Summary
Qui, descriviamo un modello di xenotrapianto murino che assomiglia funzionalmente a un serbatoio di Ommaya nei pazienti. Abbiamo sviluppato il Murine Ommaya per studiare nuove terapie per la malattia leptomeningea universalmente fatale.
Abstract
La malattia leptomeningea (LMD) è un tipo raro di metastasi del sistema nervoso centrale (SNC) al liquido spinale cerebrale (CSF). I tumori più comuni che causano LMD sono i tumori al seno e ai polmoni e il melanoma. I pazienti con diagnosi di LMD hanno una prognosi molto sfavorevole e generalmente sopravvivono solo per poche settimane o mesi. Una possibile ragione per la mancanza di efficacia della terapia sistemica contro LMD è l'incapacità di raggiungere concentrazioni terapeuticamente efficaci di farmaco nel CSF a causa di una barriera emato-encefalica (BBB) intatta e relativamente impermeabile o barriera emato-CSF attraverso il plesso coroideo. Pertanto, la somministrazione diretta di farmaci per via intratecale o intraventricolare può superare queste barriere. Questo gruppo ha sviluppato un modello che consente l'efficace somministrazione di terapie (cioè farmaci, anticorpi e terapie cellulari) cronicamente e il campionamento ripetuto del CSF per determinare le concentrazioni di farmaci e la modulazione del bersaglio nel CSF (quando il microambiente tumorale è mirato nei topi). Il modello è l'equivalente murino di un serbatoio Ommaya compatibile con la risonanza magnetica, che viene utilizzato clinicamente. Questo modello, che è apposto sul cranio, è stato designato come "Murine Ommaya". Come prova terapeutica del concetto, gli anticorpi del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (clone 7.16.4) sono stati consegnati nel CSF tramite murino Ommaya per trattare topi con LMD dal carcinoma mammario 2-positivo del recettore del fattore di crescita epidermico umano. Il Murine Ommaya aumenta l'efficienza della somministrazione di farmaci utilizzando una porta di accesso in miniatura e previene lo spreco di droga in eccesso; non interferisce con il campionamento del CSF per studi molecolari e immunologici. Il Murine Ommaya è utile per testare nuove terapie in modelli sperimentali di LMD.
Introduction
La malattia leptomeningea (LMD) è una metastasi aggressiva in fase avanzata del SNC, in cui le cellule tumorali accedono al CSF e si infiltrano nella superficie del cervello e del midollo spinale1. I tumori più comuni che causano LMD includono quelli del seno e del polmone e il melanoma2. LMD provoca una serie di sintomi e segni neurologici come mal di testa, paralisi del nervo cranico, torcicollo e radicolopatie. La prognosi per i pazienti con LMD è generalmente molto sfavorevole (la sopravvivenza media è misurata in settimane) ed è universalmente fatale3,4,5,6,7. Il trattamento con chirurgia, radiazioni e chemioterapia sistemica è palliativo. La terapia sistemica per LMD può fallire a causa di una penetrazione inadeguata del farmaco nel CSF attraverso una barriera BBB o Emato-CSF intatta attraverso il plesso coroideo1.
Pertanto, la somministrazione di terapie antitumorali (ad esempio, farmaci e trattamenti a base di anticorpi, inclusi inibitori del checkpoint e terapie cellulari) direttamente nel CSF può superare questa limitazione8. L'accesso e il campionamento del liquido cerebrospinale dai pazienti è possibile attraverso un serbatoio Ommaya che viene impiantato sotto il cuoio capelluto. Questo dispositivo consente la somministrazione di agenti cancerogeni (ad esempio, metotrexato e trastuzumab) e il campionamento del CSF per studi diagnostici (ad esempio, la diagnosi citologica di LMD per monitorare le risposte al trattamento) senza eseguire un rubinetto spinale. Un serbatoio murino di Ommaya è stato progettato per imitare quelli usati clinicamente. Il serbatoio richiede l'assemblaggio di una porta di accesso e di parti distanziali e una modifica della tecnica di cannulazione del mouse, che consente al dispositivo di rimanere permanentemente intatto per tutta la durata dello studio del farmaco. Questo dispositivo è stato designato come "Murine Ommaya".
