dos casos de DP são idiopáticos; a identificação de formas hereditárias de DP revelou mutações e variantes genéticas, como mutações de perda de função em Pink1 e Parkin, duas proteínas envolvidas no controle de qualidade mitocondrial17, que poderiam ser aproveitadas para criar modelos animais18. Infelizmente, camundongos são resistentes à neurodegeneração após a perda dessas proteínas (únicas e combinadas)19,20,21. Em ratos, a deficiência de Pink1, mas não de Parkin, leva à perda do neurônio DA nigral e a deficiências motoras22, mas sem penetrância completa. Portanto, geramos um modelo combinado de ratos Pink1/Parkin double knockout (DKO), que exibe o fenótipo de arrasto do membro posterior visualmente aparente relatado em ratos machos Pink1 KO22, mas agora em uma taxa mais alta: 100% versus 30-50% dos machos entre 4-6 meses.
Embora esse método funcione bem para analisar déficits motores em camundongos14, as especificações do sistema de marcha de imagem FTIR para acomodar o tamanho e o peso dos ratos anteriormente não estavam disponíveis comercialmente. Aqui explicamos como construir o RatWalker, um sistema de imagem de marcha FTIR modificado modelado após o MouseWalker14, exceto adaptado para o tamanho e peso dos ratos. Este sistema utiliza um efeito óptico, FTIR, para fornecer um método para visualizar e, posteriormente, registrar pegadas de animais para análise. O contato do pé de um animal com o guia de ondas ópticas (plataforma) causa interrupção no caminho da luz, resultando em um efeito de dispersão visível, que é capturado usando videografia doméstica de alta velocidade e processamento usando software de código aberto. Este estudo demonstra o poder da imagem FTIR no estudo de alterações na marcha em modelos genéticos de DP em ratos. Por exemplo, enquanto alterações motoras visualmente aparentes evidentes (ou seja, arrasto dos membros posteriores) são observadas em ratos machos com DKO aos 4 meses no mínimo, usando FTIR somos capazes de descobrir anormalidades de porta em ratos machos DKO aos 2 meses de idade.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Nebraska (IACUC).
1. Aparelho de marcha
NOTA: Modelado a partir do MouseWalker14, o RatWalker foi projetado com dimensões proporcionais à diferença no comprimento do passo entre ratos e camundongos. Consiste em uma luz de fundo de iluminação lateral, gabinete de passarela, passarela de guia de onda óptica, espelho e câmera (Figura S1). Tiras de LED, orientadas em uma posição escalonada, foram usadas em cada lado da passarela e guias de onda de luz de fundo para acomodar o material extra. Os materiais necessários para a construção do aparelho de marcha modificado podem ser encontrados na Tabela S1.
- Use uma luz de fundo (Figura S2) para criar uma silhueta do animal que é utilizada pelo software para atribuir posição, direção de movimento e qualidades morfométricas. A construção é composta por um painel em camadas de um difusor de acrílico, guia de onda óptico, refletor e fitas de luz LED montadas dentro de uma estrutura de alumínio de estoque (Tabela S1).
- Use um compartimento de passarela (Figura S3) para guiar o animal ao longo da plataforma e direcioná-lo para a gaiola doméstica. A construção consiste em chapas de acrílico transparente soldadas com solvente com diclorometano (Tabela S2).
- Use a passarela (Figura S4) para fornecer o meio para gerar pegadas iluminadas. A passarela é construída em acrílico transparente, que é iluminado lateralmente com fitas de LED e alojado em ângulo de alumínio (Tabela S3).
- Coloque um espelho (Figura S5) diretamente sob a passarela em um ângulo de 45 graus para refletir a parte inferior da passarela para videografia. É construído a partir de um espelho de vidro de 1/4" de espessura suportado por acrílico e suportes angulados dispostos em uma linha (Tabela S4).
- Realize videografia usando uma câmera de ação de alta velocidade montada em tripé, de qualidade doméstica.
2. Configuração do equipamento
- Alinhe a luz de fundo, a passarela e o espelho de acordo com a Figura S1, em cima de uma bancada, bancada de trabalho ou carrinho estável. Certifique-se de que cada componente esteja centralizado em relação à passarela.
- Usando um nível, certifique-se de que os componentes são horizontalmente plumb.
- Coloque o recinto da passarela em cima da passarela.
- Limpe todas as áreas de superfície de contato com etanol a 70%. Certifique-se de usar uma toalha não abrasiva para evitar arranhões na passarela.
