Summary
Burada, fare arkalığındaki kan akışını ölçmek için Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme tekniğini ve gerekli kontrolleri gösteren bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kan akışı iyileşmesi deneysel hindlimb iskemi veya iskemi-reperfüzyondan sonra kritik bir sonuç ölçüsüdür. Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme (LDPI), kan akışı iyileşmesini değerlendirmek için yaygın, noninvaziv, tekrarlanabilir bir yöntemdir. Teknik, örneklenen dokudaki genel kan akışını, bir lazerin hareketli kırmızı kan hücrelerine çarpması sonucu ortaya çıkan frekanstaki Doppler kaymasından hesaplar. Ölçümler rastgele perfüzyon üniteleri ile ifade edilir, bu nedenle bacak üzerinde müdahale edilmeyen kontrallateral genellikle ölçümleri kontrol etmeye yardımcı olmak için kullanılır. Ölçüm derinliği 0,3-1 mm aralığındadır; hindlimb iskemi için bu, dermal perfüzyonin değerlendirildiği anlamına gelir. Dermal perfüzyon çeşitli faktörlere bağlıdır - en önemlisi cilt sıcaklığı ve anestezik ajan, güvenilir okumalarla sonuçlanacak şekilde dikkatlice kontrol edilmelidir. Ayrıca, saç ve cilt pigmentasyonu lazerin dermis'e ulaşma veya nüfuz etme yeteneğini değiştirebilir. Bu makalede, fare arkalığındaki LDPI tekniği göstermektedir.
Introduction
Yetersiz yara iyileşmesi ile cilt ülserasyon, insan hastalarda amputasyonların önde gelen bir nedenidir1. Yeterli yara iyileşmesi, periferik arteriyel hastalığı olan hastalarda tehlikeye giren sağlam cildi korumak için gerekenden daha yüksek arteriyel perfüzyon gerektirir2,3,4. Diğer birkaç romatolojik durum ve diyabet de yaraları iyileştirmek için rahatsız ve yetersiz cilt mikroserkülasyonuna yol açabilir5,6. Birçok diyabetik hastada eşlik eden periferik arteriyel hastalık vardır ve bu da onları özellikle amputasyon riskiyle karşı karşıya bırakarak. Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme (LDPI), klinik durumlarda cilt mikrosirkülasyonunu değerlendirmek için ve deneysel hindlimb iskemi, iskemi-reperfüzyon ve mikrocerrahi kapaklar7'densonra kan akışını ve kan akışı iyileşmesini değerlendirmek için araştırma durumlarında kullanılır.
LDPI sistemi, ilgi çekici bir bölge üzerinde hareket etmek için bir tarama aynası tarafından saptırılan düşük güçlü bir lazer ışını yansıtır. Bu, akış dektiyometrisiprobu 8ile doğrudan temas halinde olan küçük doku alanı için perfüzyon ölçümü sağlayan Lazer Doppler akış debimetrisinden farklıdır. Lazer ışını mikrovaskültürdeki hareketli kanla etkileşime girdiğinde, tarayıcı tarafından foto algılanan ve rastgele perfüzyon ünitelerine dönüştürülen bir Doppler frekans değişimine uğrar. LDPI ışık tabanlı bir teknik olduğundan, penetrasyon derinliği açısından 0,3-1 mm ile sınırlıdır, yani çoğunlukla dermal perfüzyon7. Dermal akış cilt sıcaklığı ve çeşitli anestezik ajanlardan etkilenebilecek sempatik sinir sistemi ile değiştirilebilir9. Optik lazerden yapılan ölçümler de ortam aydınlatma koşullarından, cilt pigmentasyonundan etkilenir ve aşırı kürk veya saç7ile engellenebilir.
LDPI, iskemi sonrası perfüzyon iyileşmesini izlemek için en sık kullanılan araştırma tekniğidir, çünkü invaziv değildir, kontrast yönetimi gerektirmez ve birden fazla hayvanda veri toplanmasına izin vermek için hızlı tarama sürelerine sahiptir. Bu, terapötik arteriogenez veya anjiogenez amaçlayan tedavilerin küçük hayvan modellerinde etkili olup olmadığını belirlemeye yardımcı olmak için idealdir. LDPI ile ölçülen hindlimb iskemi sonrası kan akışıiyileşmesi,Microfil döküm veya mikro-CT10, 11gibi diğer yollarla değerlendirildiğinde kollateral arter gelişimi ile iyiilişkilidir. Bu protokolün amacı, LDPI kullanılarak hindlimb perfüzyonunun değerlendirilmesini göstermektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokole göre gerçekleştirildi.