A differenza della tecnica della pompa per infusione osmotica, che richiede la preparazione di volumi liquidi in eccesso per preriempire lo spazio vuoto nel tubo e l'infusione continua su iniezioni frequenti9, il Murine Ommaya riduce al minimo lo spreco di soluzioni farmacologiche. Consente la somministrazione efficace di più dosi singole di trattamenti in qualsiasi momento in piccole quantità (3-7 μL) nel CSF utilizzando una siringa Hamilton, una porta di accesso in miniatura e un iniettore automatico. In tempo reale, l'efficacia dei farmaci di prova contro LMD può essere determinata dall'imaging. Utilizzando questo approccio, una varietà di chemioterapie, anticorpi e immunoterapie cellulari (come agenti singoli o combinati) possono essere testati contro LMD per tradurre i risultati in vivo in strategie di trattamento razionali per i pazienti. Per migliorare ulteriormente la capacità di imaging per un modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) di LMD, è stata intrapresa una collaborazione con un produttore per sviluppare una versione compatibile con la risonanza magnetica (MRI) di Murine Ommaya, che non richiede assemblaggio ed è pronta per l'uso. La capacità di risonanza magnetica è vantaggiosa, specialmente per i modelli PDX in cui la quantità di cellule tumorali circolanti (CTC) dal CSF è talvolta il fattore limitante, e spesso quando la preetichettatura delle CTC è impossibile.
Questo documento descrive un protocollo dettagliato che inizia con l'iniezione di CTC per rendere i topi con LMD . Il Murine Ommaya viene quindi impiantato chirurgicamente e vengono eseguite più fasi di trattamento farmacologico tramite murine Ommaya. Come prova di concetto per la dimostrazione, è stato eseguito un confronto in vivo side-by-side, in cui è stato consegnato l'anticorpo murino del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (Her2) chiamato clone 7.16.4 (l'equivalente umano di trastuzumab)10. L'anticorpo prende di mira le cellule del cancro al seno Her2+ tramite Murine Ommaya (terapia diretta o intratecale) o mediante iniezione intraperitoneale (terapia sistemica). I risultati hanno mostrato che i topi con LMD che hanno ricevuto l'immunoterapia intratecale diretta hanno vissuto significativamente più a lungo di quelli trattati con la stessa terapia per via sistemica. Le metastasi del SNC nei topi trattati tramite Murine Ommaya sono state quasi completamente regredite dalla terza dose della terza settimana di trattamento, con conseguente miglioramento della sopravvivenza globale.
Protocol
Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della University of South Florida (IS00005974).
1. Iniezione di CTC in CSF per generare un modello LMD murino
- Preparazione dei CTC
- Calcolare il numero di CTC necessari per l'iniezione e preparare una sospensione unicellulare a 1,0 ×10 4 cellule / μL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Posizionare la sospensione cellulare su ghiaccio o a 4 °C durante tutta la procedura.
NOTA: quando si utilizzano linee cellulari che richiedono tripsinizzazione, assicurarsi di lavare le cellule due volte con PBS sterile per rimuovere la tripsina. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Se viene utilizzata una coorte di grandi dimensioni (>50 topi), riconteggi le cellule e convalida la vitalità cellulare tra le iniezioni per garantire che venga somministrato un numero coerente di cellule per topo.
- Calcolare il numero di CTC necessari per l'iniezione e preparare una sospensione unicellulare a 1,0 ×10 4 cellule / μL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Posizionare la sospensione cellulare su ghiaccio o a 4 °C durante tutta la procedura.
- Procedura prechirurgica
- Inietti il topo per via sottocutanea con 1 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (Bup-SR).
NOTA: Non iniettare l'area dell'incisione proposta; scegliere un sito di iniezione ben lontano dalla scapola. - Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano fino a quando non mostra segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare lo stato di anestesia.
- Preparare il mouse per l'intervento chirurgico in un luogo lontano dall'area operatoria. Tagliare il sito chirurgico (cioè la superficie dorsale del cranio) con un'area di confine sufficiente per evitare che la pelliccia contamini il sito di incisione; quindi, saturare il sito con antisettico della pelle germicida, lavorando dal centro del sito alla periferia, quindi lasciare asciugare. Applicare un drappo sterile o un telo di plastica sterile con supporto adesivo per proteggere il sito chirurgico dalla contaminazione.