- Monte a câmera de alta velocidade em um tripé de 57 polegadas e coloque-a na linha média do espelho, espaçada o suficiente para capturar toda a passarela dentro do campo de visão. No menu de configurações de vídeo, verifique se a câmera de alta velocidade está configurada para aquisição linear no modo 1080p a 120 quadros por segundo (fps) com qualquer tipo de ajuste automático ou otimizações desativadas.
- Conecte e ligue as luzes da fita de LED para a luz de fundo e a passarela. Pode ser necessário escurecer a luz de fundo para reduzir a captura de fundo.
3. Aclimatação Animal
NOTA: Uma semana antes do primeiro experimento, execute os animais através do aparelho de marcha modificado.
- Posicione uma gaiola doméstica no terminal da passarela.
- Com o recinto instalado e as luzes apagadas, coloque o rato no final da passarela em frente à gaiola doméstica e permita que ele atravesse a passarela de maneira não forçada.
- Passe cada rato através do aparelho de marcha modificado várias vezes, até que eles possam atravessar suavemente toda a passarela.
- Repita o processo dois dias antes do experimento.
4. Procedimento de marcha
- Coloque uma gaiola caseira no final da passarela antes do início de cada corrida para servir como uma sugestão positiva para o rato atravessar a passarela.
- Desligue as luzes da sala, ligue a câmera e comece a gravar vários segundos antes que o rato seja colocado na plataforma.
NOTA: Certifique-se de usar um cartão de memória que é oficialmente recomendado pelo fabricante da câmera. Um cartão de memória não listado ainda pode funcionar, mas não é garantido para capturar na suposta taxa de quadros. - Com o recinto instalado, coloque o rato no final da passarela em frente à gaiola doméstica e permita que ele atravesse a passarela de maneira não forçada.
- Pare de registrar assim que o animal chegar ao término da passarela.
- Limpe a passarela usando etanol a 70% e uma toalha não abrasiva entre as corridas e depois que um animal urinar ou defecar, em seguida, permita que o etanol evapore antes de introduzir outro animal.
- Execute os ratos pela passarela um total de 7 vezes durante cada período de observação, tomando as três primeiras corridas que pontuam como passagem para análise.
- Marque uma corrida como passageira se o animal der quatro ou mais passos consecutivos na direção da gaiola doméstica sem interrupção devido a cuidados com a limpeza, pausa ou movimentos errantes.
NOTA: É uma boa prática registar a massa dos animais antes de cada ronda de medidas. Para o nosso estudo, WT (n = 7) e DKO (n = 8) pesaram 200,3 ± 21,67 g e 296,6 ± 3,85 g, respectivamente (p = 0,004, teste t não pareado com correção de Welch). Não vemos um problema com ratos de qualquer idade ou tamanho.
5. Pré-processamento de vídeo
NOTA: Os vídeos capturados pela câmera de alta velocidade são renderizados em formato mp4 a 120 fps e uma resolução de 1080p. Para aliviar a carga sobre o software analítico a jusante, primeiro corte imagens desnecessárias e retire o áudio de cada vídeo usando o software LosslessCut (versão 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut) e, em seguida, converta o fluxo de vídeo mp4 em uma sequência de imagens png usando o software de código aberto FFmpeg (versão 4.2, http://ffmpeg.org/). Nota: outros formatos sem perdas, como tiff, podem ser utilizados no lugar do png.
- Crie um diretório para os vídeos em um PC com o Windows 7 ou superior e, em seguida, transfira os vídeos do dispositivo de armazenamento da câmera de alta velocidade para o diretório recém-criado. Além disso, copie ffmpeg.exe para o mesmo local.
- No LosslessCut, arraste os vídeos para a interface para abrir. Descartar o áudio, definir os pontos de corte inicial e final para incluir apenas a parte analiticamente relevante do vídeo, definir o formato de quadro de captura como png e exportar. Depois que o vídeo for exportado, renomeie o arquivo de vídeo usando qualquer convenção de nomenclatura seguida por "_trimmed".
- Para converter em lote os vídeos em sequências de imagens, abra um prompt de comando, defina o diretório de trabalho para o local dos vídeos com "cd [caminho para o diretório]" e execute os seguintes comandos:
para %i em (*) do mkdir "%~ni_cropped"
para %i em (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
para /f "tokens=1 delims=." %a em ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - Após a conclusão do processo em lote, abra cada sequência de imagens no ImageJ Fiji23 e corte a sequência para a região de interesse (ROI), abrangendo a área do chão dentro da qual o rato é observado.