1. Tarayıcı hazırlığı
- Taranan nesneye olan mesafe yaklaşık 30 cm olacak şekilde tarayıcı yüksekliğini ayarlayın.
- Görüntüleyiciyi açın ve ilişkili yazılımı başlatın.
- Ölçüm programını açın. Yazılım tarayıcıyla doğru iletişim kuruyorsa, kızılötesi lazer açma uyarısı görünecektir.
- Makineyi üretici tarafından sağlanan standartlarla kalibre edin (videoda gösterilmez ve kullanılan belirli makine modeline bağlı olacaktır).
- Tarayıcı ayarlarını, odadaki arka plan malzemesi ve aydınlatma kurulumuna uygun olacak şekilde ayarlayın.
- Kazanç düzeylerini ayarlayın DC FLUX ve CONC, üreticinin talimatlarına göre (videoda gösterilmez).
- Lazer ışınını siyah arka plan malzemesine doğrultarak Arka Plan Eşiğini ayarlayın ve Otomatik BK Kümesi 'nebasın.
2. Fare ön tarama hazırlığı
- Atık gazın uygun şekilde atılması ile izofluran indüksiyon odasını kurun.
NOT: İndüksiyon odasını bir ısıtma yastığına yerleştirmek, anestezi indüksiyonu sırasında fare sıcaklık kaybını önlemeye yardımcı olacaktır. - Tarama alanına nonreflektif bir yüzeyin altına yerleştirilen homeotermik battaniyeyi açın (bu durumda siyah bir neopren kumaş). Homeotermik battaniyeyi 37 °C vücut sıcaklığını koruyacak şekilde ayarlayın.
- Homeotermik battaniye ve yağlayıcı için sıcaklık probunu yerleştirmeye hazır olacak şekilde konumlandırın.
- Anestezi maskesini ve çöp atma sistemini tarama alanına yerleştirin.
- Fareyi bir izofluran buharlaştırıcı ile uyuşturun. Oksijen oranını 1 L/dk akışa ayarlayın ve anestezi indüksiyonu için izoflurane%4 olarak ayarlayın. Anestezi indüksiyon odasına akışı açın ve fare solunum hızı yavaşlar. Fare sağ refleksini kaybettiğinde yeterli anestezi elde edilir.
- Fareyi ekli atık gaz leş yiyici ile anestezik bir maskeye / burun konisine aktarın ve izofluranları% 1,5'e ayarlayın.
NOT: Bu anestezi seviyesi genellikle tarama sırasında fareyi nispeten hareketsiz tutmak için yeterlidir, ancak cerrahi anestezi seviyeleri sağlamak için tasarlanmamıştır, bu nedenle anestezi derinliği kontrol edilir. İzofluran seviyesinin değiştirilmesi kalp atışı, solunum ve dermal perfüzyonda değişikliklere neden olur, bu nedenle herhangi bir zaman deneyi boyunca ve tüm deneysel denekler için tutarlı bir yüzde kullanılmalıdır. Ketamin ksilazinin IP enjeksiyonu gibi alternatif anestezi teknikleri de kullanılabilir, ancak farklı anestezikler dermal perfüzyonu farklı etkilediği için her zaman ders çalışması boyunca aynı anestezi tekniği kullanılmalıdır. - (Tarama alanına bağlı olarak isteğe bağlıdır) Taranması planlanan ilgi alanı kürkle kaplıysa, saçı ilgi çekici bölgeden çıkarmak için küçük bir elektrikli düzeltici veya tüy döken krem kullanın.
NOT: Depilatory krem tamamen çıkarılmalı ve fare derisi taramadan önce kurutulmalıdır. - Fareyi homeotermik battaniyeyi kaplayan siyah nonreflektif yüzeye uygun tarama konumuna getirin ve her iki arka ucun da denge ve tarama boyunca ısı kaynağında kaldığını onaylayın (Şekil 1).