NOTA: gli strumenti devono essere autoclavati in anticipo e le punte risterizzate tra gli animali utilizzando uno sterilizzatore per perle di vetro. - Radere la pelliccia dell'intera superficie ventrale della testa e preparare la pelle usando la tecnica sterile.
- Situare il naso con un cono nasale a forma di L modificato dell'apparato stereotassico, assicurando che le narici rimangano chiare e aperte. Usando del nastro adesivo sulle superfici ventrali di entrambe le penne, tirare delicatamente la pelle in avanti per fissarla al cono del naso e piegare il collo con un angolo di circa 90 ° una volta fissato. Somministrare l'1,5% di isoflurano per mantenere l'anestesia.
NOTA: Il corretto posizionamento comporterà la presentazione dell'area dell'incisione in modo da consentire la facile identificazione della cresta caudale dell'osso occipitale. - Posizionare il corpo per garantire che la colonna vertebrale sia mantenuta a livello con la cisterna magna e, mentre si applica una leggera trazione alla coda, posizionare del nastro adesivo alla base della coda per fissarlo.
- Inietti il topo per via sottocutanea con 1 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (Bup-SR).
- Iniezione chirurgica di cisterna magna
- Con il collo in piena estensione, e iniziando proprio tra le penne, eseguire le punte chirurgiche a forbice verso il basso con una leggera pressione attraverso l'osso occipitale.
NOTA: Mentre si è in questa posizione della linea mediana, una piccola depressione è evidente quando le punte delle forbici si ispirano nell'area concava sopra la cisterna magna. - Fai una piccola incisione della linea mediana di 3-5 mm appena sopra la concavità palpata. Aspirare 5 μL di sospensione cellulare a 1,0 ×10 4 celle/μL (totale 5,0 ×10 4 cellule) in una siringa Hamilton da 30 G.
- Utilizzare pinca a punta smussata con punte da 1-2 mm per premere delicatamente sulla cisterna magna. Introdurre le punte in posizione chiusa e aprirle mentre si applica una pressione verso il basso sulla dura.
- Ripetere la dissezione smussata descritta nel passaggio precedente fino a quando la membrana durale è facilmente identificabile e i vasi sanguigni associati sono visibili nell'area esposta.
NOTA: La finestra di iniezione risultante assicura che i vasi sanguigni non siano danneggiati durante l'inserimento dell'ago. - Tenendo la pinna aperta per ritrarre la muscolatura circostante, introdurre un ago non carotaggio da 30 G sotto la dura per visualizzare la smussatura. Assicurarsi che l'ago sia introdotto solo appena oltre la smussatura stessa. Distribuire lentamente uno stantuffo a siringa e consegnare le celle appena sotto la dura.
- Posizionare correttamente la smussatura per osservare l'iniezione sotto la dura. Somministrare con attenzione la tecnica e utilizzare l'ago non carotaggio da 30 G per evitare danni alla membrana e garantire perdite minime. Se si nota una perdita, applicare una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone.
- Chiudere la pelle applicando una clip per ferite o una micro-goccia di adesivo per la pelle. Una volta eseguita con successo l'iniezione, consentire ai topi di riprendersi dall'anestesia su una coperta calda, osservandoli continuamente fino a quando non possono mantenere la posizione sternale e dimostrare un movimento pronostico.
- Monitorare i topi ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per la prima settimana. Se un topo sembra essere in difficoltà o dolore, trattarlo con 10 mg / kg di iniezione sottocutanea di carprofene una volta ogni 12-24 ore per un massimo di 5 giorni in base alla consultazione veterinaria e alla direttiva. Consentire ai topi di recuperarli e monitorarli per almeno 48-72 ore prima di procedere al passaggio successivo.