- Para reduzir o fundo da iluminação da passarela, aumente o equilíbrio de cores mínimo do canal ciano para 76.
- Salve como sequência de imagens e altere o sufixo "_trimmed" para "_cropped", salvando os arquivos em sua respectiva pasta "_cropped".
6. Processamento da marcha
NOTA: Os dados da marcha são processados e quantificados usando o software disponível gratuitamente, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- Descompacte e instale o software MouseWalker em um PC executando um ambiente Windows de 64 bits com o Microsoft Excel instalado.
- Depois de iniciar o MouseWalker.exe, execute uma calibração de escala inicial para cada conjunto de execuções. Carregue uma sequência de imagens e, usando pontos de referência ou uma régua capturada no vídeo, meça dois pontos de distância conhecida. Calcule o número de pixels por centímetro no quadro de vídeo e insira esse valor na seção de parâmetros do formulário de configurações, juntamente com a taxa de quadros de aquisição de vídeo.
- Da mesma forma, meça a cabeça, a cauda e os pés do rato para determinar o comprimento da cabeça, a largura e a área máximas da cauda, a área mínima e máxima do pé e outros recursos necessários para preencher a seção de parâmetros de rastreamento do formulário de configurações do MouseWalker. Consulte http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ para obter o manual do usuário e outra documentação.
- Para obter os valores de área corporal, abra a mesma sequência de imagens no ImageJ, desenhe uma seleção descrevendo o rato e execute uma contagem de pixels de região de interesse (ROI).
- Parâmetros e configurações usados para esta publicação (Figura S6).
NOTA: Os parâmetros são fornecidos para ilustração e dependem da escala do vídeo, do hardware de aquisição e das condições. A calibração e o ajuste do software são necessários sempre que a câmera ou o equipamento é reposicionado. A captura de um dispositivo de medição dentro da aquisição melhora a precisão e facilita a calibração. - Após a calibração, carregue cada sequência de imagens. A seleção automática iniciará a atribuição autônoma de pegadas.
- Percorra cada quadro da sequência, corrigindo manualmente as pegadas atribuídas por erros. Salve quando esta etapa for concluída.
- Por fim, selecione avaliar para processar a posição da pegada e os dados de pressão. Uma série de gráficos, imagens e uma planilha com métricas quantitativas de marcha serão exportadas para uma pasta de resultados.
7. Análise dos dados
- Use a planilha exportada no final de cada avaliação que contém dados quantitativos de marcha para cada execução. Concatenar os dados de cada corrida e a média por rato. Plote os dados médios e teste a significância usando o GraphPad Prism versão 7.0a.
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Representative Results
Manutenção da Colônia de Ratos
A geração e caracterização de ratos Pink1 e Parkin single KO já foram descritas anteriormente22. Os ratos Pink1 e Parkin single KO foram obtidos do SAGE Labs (e agora disponíveis no Envigo). Ratos DKO foram gerados pelo cruzamento de ratos Pink1-/- com ratos Parkin-/- para obtenção de ratos Pink1+/-/Parkin+/- que foram cruzados para obtenção de ratos Pink1-/-/Parkin-/- (estarão disponíveis no Envigo). Para confirmar a deleção de 26 pb em Park6 (gene que codifica Pink1), a genotipagem foi realizada utilizando os primers 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' forward e 5'-CCACCACCCACCACCACTTACT-3'. A deleção de 5 pb em Park2 (gene que codifica Parkin) foi testada após a amplificação do DNA usando um 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGTGA-3' e 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3' reverso. Amostras de Reação em Cadeia da Polimerase Amplificada (PCR) foram enviadas à ACGT Inc (Wheeling, IL) para sequenciamento (Figura S7). Todos os ratos foram mantidos no fundo Long Evans Hooded (LEH). Ratos DKO eram viáveis e férteis; no entanto, houve uma alta taxa de mortalidade entre as mulheres com DKO no momento do parto (aproximadamente 30%). Apenas ratos machos foram utilizados nesses experimentos. Os ratos foram mantidos em um ambiente com temperatura controlada, com um ciclo claro/escuro de 12 horas e livre acesso à ração e à água dos ratos.
Resultados
Para servir de exemplo da utilidade do sistema de análise de marcha FTIR para ratos, adaptado de14, realizamos análise de marcha em ratos machos WT e Pink1/Parkin DKO aos 2 meses de idade para determinar se o uso da análise cinemática da marcha poderia revelar deficiências motoras sutis não observadas com a percepção visual humana antes do aparecimento de problemas motores grossos a partir dos 4 meses de idade.