NOT: Sıcaklıktaki bölgesel değişimi önlemek için her iki ayağın da homeotermik battaniye üzerinde tutulması önemlidir. - Homeotermik battaniye ile ilişkili yağlanmış rektal sıcaklık probsunu yerleştirin.
- Fare sıcaklığını istenen tarama sıcaklığına (37 °C) dengelayın; yaklaşık 5-10 dakika.
- Üst menüden veya tarayıcı kurulum simgesinden erişilebilen Tarayıcı Kurulumu'nu seçin. X-Y koordinatlarını ilgi çekici bölgeye uyacak şekilde değiştirerek tarama alanını ayarlayın. Tarama hızı tarama çözünürlüğüne bağlı olacaktır. Daha yüksek çözünürlük, daha uzun tarama süreleri sağlar. Anatomik perfüzyona odaklanan daha yüksek çözünürlüğün aksine, küresel perfüzyona odaklanan tekrar tarama için 4 ms/ piksel tarama hızı yeterlidir.
NOT: Araştırmacı gelişmekte olan kollateral dolaşımı doğrudan incelemeye çalışıyorsa (en iyi şekilde cilde daha yakın olduğu ventral uyluk ve baldırda en iyi şekilde görüntülenmiştir) daha yüksek çözünürlük ve tek tarama düşünülmelidir. Fare ayak takımının uç organına küresel perfüzyonu değerlendirirken daha düşük çözünürlükte/hızda (örneğin, 4 ms/piksel) tekrarlanan tarama yeterlidir. Videoda gösterilen yazılım, yeniden başlatıldığında tarama alanı, hız ve çözünürlük için daha önce kullanılan şablonu otomatik olarak yükler veya çeşitli denemeler için farklı ilgi alanları kullanılıyorsa depolanan bir dosyadan alınabilir. - Yineleme taramaları yapıyorsanız, Yineleme ve Satır Taraması sekmesini seçin. Tarama sayısı (bu durumda 3 tarama) ve yineleme aralığı değiştirilebilir. Yineleme aralığı için en az süre, tarama alanı ve tarama çözünürlüğü ile belirlenen kutunun sağındaki gri alan içinde gösterilen tahmini tarama süresi olacaktır. Birkaç saniye eklemek, kullanıcının taramalar arasında gerekirse fareyi duraklatmasını ve yeniden konumlandırmasını sağlar.
3. Tarama
- Görüntü Taraması sekmesini seçin ve İşaretle düğmesini seçin. Lazer tarama alanının ana hatlarını belirlemek için hareket edecek. Taranacak hedef işaretli alan içinde olacak şekilde fare konumunu ayarlayın.
NOT: Ayak takımı veya ayak takımı ve baldır taraması için, uzatılmış arkalıklarla eğilimli konumlandırma, supine konumlandırmaya göre daha tutarlı bir ilgi alanı sağlar. Uyluk atardamarı ve saphenöz arter ve kollateraller uyluk ve baldırın ventral yüzeyine çok yakındır, bu nedenle bu ilgi alanları kullanılarak supine konumlandırma tercih edilir. - Taramayı Yinele simgesini seçerek tekrarlanan ölçümü başlatın ve taramayı başlatmak için Oynat Düğmesine basın.
- Açılır pencerede tarama mesafesini onaylayın ve taramaya başlamak için Tamam'ı tıklatın.
- Fare hareketini tarama sırasında fareyi izleyin; fare, arka ayakların artık taramanın ortasındaki tarama bölgesinde olmayacak kadar hareket ederse, taramayı yeniden başlatın. Fare engel teşkil eden konumdaki küçük varyasyonlar analiz yazılımında bulunabilir.
- Homeotermik battaniyenin kullanımıyla bile dalgalaşabileceğinden, tarama işlemi sırasında fare sıcaklığını izleyin. Fare sıcaklığında çok fazla değişiklik varsa, bu taramalar arasında önemli bir değişime neden olabilir. Genellikle, 36.8-37.2 ° C sıcaklık aralığı kabul edilebilir verilerle sonuçlanacaktır.