NOTA: Bup-SR, somministrato preventivamente, durerà fino a 72 ore, quindi normalmente non sono necessari analgesici aggiuntivi. Tuttavia, agli animali verrà fornito un analgesico aggiuntivo se necessario (se letargico, non mangiando, arruffato). Se un sito chirurgico sviluppa segni di infezione postoperatoria (cioè arrossamento, gonfiore, tenerezza, allodinia, iperalgesia, iperpatia o suppurazione), o se il topo sta proteggendo l'area interessata, eutanasia il topo. Se le cellule tumorali vengono iniettate con successo nel CSF, LMD e la progressione tumorale si svilupperanno nel SNC entro 1 o 2 settimane (a seconda dei tipi di CTC o della linea cellulare utilizzata) (Figura 1).
- Con il collo in piena estensione, e iniziando proprio tra le penne, eseguire le punte chirurgiche a forbice verso il basso con una leggera pressione attraverso l'osso occipitale.
2. Assemblaggio e impianto murino Ommaya
- Preparazione della stazione
- Disinfettare la superficie della stazione. Posizionare una copertura blu sulla superficie e tenere pronti tutti gli strumenti e le forniture sterilizzate indicati nella Figura 2.
- Procedura prechirurgica
- Applicare analgesia (Bup-SR) e mantenere la tecnica sterile come descritto al paragrafo 1.2.
- Impianto chirurgico di Murine Ommaya
- Assemblare il dispositivo di iniezione Murine Ommaya utilizzando una porta di iniezione miniatura da 25 G (0,51 mm di diametro esterno) e un disco distanziatore da 1 mm. Utilizzare un adesivo sterile cianoacrilato per garantire la penetrazione di circa 2,5 mm della cannula metallica nell'emisfero cerebrale destro (Figura 3A-C).
NOTA: Un prototipo di Mouse Ommaya compatibile con la risonanza magnetica è stato sviluppato in questo laboratorio, che ha già entrambe le parti (porta di iniezione in miniatura e distanziatore) stampate in 3D insieme come una singola unità(Figura 3D). La versione a singola unità è stata testata mediante risonanza magnetica e può far risparmiare tempo eliminando la fase di assemblaggio. - Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano fino a quando non ci sono segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare lo stato di anestesia.
- Radere l'intera superficie ventrale della testa di pelliccia e preparare la pelle secondo la tecnica sterile, come precedentemente descritto al punto 1.2.3. Posizionare il topo nell'apparato stereotassico con un cono nasale per continuare la somministrazione di isoflurano durante la procedura; diminuire l'isoflurano all'1,5%. Stringere delicatamente le barre auricolari per fissare la testa e applicare lubrificante per gli occhi per coprire gli occhi del mouse.
- Fare una piccola incisione cutanea (3 mm), seguita da una dissezione smussata dei tessuti sottocutanei sottostanti per esporre il cranio. Asciugare il cranio usando bastoncini applicatori con punta di cotone imbevuti di perossido di idrogeno.
- Praticare un foro di bava nel cranio posteriore di 0,5 mm e laterale di 1,1 mm del bregma - il punto anatomico sul cranio in cui la sutura coronale è intersecata perpendicolarmente dalla sutura sagittale (Figura 3A) - così come un foro di sbavatura di 0,9 mm per esporre la dura madre. Spostare il microdrill da parte e segnare delicatamente l'osso immediatamente circostante il foro della bava prima di inserire una porta di iniezione (profondità di circa 2,5 mm), fissata al cranio utilizzando un adesivo sterile cianoacrilato. Sutura di stato attorno al punto di iniezione utilizzando 4-0 suture di nylon senza assorbimento in un modello di punto interrotto o sutura di corda della borsa11.
- Casa topi post-chirurgici in gabbie individuali per il recupero chirurgico.
NOTA: È possibile che l'Ommaya murino possa staccarsi quando più topi recuperati dall'intervento chirurgico sono alloggiati nella stessa gabbia, probabilmente a causa di costanti interazioni di manomissione. Si raccomanda che i topi impiantati da Murine Ommaya siano alloggiati individualmente (o non più di 2 topi per gabbia) nel corso dello studio sull'efficacia del farmaco.
- Assemblare il dispositivo di iniezione Murine Ommaya utilizzando una porta di iniezione miniatura da 25 G (0,51 mm di diametro esterno) e un disco distanziatore da 1 mm. Utilizzare un adesivo sterile cianoacrilato per garantire la penetrazione di circa 2,5 mm della cannula metallica nell'emisfero cerebrale destro (Figura 3A-C).