Semelhante a estudos anteriores de marcha em camundongos14, o sistema FTIR adaptado foi capaz de exibir o padrão de pegada criado pelo rato ambulante, bem como o caminho criado pelo centro do corpo (Figura 1A). Apesar do aumento do peso dos ratos DKO em relação ao WT (Figura 1B), a pressão do pé aplicada à superfície de caminhada (visualizada como mapas de calor), determinada pelas intensidades do sinal FTIR, não foi alterada (Figura 1C). Ao avaliar os diversos parâmetros da marcha em função da velocidade de caminhada (Figura 1D-H), observou-se que a velocidade de caminhada e o comprimento dos passos foram semelhantes entre os ratos WT e DKO (Figura 1D). No entanto, a variação entre ratos WT e DKO tornou-se aparente na fase de postura e duração do balanço em velocidades de caminhada mais lentas (Figura 1E, F). A fração do ciclo de passos em que a perna está na fase de postura (duração/período de postura) é o fator de trabalho, e esse parâmetro destaca mais tempo gasto na fase de balanço do que na fase de sustentação à medida que o fator de carga diminui, típico da corrida (Figura 1G). Novamente, as diferenças são destacadas em velocidades mais baixas. Além disso, enquanto as velocidades de oscilação aumentam com o aumento da velocidade em animais WT, a correlação é embotada em ratos DKO (Figura 1H).
A análise da marcha FTIR também permitiu gráficos de traços de fase de postura de cada perna em relação ao corpo em ratos que caminham livremente (Figura 2A, B). Os traços de postura são normalizados para o comprimento do corpo e são definidos como a posição do pé em relação ao centro do corpo desde o toque da pata (posição extrema anterior, PEP) até o final da fase de postura (posição extrema posterior, PEP). Ao comparar o posicionamento da pata, observamos alterações significativas no PEA (membro posterior esquerdo) e PEP (membro posterior direito), sugerindo que o membro posterior esquerdo está mais próximo do corpo durante o pouso da pata (PEP), enquanto o membro posterior direito está mais afastado do corpo durante a decolagem da pata (PEP) na DKO em comparação com os ratos WT (Figura 2C).
Vários parâmetros adicionais foram significativamente alterados nos ratos DKO em comparação com o WT. Em particular, mudanças nos padrões de balanço dos membros posteriores foram descobertas. A velocidade de balanço dos membros posteriores esquerdo e direito foi aumentada em ratos DKO em comparação com ratos WT (Figura 3A), enquanto a duração do balanço dos membros posteriores esquerdo e direito foi diminuída (Figura 3B). Vale ressaltar que o comprimento do passo não foi alterado (Figura 4).
Figura 1. Análise de padrões de pegada e parâmetros de etapa. Padrões representativos de pegada para ratos (A) WT e (B) DKO mostrando (painel superior) mapa de calor de pegada representando intensidade de pixel e linha horizontal representando o caminho do corpo, bem como (painel inferior) pés individuais rotulados com cores diferentes: frente esquerda (LF, amarelo), traseira esquerda (LH, azul), frente direita (RF, laranja) e traseira direita (RH, verde). (C) Velocidade média de caminhada para cada rato WT (n = 7) e DKO (n = 8). Média com MEV. Não significativa. (D-H) Parâmetros de passo em função da velocidade em ratos WT (n = 7) e DKO (n = 8). Linhas de regressão linear e valores quadrados R incluídos. (D) O comprimento do passo aumenta com a velocidade em ratos WT e DKO. (E) A duração do balanço é inversamente proporcional à velocidade em ratos WT, mas não em ratos DKO (não são significativos). (F) A duração da postura diminui com a velocidade em ratos WT e DKO. (G) O fator de imposto é inversamente proporcional à velocidade em ratos DKO, mas não em ratos WT (não são significativos). (H) A velocidade de balanço aumenta linearmente com a velocidade em ratos WT, mas não em ratos DKO (não são significativos). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Traçados de postura e análise de posicionamento de patas. (A) Análise representativa da pista de caminhada para um rato WT (antes e depois da correção de fundo) visualizada com nariz (sólido vermelho), contorno da cabeça (azul tracejado), contorno da cauda (verde tracejado), centro do corpo (branco tracejado) e pegadas (círculos: verde, RF e azul claro, LH). (B) Parcelas representativas de traços de postura para ratos WT e DKO que andam livremente. (C) O posicionamento da pata em ratos WT (n = 7) e DKO (n = 8) é mostrado. PEATE, posição extrema anterior; PEP, posição extrema posterior; L, esquerda; R, à direita; F, pata dianteira; H, pata traseira. Média com MEV. Significante em relação ao WT (p < 0,05*, 0,001***) utilizando ANOVA two-way e teste de comparação múltipla de Sidak. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Parâmetros de balanço da pata traseira alterados em ratos DKO. Medidas da pata dianteira e traseira da velocidade (A) em que as patas estão se movendo e as patas de tempo (B) são transportadas pelo ar em ratos WT (n = 7) e DKO (n = 8). L, esquerda; R, à direita; F, pata dianteira; H, pata traseira. Média com MEV. Significante em comparação com o WT (p < 0,01**) usando o teste t bicaudal não pareado de Student com correção de Welch. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Comprimento do passo inalterado em ratos DKO. Medidas da pata dianteira e traseira do comprimento do passo em ratos WT (n = 7) e DKO (n = 8). L, esquerda; R, à direita; F, pata dianteira; H, pata traseira. Média com MEV. Significativa em comparação com a WT (não significativa) usando o teste t bicaudal não pareado de Student com correção de Welch. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Distúrbios da marcha, incluindo diminuição do balanço do braço, velocidade de caminhada mais lenta e passos mais curtos, são uma característica definidora da DP e ocorrem precocemente durante o curso da doença 1,5. Vários métodos têm sido desenvolvidos ao longo dos anos para observar e registrar passos para análise de marcha em modelos de roedores de DP, com técnicas manuais para quantificar a posição do pisar levando a abordagens automatizadas mais sensíveis e capazes de capturar parâmetros dinâmicos. Algumas abordagens estáticas envolvem "tinta" nas patas do roedor com um indicador a ser rastreado em meios colocados em uma passarela24,25,26. Os passos residuais são posteriormente quantificados à mão. Esses métodos são frequentemente usados em conjunto com a gravação de vídeo para pontuação cinemática manual. Métodos autônomos de captura e quantificação de padrões de marcha foram introduzidos mais recentemente15,16, e estão disponíveis comercialmente. A quantificação autônoma da marcha adiciona atributos temporais a pegadas estáticas, permitindo que os pesquisadores procurem anormalidades atribuídas à velocidade e ao tempo, além da distância e do ângulo27. A pressão também é quantificável quando acoplada ao método FTIR.
Anormalidades do padrão de marcha também foram relatadas em modelos de DP induzidos por toxinas em ratos. Em particular, alterações na marcha têm sido relatadas no modelo de lesão de 6-OHDA utilizando uma plataforma comercial de análise da marcha28,29,30. A alteração mais proeminente neste modelo tem sido declínios na velocidade de caminhada e cadência. Além disso, a plataforma de análise comercial da marcha tem sido utilizada para avaliar uma série de parâmetros dinâmicos e estáticos da marcha de modelos de DP, como o impacto de lesões unilaterais induzidas por 6-OHDA e como o transplante de neurônios dopaminérgicos resgata as alterações da marcha31. Além disso, um estudo analisou a proporção de parâmetros de lesões de 6-OHDA em lados lesionados versus não lesionados do cérebro, enquanto corrigia a velocidade em parâmetros relacionados, como ciclo de passos de membros posteriores, área de impressão de membros posteriores e sequência de passos, todos os quais são significativamente alterados quando comparados diferentes tipos de lesões com controles salinos32 . No entanto, é importante notar que o fundo patogênico dos modelos induzidos por toxinas é de natureza tóxica e não neurodegenerativa, como na DPhumana 6, e, como tal, a avaliação da marcha após a indução da lesão pode imitar a DP avançada quando os neurônios são perdidos, mas dificulta os estudos sobre as alterações motoras precoces.
A geometria da marcha foi medida em ratos Pink1 KO, Parkin KO e DJ-1 KO22, modelos de DP hereditária, que exibem uma perda progressiva do neurônio dopaminérgico nigral com o envelhecimento. A marcha foi medida usando o aparelho comercial NeuroCube, onde os ratos podem andar em círculo, observando a geometria e as características dinâmicas. Os ratos Pink1 e DJ-1 KO apresentaram menor duração em passada, balanço e postura quando comparados ao WT aos 4 e 8 meses.