- Yakalanan taramayı, daha kolay veri çözümlemesi için fare tanımlayıcısı ve zaman noktası içeren bir dosya adıyla Farklı Kaydet penceresinin altına kaydedin. Konu ayrıntıları penceresinde istenirse fare ve zaman noktası ayrıntılarını girin.
- Izoflurane'yi kapatın ve rektal sıcaklık probunu çıkarın.
- Rektal sıcaklık probını% 70 etanol ile dezenfekte edin, böylece bir sonraki farede kullanıma hazırdır.
- Farenin anesteziden kafese dönmeden önce supine konumundan eğilimli konuma dönerek sağa doğru refleks gösterdiği noktaya kadar iyileşmesine izin verin.
NOT: İyileşme çok hızlı olduğundan, iyileşme izofluran için bir ısıtma battaniyesi üzerinde veya ketamin / kslazin için ısıtılmış bir iyileşme kafesinde gerçekleştirilebilir.
4. LDPI verilerinin yakalanması (Şekil 3)
- Görüntüleme gözden geçirme yazılım programını açın.
- Dosya menüsüne gidin, dosyayı açın ve kaydedilen dosyayı bulun.
- Araç çubuğundan yatırım getirisi simgesini seçin.
- Çokgen Ekle düğmesini seçin.
- Fareyi kullanarak denetim arka ayakları için ilgi çekici bölgeyi (ROI) izleme. Gri arka plan hesaplanan ortalamalara dahil edilmeyeceğinden çokgen izlemenin tam olması gerekmez.
- Cerrahi hindlimb için 4.3-4.5 adımlarını tekrarlayın.
- Görüntü ROIs İstatistik Sonuçları (PU) penceresini açmak için İstatistikler simgesini seçin.
- Polygon 1 (control hindlimb) ve Polygon 2 (cerrahi hindlimb) sonuçlarını kopyala/yapıştır yoluyla veri toplama çalışma sayfasına dışa aktar.
5. Analiz
- Her tarama için verileri Cerrahi/Kontrol oranı olarak yakalayın.
- Bu zaman noktasında belirli bir farenin veri noktası için üç tarama için de ortalama cerrahi/kontrol kullanın. Hindlimb iskemisine yanıtta biyolojik değişkenlik nedeniyle, genel olarak ~ % 10 standart hata ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için zaman noktası başına 8-10 fare gereklidir.
NOT: Farenin anesteziden iyileşmesine izin vermeden önce, verilerin çok değişken olup olmadığını kontrol etmek için tekrarlanan taramaların hızlı bir analizini yapmak faydalı olacaktır (örneğin, taramalar 1-3 arasında farklı 100-150'den fazla perfüzyon ünitesi). Tekrarlanan taramalar arasındaki yüksek değişim, farenin tarama sırasında tamamen dengelenmediğini göstermektedir (Şekil 2) ve görüntüler daha sonraki bir tarihe kadar analiz edilmezse ortaya çıkabilecek bir veri noktasını kaybetmeden tekrarlanan bir tarama yapılabilir. Görüntülenen akı değerlerinin dinamik aralığını en iyi duruma getirmek için renk paletini değiştirmek, tarama varyasyonlarını daha iyi görüntülemek için gerekli olabilir (Şekil 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı LDPI, üç tarama arasında en fazla 100-150 perfüzyon ünitesi varyasyonu (fare ayak takımı için normal ortalama perfüzyonun yaklaşık% 10'una karşılık gelir) ile tutarlı tekrarlanan önlem taramalarına neden olmalıdır (Şekil 2). Şekil 2'degösterildiği gibi, tekrarlanan taramalar farenin uygun şekilde dengelendiğini belirlemeye yardımcı olur, böylece iskemik/kontrol oranı, sıcaklık değişiminin neden olduğu dermal perfüzyondaki varyasyonun aksine alttaki kan akışını en iyi şekilde yansıtır. Veri noktaları için tek taramalar kullanmak, daha deneysel farelere ihtiyaç duyan değişkenliği artıracaktır. Hindlimb iskemi için kullanıldığında, cerrahi hindlimb kontrol hindlimb ile karşılaştırıldığında küresel perfüzyonu azaltmış olmalıdır. Sonuçlar cerrahi hindlimb perfüzyon/kontrol hindlimb perfüzyon oranı olarak ifade edilir. Fareler başlangıçta içsel kollateral ağlarını zamanla vazodile edip geliştirdikleri için, LDPI tarafından kan akışı iyileşmesi ameliyat sonrası bir zaman seyrinde görülmelidir(Şekil 4). İyileşme derecesi, fare zorlanmasına ve hindlimb iskemi modelinin şiddetine bağlıdır.