3. Trattamento Murine Ommaya
- Dosaggio di topi con Murine Ommaya
- Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano, fino a quando non ci sono segni di riflesso raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare il mantenimento dell'anestesia.
- Accedere a Murine Ommaya utilizzando un adattatore per iniezione della porta e una siringa Hamilton. Utilizzando la pinna, tenere la parte superiore della porta di iniezione in miniatura e inserire delicatamente l'adattatore dell'iniettore della porta completamente nel setto della porta.
NOTA: l'iniettore della porta perfora il setto della porta in modo da ridurre al minimo lo spazio morto e consentire l'iniezione controllata tramite una pompa a siringa motorizzata (Figura 4A). I trattamenti mirati/nuovi vengono iniettati ad una portata di 1 μL/min durante l'anestesia. Il trattamento deve essere somministrato a intervalli specificati (giornaliero / settimanale) per una durata prestabilita (settimane / mesi), a discrezione del ricercatore.
Un volume compreso tra 3 e 7 μL è ottimale, poiché un volume < 3 μL è inaffidabile e un volume > 7 μL può causare troppa pressione. La dimensione della siringa Hamilton può variare da 10 a 100 μL, a seconda del numero di topi in ciascun braccio di trattamento. Il precaricamento del volume appropriato nella siringa Hamilton impedirà la sostituzione ripetuta della siringa, riducendo così al minimo gli errori. È meglio dedicare 1 siringa Hamilton per braccio di trattamento. - Una volta effettuata l'iniezione, staccare Murine Ommaya dall'adattatore per iniezione della porta usando una pinza e riportare il topo nella gabbia per riprendersi dall'anestesia, come descritto sopra nel passaggio 1.3.7.
- Eutanasia
- Eutanasia dei topi per inalazione di anidride carbonica (CO2)da una fonte di serbatoio compresso. Esporre i topi a concentrazioni crescenti di CO2 (cioè, deve essere utilizzato un tasso di spostamento dal 10% al 30% del volume / min della camera) per evitare o ridurre al minimo il disagio o l'angoscia. Monitorare i topi fino alla garanzia di cessazione dei movimenti cardiovascolari e respiratori.
Representative Results
Nei topi, il volume totale di CSF è di circa 35-40 μL ed è prodotto ad una velocità di circa 350 nL/min; gira 12-13 volte al giorno12. Allo scopo di visualizzare il percorso dell'iniezione, il 2% di Evans Blue è stato iniettato tramite il modello Murine Ommaya, a seguito del quale sono stati lasciati passare 15 minuti e 30 minuti prima di raccogliere il cervello per l'analisi. Il colorante si è infiltrato con successo nei ventricoli e nel cervello in 15 minuti. Entro 30 minuti, il colorante è diventato visibile sul midollo spinale (Figura 4).
Come prova di concetto, i topi BALB / c sono stati iniettati con una linea cellulare di cancro al seno Her2+ TUBO con etichetta luciferasi per via intracisternale e sono stati impiantati gli Ommay murini. Circa 1 settimana dopo l'iniezione di cellule tumorali, i topi hanno iniziato a sviluppare LMD. Questi topi sono stati trattati una volta alla settimana per un massimo di 4 settimane con l'immunoterapia con anticorpi Her2, sia attraverso la terapia sistemica tramite iniezione intraperitoneale o intratecale tramite Murine Ommaya (Figura 5A).
Sebbene i topi non trattati siano morti entro il giorno 19, tutti i topi che hanno ricevuto la terapia intratecale attraverso l'Ommaya murina sono sopravvissuti(P = 0,004). Entro la settimana 4, è stata osservata una completa regressione dei tumori. Rispetto ai topi trattati con terapia sistemica, che hanno avuto un moderato successo nel trattamento della LMD, i topi che hanno ricevuto la terapia intratecale hanno avuto una sopravvivenza globale molto più lunga (Figura 5B).