Como os sistemas comerciais de análise de marcha são caros e vêm com pipelines de análise proprietários, buscamos uma alternativa aberta para o nosso estudo de modelos hereditários de DP em ratos. O sistema MouseWalker14, que vem com instruções de construção e software de acesso aberto, captura todos os parâmetros de equipamentos comerciais projetados para pequenos roedores. Como a plataforma era muito pequena para alcançar consistentemente resultados transitáveis com ratos adultos, ou seja, quatro passos ininterruptos durante a locomoção em velocidade de caminhada, redimensionamos o hardware para acomodar ratos. Além disso, utilizamos uma câmera de ação doméstica no lugar de uma solução comercial de vídeo de alta velocidade.
A menor densidade de quadros era uma armadilha potencial de usar uma câmera de ação no lugar de uma câmera de alta velocidade. No entanto, o limiar de qualidade na videografia doméstica está aumentando rapidamente e é capaz de gravar a 120 fps em alta resolução. Além disso, a distorção da lente pode ser corrigida durante a gravação pelo software da câmera, produzindo um campo de visão consistentemente linear (FOV).
Inicialmente, estávamos preocupados com a dinâmica de pressão do uso de uma espessura semelhante de acrílico para a passarela com uma base mais larga e animais mais pesados, e a capacidade do software de processar vídeo de animais maiores em um FOV mais amplo. Especulamos que a faixa de massa entre camundongos e ratos está dentro da faixa de sensibilidade da plataforma FTIR acrílica, permitindo-nos medir ratos durante todo o seu ciclo de vida. Além disso, é possível que a diluição potencial de pixels possa ser compensada pela maior área de superfície das impressões das patas dos ratos em relação à área capturada no FOV, se houver alguma diferença significativa. Com a calibração adequada, conforme documentado aqui, o softwaredisponível gratuitamente 14 foi capaz de processar o vídeo da marcha de ratos conforme descrito.
Com este protocolo, pudemos demonstrar que o sistema de marcha de camundongo FTIR14 modificado aqui para ratos pode detectar alterações na marcha antes da observação visual do arrasto de membros posteriores em ratos machos com DKO. É importante ressaltar que o comprometimento motor visualmente aparente evidente (arrasto dos membros posteriores) observado em ratos DKO foi previamente relatado em ratos machos Pink1 single KO22. Enquanto ratos machos com DKO exibem arrastamento visualmente observável dos membros posteriores a partir dos 4-6 meses de idade, a análise da marcha descobriu mudanças de locomoção aos 2 meses de idade. Em particular, foram encontradas alterações nos parâmetros da marcha dos membros posteriores. Os ratos com DKO apresentam aumento da velocidade de balanço do membro posterior (esquerdo e direito) e uma diminuição associada na duração do balanço do membro posterior (esquerdo e direito). Além disso, os ratos DKO colocam sua pata traseira esquerda mais perto de seu corpo durante o pouso da pata, enquanto a pata traseira direita está mais longe de seu corpo durante a decolagem da pata. Embora não tenhamos descoberto mudanças na duração da passada ou da postura em ratos DKO aos 2 meses, a duração do balanço foi menor em ratos DKO, como é relatado de forma semelhante em ratos Pink1 e DJ-1 KO22. No geral, essas alterações sugerem que os parâmetros da marcha dos membros posteriores estão alterados antes do desenvolvimento do arrasto dos membros posteriores em ratos machos com DKO. Futuros estudos longitudinais da marcha que acompanham o desenvolvimento de alterações de locomoção ajudarão a identificar a idade em que as mudanças na marcha se tornam significativas.
Neste estudo, mostramos que um sistema de marcha de camundongo FTIR14 modificado aqui para o estudo de ratos pode ser usado para distinguir alterações nos parâmetros de marcha em ratos DKO machos de 2 meses de idade, um modelo para DP hereditária, em comparação com ratos WT pareados por idade. Estudos prévios em pacientes com DP revelaram redução do comprimento da passada e menor tempo médio de balanço, bem como aumento da variabilidade do tempo de passada e da variabilidade do tempo de balanço4. Assim, nossos achados de mudanças no tempo de balanço em ratos DKO e relatos prévios de alterações no tempo de balanço em ratos Pink1 KO e DJ-1 KO22 parecem relevantes para a progressão da DP.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
KS e HF agradecem à Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research pelo apoio ao seu trabalho sobre a doença de Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
||
| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al. Parkinson's disease. Annals of Indian Academy of Neurology. 14, Suppl 1 2-6 (2011).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Fahn, S. Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson's disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson's disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson's Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F. Experimental models of Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 2 (5), 325-334 (2001).
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson's disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson's disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson's Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