Şekil 1. Ventral ayak altlıklarının lazer Doppler perfüzyon görüntülemesi için fare konumlandırması. İzofluran burun konisi (A) kullanılarak uyuşturulmuş fare, ventral ayak takımlarının taranmasını sağlamak için uzatılmış arka ayakları ile eğilimli konuma yerleştirilir. Tarama sırasında tutarlı vücut sıcaklığını korumak için homeotermik battaniye için rektal sıcaklık probu (P) yerindedir. Homeotermik battaniye pedi, tarama için arka plan sağlamak için kullanılan nonreflektif neopren malzemenin altındadır. Tarama bölgesinin ortasını gösteren lazer farenin kuyruğunun yanında görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Renk paleti ayarı ile daha iyi görülen fare sıcaklık değişiminden tarama varyasyonunun gösterimi. (A) Lazer Doppler, tekrarlanan akı taramalarında renge çevrilen perfüzyon ünitelerine göre görülebilen tekrarlanan taramalar sırasında fare çekirdeği sıcaklık değişiminin neden olduğu önemli varyasyonlarla tekrarlanan taramalar. (B) Renk paleti üzerindeki dinamik aralığın (tarama penceresinin solunda gösterilen) A'da 0-1000'den B'de 0-1500'e (kırmızı ok) değiştirilmesi varyasyonu daha belirgin hale getirir. (C) Kontrol hindlimb için ilgi alanı için ortalama perfüzyon değerlerini gösteren istatistikler (A ve B'dekirfx görüntüsünde siyahta çokgen 1) 1st tarama için 655 ile 3rd taramada 791 arasında değişir ve ortalama perfüzyon iskemik hindlimb için ilgi alanı (A ve B'dekirfx görüntüsünde kırmızı renkte Çokgen 2), daha az varyasyon gösterdi (361 ila 400), tekrarlanan taramalar arasındaki iskemik/ kontrol oranında önemli farklılıklara yol açtı (0.60, 0.53, ve 0.46). (D) Ölçüm yazılımındaki (sol panel) ve görüntü inceleme yazılımındaki (sağ panel) renk paletinin dinamik aralığını değiştirmek için pencere. Kırmızı oklar, üst aralığın nerede artırılalır veya azaltacağı gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Tekrarlanan taramalarla lazer Doppler perfüzyon görüntüleme için veri yakalama. (A) 1 ile üst araç çubuğu. Yatırım getirisi simgesi ekleyin. 2. Çokgen simgesi ekleyin. 3. Konu ayrıntıları simgesi (B'depencere açılır penceresine erişiyor). 4. İstatistik simgesi (C'depencere açılır penceresine erişiyor). (B) Konu ayrıntıları penceresi. (C) Her yatırım getirisi için ortalama perfüzyon değerlerini (kırmızı daire içine alınmış) gösteren istatistik penceresi. (D) Kontrol hindpaw (siyah) ve iskemik hindpaw (kırmızı) etrafında izlenen çokgen ROI ile tekrarlanan tarama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. LDPI verileriyle zaman kursu denemesi. P27 nakavt fareleri (3-5 aylık dişi CDKN1b-/- C57Bl/6 arka plan üzerinde fareler) femoral arter ligasyonundan sonra (n=6) ve (n=10) oral olmadan (n=11) ve (n=9) oral doksiksin tedavisi olmayan (yazardan yayınlanmamış veriler) yaşla eşleşen dişi wildtype C57Bl/6 farelere kıyasla doksiksin tedavisi. Hata çubukları ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LDPI ile güvenilir sonuçlar elde etmek için tutarlı teknik kritik öneme sahiptir. Tüm zaman dilimi boyunca aynı anestezi, sıcaklık ayarları, fare konumu ve ilgi alanı kullanılmalıdır. Farklı anestezik ajanlar daha yüksek veya daha düşük perfüzyon değerlerine neden olur9. Isofluran