Figura 1: Iniezione di cellule tumorali circolanti nella cisterna magna in un modello di xenotrapianto murino per studiare la malattia leptomeningea e le metastasi del sistema nervoso centrale. (A) Un'illustrazione che mostra la posizione della cisterna magna e del sito di accesso al CSF, in cui le CTC vengono iniettate usando una siringa di Hamilton. (B)Un'immagine IVIS rappresentativa di topi che avevano sviluppato malattia leptomeningea e metastasi del sistema nervoso centrale (cervello e lungo il midollo spinale) dopo 2 settimane di iniezione con cellule tumorali circolanti. Le cellule sono state etichettate con un gene reporter luciferasi. Gli animali di controllo iniettati con soluzione salina non hanno sviluppato tumori (n = 3) e l'esperimento è stato eseguito in triplice copia. Abbreviazioni: CTC = cellule tumorali circolanti; IVIS = sistema di imaging in vivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Un esempio di configurazione di una workstation per l'esecuzione dell'impianto murino Ommaya nei topi. (1) Macchina per anestesia a gas/vaporizzatore. (2) Drappo di carta blu sterile che copre un supporto stereotassico. (3) Dispositivo stereotassico (supporto / palco, barre auricolari, cono del naso). (4) Microdrill. (5) Lente d'ingrandimento con luce. (6) Bastoncini di applicatore con tappo di cotone sterile con contenitore sterile per risciacquo salino. (7) Perossido di idrogeno. (8) Sterilizzatore per peri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'impianto del dispositivo Murine Ommaya. (A) Un'illustrazione con una freccia che indica la posizione del bregma sul cranio e la distanza approssimativa alla quale viene praticato un foro di bava nel cranio (0,5 mm posteriore/1,1 mm laterale) dal bregma usando un microdrill. (B) Un Ommaya murino viene assemblato combinando una cannula metallica e un distanziatore da 1 mm come base per l'attacco della colla al cranio. (C) Immagini rappresentative di topi a cui è stata impiantata Murine Ommayas; questi topi sono monitorati per garantire che siano luminosi, vigili e reattivi prima di ricevere qualsiasi iniezione. (D) Un esempio del prototipo di Murine Ommaya compatibile con la risonanza magnetica magnetica e immagini rappresentative di risonanza magnetica cerebrale di impianti Murine Ommaya. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Iniezione intraventricolare (sistema nervoso centrale) con Murine Ommaya. (A) Immagine di un'iniezione, accesso al ventricolo e al sistema nervoso centrale tramite l'Ommaya murino. I topi rimangono in anestesia durante l'iniezione. Nell'esempio, l'Ommaya murino è collegato alla porta in miniatura collegata a una siringa Hamilton preriempita. Le iniezioni vengono eseguite utilizzando un set di iniezione automatica a una velocità di infusione di 1 μL/min e un volume di 5-7 μL. Viene mostrata un'immagine di un cervello di topo iniettato con Evans Blue. Il cerchio mostra dove era attaccato il Murine Ommaya. Nessuna perdita del colorante è stata osservata all'esterno del cervello. Una sezione trasversale del cervello mostra che i ventricoli laterali sono stati riempiti con il colorante; il colorante non è penetrato nel parenchima cerebrale. (B) Immagini di cervelli di topo dopo 15 e 30 minuti dall'iniezione del colorante Evans Blue. Il colorante si è infiltrato nel cervello (15 min) e ha iniziato a circolare sul midollo spinale (30 min). Su 5 topi, 4 hanno ricevuto colorante per la visualizzazione e 1 è servito come controllo. L'esperimento è stato ripetuto in triplice copia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'immunoterapia mirata diretta con Murine Ommaya aumenta la sopravvivenza globale dei topi con malattia leptomeningea associata al cancro al seno. ( A )Itopi BALB/c sono stati iniettati con cellule TUBO 2-positive del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2-positive, una linea cellulare murina del cancro al seno. Tre giorni dopo le iniezioni di cisterna magna, murine ommayas sono stati impiantati. I topi hanno iniziato a sviluppare la malattia leptomeningea (LMD) 1 settimana dopo l'iniezione. I topi LMD sono stati trattati con un anticorpo del recettore del fattore di crescita epidermico umano per via sistemica tramite iniezione intraperitoneale o per via intratecale (Murine Ommaya) come approccio mirato diretto. Le iniezioni sono state somministrate una volta alla settimana per un massimo di 4 settimane. Rispetto ai topi non trattati, i topi sottoposti a immunoterapia sono sopravvissuti molto più a lungo. I topi Murine Ommaya hanno avuto una completa regressione della malattia entro la quarta settimana e questi topi sono stati infine guariti dalla malattia. (B) Questi topi avevano anche una sopravvivenza mediana significativamente migliore (test di Mantel-Cox; P = 0,004; n = 5 topi per braccio di trattamento) e una migliore sopravvivenza globale rispetto ai topi LMD trattati sistematicamente. Abbreviazioni: LMD = malattia leptomeningea; IP = intraperitoneale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui, il Murine Ommaya è stato descritto come un modello affidabile, che consente la somministrazione ripetuta di agenti anti-cancro nello spazio del CSF in modelli preclinici di LMD e altre malattie correlate al SNC. CSF è stato campionato dai topi mentre il dispositivo era ancora collegato senza interruzioni. Questo modello di xenotrapianto terapeutico mirato diretto è un passo importante nello sviluppo e nella sperimentazione di strategie di trattamento razionali per LMD. Il tempo che tra le iniezioni di cisterna magna e il segno iniziale dello sviluppo di LMD varia a seconda del tipo di cellula tumorale. Le metastasi LMD e CNS iniziano a prendere forma intorno a 1 o 2 settimane dopo l'inoculazione CTC. Se viene utilizzata una linea cellulare tumorale altamente proliferativa, è possibile che le metastasi possano verificarsi in <7 giorni. In questo caso, la vascolarizzazione dovuta alla crescita del tumore a volte può rende difficile l'impianto dell'Ommaya murino. Una soluzione a questa sfida è ridurre il numero di cellule tumorali per l'iniezione nello spazio del CSF, consentendo più tempo prima dello sviluppo del tumore. Inoltre, questo protocollo è stato ottimizzato per impiantare l'Ommaya murino entro e non oltre 72 ore dall'iniezione di cisterna magna per garantire ai topi il tempo sufficiente per riprendersi dall'intervento chirurgico prima del primo trattamento. I ricercatori dovrebbero calcolare il tasso di crescita dei CTC nei modelli di xenotrapianto prima di pianificare il regime di trattamento.
Sebbene esistano altri metodi di somministrazione intraventricolare diretta, come l'utilizzo di un sistema di pompaggio osmotico o di un'iniezione in bolo intracerebroventricolare (ICV), come descritto in precedenza9, ci sono diversi vantaggi nell'utilizzo del modello Murine Ommaya. Ad esempio, un'iniezione in bolo ICV viene eseguita in un singolo parto, mentre murino Ommaya consente dosi multiple di trattamento in qualsiasi momento, sia somministrate come singolo agente che come terapie combinate. La pompa osmotica è progettata per sostenere fino a 14, 28 o 42 giorni prima che la pompa debba essere sostituita, e talvolta più frequentemente se si utilizza un mouse più piccolo con una pompa più piccola. Cambiare la pompa osmotica richiede una procedura chirurgica, che aggiunge stress ai topi portatori di tumore. Una sostituzione murina Ommaya non è necessaria per esperimenti di lunga durata finché il dispositivo rimane intatto. Inoltre, riduce al minimo la potenziale variabilità derivante dalla sostituzione della pompa9. Murine Ommayas impiantato nei topi sperimentali è rimasto intatto per più di 42 giorni e questa durata ha permesso regimi di trattamento di lunga durata.