anestezisi, hızlı başlaması ve ortaya çıkmasının yanı sıra genel güvenliği nedeniyle uygundur. Bu vazodilatör ajan ile anestezi derinliği olarak tutarlı bir izofluran yüzdesi deri perfüzyonunu değiştirebilir. İlgi çekici bölge kürk içeriyorsa, kimyasal olarak aldatılmış fareler, kürkü elektrikli makaslarla çıkarılan farelerden daha yüksek perfüzyon değerlerine sahip olacağından, her seferinde aynı epilasyon yöntemi kullanılmalıdır7. Fare sıcaklığı perfüzyon görüntüleme üzerinde büyük bir etkiye sahiptir, 36 °C'deki fareler 38 °C7,12'dekifarelerden önemli ölçüde daha düşük perfüzyondeğerlerinesahiptir. İskemik hindlimb ayrıca bölgesel sıcaklık değişimine kontrol hindlimb'inden farklı tepki verebilir (Şekil 2). Bu protokolde, tarama sırasında fare sıcaklığını korumak için bir homeotermik battaniye kullanılır, bu da tarama işlemi sırasında fareyi 37 °C ısınma plakasında beş dakika boyunca önceden dengelemekten ve niiyama veark.
Sadece ayak takımları ilgi alanı olarak seçilirse, taranan ilgi alanında tekrarlanabilirlik nedeniyle eğilimli konumlandırma tercih edilir. Bu yaklaşımın avantajı, kalpten en uzak bölgeyi ve iskemik ayak ülserlerinin yaygın olduğu yere karşılık gelen klinik olarak en alakalı alanı çalışmasıdır. Ayak takımları tüysüzdür, bu nedenle kırpma veya epilasyon gerekli değildir, bu da ölçüm için hazırlığı ve zamanı basitleştirir. Ayrıca, beyaz olmayan farelerin baldır veya uyluk derisinde LDPI ölçümünü etkileyebilecek pigmentasyon lekeleri olabilir. Seçilen ilgi alanı baldır ve uyluğu içeriyorsa, supine konumlandırması tercih edilir, çünkü femoral ve saphenöz arter arkadaki ventral yüzey boyunca çalışır ve LDPI7kullanılarak görüntülenebilir. Supine konumundan, ayağın tutarlı görüntülemesini yakalamak zordur, çünkü yan ve üst yüzeyler değişken bir şekilde görüntülenebilir.
Hindlimb iskemi sonrası kollateralizasyon ve kan akışı iyileşmesi hindlimb iskemi modeli, fare zorlanması, cinsiyet ve yaş gibi bir dizi farklı faktöre bağlıdır. C57Bl/6 gibi bazı fare suşları sağlam taban çizgisi teminatlarına sahiptir, akut hindlimb iskemi indüksiyonundan sonra perfüzyonda daha az dramatik bir düşüş vardır, BALB / c gibi diğerleri ise zayıf teminatlara sahiptir14,15. Dişi fareler erkek farelerden daha kötü iyileşmeye sahiptir. Yaşlı fareler de genç farelerden daha kötü kan akışı iyileşmesine sahiptir16. Bu nedenle, LDPI verileri kullanılarak kan akışı iyileşmesi ile ilgili güvenilir sonuçların ortaya çıkarılması için farelerin zorlanma, yaş ve cinsiyetle eşleştirilmiş olması gerekir. Titiz eşleştirme ve farelerin inbred suşları kullanılsa bile, farenin iskemiyi engellemesine verdiği tepkide belirli miktarda biyolojik değişkenlik vardır, bu nedenle geçerli veriler için yeterli fare sayıları (genellikle zaman noktası başına 8-10 fare) gereklidir. Ayrıca, LDPI'nın normalleşmesi, herhangi bir iskelet kası talebi olmayan uyuşturulmış farelerde ölçüm yapıldığı için normal arteriyel akış seviyelerinin restorasyonu anlamına gelmez. Son olarak, penetrasyon derinliğindeki sınırlamalar nedeniyle, uyluk ve baldırın daha derin kas yapısından geçebilecek kollateral yolların ayrıntılı anatomik çalışmaları LDPI ile mümkün değildir.
Lazer benek görüntüleme17, 18, 19veya iskelet kası20,MRI 21 ve(13)N-amonyak PET22 kontrastla geliştirilmiş ultrason gibi daha derin yapılar gibi cildin perfüzyon bazlı görüntüleme dahil olmak üzere kan akışı kurtarma değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Ayrıca mikro-CT10, OCT23gibi kollateral damarların anatomik bazlı görüntülenmesi ve intravital mikroskopi ile kontrastla geliştirilmiş ultrason24. Hızlı tarama süresi, göreceli veri yakalama ve analiz kolaylığı ve intravenöz kontrast ihtiyacından kaçınma nedeniyle LDPI, literatürdeki çoğu grup tarafından kullanılan baskın yöntemdir. Zayıflıklar, tekniğin kan akışı hızlarını ölçmesi ve mutlak doku perfüzyonunu ölçmek yerine rastgele perfüzyon ünitelerinde veri sağlaması, tarama derinliğinin nispeten sığ olması ve nispeten zayıf anatomik ayrıntı sağlamasıdır.
LDPI en yaygın olarak çeşitli hindlimb iskemi modellerinin7'densonra iyileşmeyi değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca hem hindlimb25'te hem de daha derin splanchnic organlarda veya omurilik26, 27,28'deiskemi-reperfüzyon araştırmalarında kullanılmıştır. Bununla birlikte, derin yapıların değerlendirilmesi, yapının cerrahi olarak maruz kalmasının taranmasını gerektirir ve bu da skar nedeniyle tekrarlanan ölçümleri daha zor hale getirir. Bir diğer uygulama mikrocerrahi sonrası flap reperfüzyonunun değerlendirilmesi29.
Sonuç olarak LDPI, genel arteriyel perfüzyonun bir yansıması olarak hindlimb dermal perfüzyonu ölçmek için etkili, kolay gerçekleştirilen ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Güvenilir veri elde etmek için LDPI kullanırken tutarlı teknik gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Tang'ın açıklayacak bir çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma VA Puget Ses Sağlık Merkezi'ndeki tesis ve kaynakların kullanımı ile gerçekleştirilmiştir. Çalışma yazarın eseridir ve Gazi İşleri Bakanlığı'nın veya Abd hükümetinin konumunu veya politikasını yansıtmak zorunda değildir. Dr Tang şu anda VA (Merit 5 I01 BX004975-02) aracılığıyla finanse ediliyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black nonreflective material | Fabric store, black neoprene recommended by company | ||
| F/air cannister | A.M. Bickford Inc | 80120 | |
| Homeothermic blanket with rigid metal probe | Harvard Apparatus | Also comes with flexible probe, but this is less durable | |
| Isoflurane Anesthesia machine | Drager | Multiple manufacturers | |
| Isoflurane induction chamber | VetEquip | 941444 | 2 L chamber |
| Moor laser Doppler perfusion imager | Moor Instruments | MoorLDI2-IR | Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR) |
| Mouse Anesthesia nose cone | Multiple manufacturers | ||
| Nair | Nair | ||
| Oxygen tank | Multiple manufacturers | ||
| Surgilube | Multiple distributors |
References
- Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
- Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
- Abularrage, C. J., et al. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).
- Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).
- Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases. Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).
- Sonmez, T. T., et al. A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research. PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice. BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).
- Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).
- McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Chalothorn, D., Faber, J. E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).
- Helisch, A., et al. Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).
- Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).
- Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue. Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).
- Briers, J. D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).
- Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).
- Nguyen, T., Davidson, B. P. Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle. Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).
- Zaccagnini, G., et al. Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia. PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).
- Penuelas, I., et al. PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).
- Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).
- Turaihi, A. H., et al. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).
- Liu, C., et al. Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).
- Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).
- Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
- Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging. Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).
- Fitzal, F., et al. Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).