Risultati precedenti suggeriscono che un dosaggio intermittente pulsatile nel CSF ha una migliore efficacia contro LMD rispetto a un processo prolungato di somministrazione del farmaco per infusione13. Sarebbe impossibile eseguire iniezioni monodose ripetute utilizzando il sistema di pompaggio osmotico. Non esiste un modo semplice per scovare il liquido intrappolato rimanente dopo ogni iniezione. La pompa osmotica è anche limitata alla somministrazione di miscele di farmaci compatibili o singoli e in genere richiede volumi più elevati di preparazione del farmaco per l'infusione continua. Al contrario, il Murine Ommaya è progettato per micro-iniezioni accurate da un minimo di 3 a 7 μL, senza dover tenere conto dello spazio morto, e non vi è alcuna limitazione sul tipo di farmaci che i ricercatori possono utilizzare, compresa la terapia immunocellulare. Il Murine Ommaya riduce anche al minimo lo spreco di reagenti se un particolare campione è prezioso e massimizza l'uso di quella risorsa. Per qualsiasi regime di trattamento che richieda dosi multiple di terapie anti-cancro, il Murine Ommaya è facile da usare e vi è un rischio minimo di infezione o disavventura chirurgica, con approcci alternativi di accesso ripetuto al CSF chirurgicamente o tramite consegna ripetuta con un ago. Il Murine Ommaya offre ai ricercatori la flessibilità di regolare le concentrazioni di farmaco e le frequenze di dosaggio e di valutare la modulazione del bersaglio e la durata dello studio in base alla ricerca di interesse.
Una limitazione del Murine Ommaya è che i ricercatori potrebbero trovare difficile impiantare il dispositivo in topi più piccoli. Quindi, è meglio usare topi che hanno almeno 8-10 settimane di età. È possibile che l'Ommaya murino si stacchi durante la prova di trattamento se il dispositivo non è fissato al cranio durante le fasi di impianto e la colla svanisce, o se i topi lo hanno manomesso abrasivamente. Quest'ultimo scenario si verifica più frequentemente quando più topi sono stati alloggiati nella stessa gabbia. Quindi, si raccomanda di ospitare non più di due topi impiantati murini Ommaya per gabbia per la durata del programma di trattamento. Questo protocollo è stato modificato per applicare adesivo sterile cianoacrilato sul distanziatore, che è risultato essere la colla più efficace per aderire al distanziatore alla superficie del cranio e impedire al Murine Ommaya di staccarsi. I risultati hanno mostrato che i topi LMD hanno beneficiato della terapia intratecale diretta tramite Murine Ommaya, con una maggiore sopravvivenza globale. I volumi di microlitro singolo potrebbero essere somministrati in modo sicuro, bypassando la BBB, riducendo così la quantità di preparazione del farmaco. Ancora più importante, i topi che sono stati curati dalle metastasi del SNC dallo studio di immunoterapia con anticorpi Her2 sono rimasti sani.
Una collaborazione con un produttore mirava a sviluppare una versione compatibile con la risonanza magnetica del Murine Ommaya per il modello PDX di LMD. Poiché questa versione prototipo ha un distanziatore incorporato, non è necessario alcun assemblaggio, consentendo una migliore aderenza al cranio. Un limite di questo prototipo è che, sebbene il dispositivo sia compatibile con la risonanza magnetica, genera un'ombra in cui è inserito il dispositivo, che diminuisce la visibilità dell'immagine per le analisi di quantificazione. La versione compatibile con la risonanza magnetica è un buon strumento alternativo quando il campionamento CTC ex vivo è un fattore limitante e le celle di preetichettatura non sono fattibili. La combinazione di un modello di xenotrapianto LMD e della tecnica Murine Ommaya è utile per studiare l'efficacia del farmaco mirato diretto bypassando la BBB. I risultati di questi studi in vivo sono clinicamente rilevanti per progettare strategie terapeutiche razionali per i pazienti con LMD.
Disclosures
Peter Forsyth fa parte di comitati consultivi per Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen e Ziopharm, al di fuori del lavoro presentato. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson e il resto del team di medicina comparata della University of South Florida per il loro supporto tecnico e la manutenzione dei nostri animali. Ringraziamo Instech Laboratories, Inc. per il loro sforzo di lavorare con noi sulla base della nostra richiesta di sviluppare un Murine Ommaya compatibile con la risonanza magnetica. Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (a K.S.M. Smalley), dal Dipartimento della Difesa (DOD) W81XWH1910675 (a B. Czerniecki e P. Kalinski) e dal Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (a P. Forsyth e D. Duckett). L'assistenza editoriale è stata fornita dall'Ufficio di scrittura scientifica del Moffitt Cancer Center dal Dr. Paul Fletcher e Daley Drucker. Nessun compenso è stato dato oltre i loro stipendi regolari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
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