Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um dispositivo acoustofluido de baixo custo para rápida entrega molecular às células através de sonoporação induzida por agentes de contraste de ultrassom.
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Artigo de método
Montagem e Operação de um Dispositivo Acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células
Neste artigo
Resumo
Resumo
A entrega intracelular eficiente de biomoléculas é necessária para uma ampla gama de pesquisas biomédicas e aplicações terapêuticas baseadas em células. Sonoporação mediada por ultrassom é uma técnica emergente para rápida entrega intracelular de biomoléculas. A sonoporação ocorre quando a cavitação de microbolhas cheias de gás forma poros transitórios em membranas celulares próximas, o que permite a absorção rápida de biomoléculas do fluido circundante. As técnicas atuais de sonoporção in vitro de células em suspensão são limitadas pelo rendimento lento, variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom para cada célula e alto custo. Para lidar com essas limitações, foi desenvolvido um dispositivo acoustofluido de baixo custo que integra um transdutor de ultrassom em um dispositivo fluido baseado em PDMS para induzir a sonoporação consistente das células à medida que elas fluem pelos canais em combinação com agentes de contraste de ultrassom. O dispositivo é fabricado usando técnicas de fotolitografia padrão para produzir o chip fluido baseado em PDMS. Um transdutor de disco de ultrassom piezo é anexado ao dispositivo e conduzido por um microcontrolador. O conjunto pode ser integrado dentro de uma caixa impressa em 3D para proteção adicional. As células e microbolhas são empurradas através do dispositivo usando uma bomba de seringa ou uma bomba peristáltica conectada à tubulação de PVC. A entrega aprimorada de biomoléculas para células T humanas e células cancerígenas de pulmão é demonstrada com este sistema acoustofluido. Em comparação com as abordagens de tratamento em massa, este sistema acoustofluidic aumenta o rendimento e reduz a variabilidade, o que pode melhorar os métodos de processamento celular para aplicações de pesquisa biomédica e fabricação de terapêuticas baseadas em células.
Introdução
Plataformas virais e não virais têm sido utilizadas para melhorar a entrega molecular às células. A entrega viral (transdução) é uma técnica comum utilizada em terapias baseadas em células que requerem modificação genômica. As limitações com a entrega viral incluem mutagênese insercional potencial, capacidade transgênica limitada e multiplicidade indesejada de infecção1,2. Portanto, técnicas de entrega molecular não viral estão em desenvolvimento para uma ampla gama de aplicações biomédicas e de pesquisa. Técnicas comuns incluem mecânica, elétrica, hidrodinâmica ou o uso de energia baseada a laser para melhora....
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Protocolo
Doações de sangue foram coletadas de doadores saudáveis seguindo protocolos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Louisville.
1. Fabricação de dispositivo acoustofluido
- Obtenha uma fotomasmamama com um design espiral concêntrico contendo canais com um diâmetro de 500 μm. Um arquivo CAD é fornecido nos arquivos suplementares como exemplo. Uma máscara personalizada pode ser encomendada de um fornecedor comercial ou padronizada usando um escritor de máscaras.
- Prepare um molde do design em espiral concêntrico em um wafer de silício revestido de fotoresistista usando técnicas de ....
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Resultados
Uma imagem do sistema acoustofluido montado dentro de uma caixa impressa em 3D é mostrada na Figura 1. Este protocolo produz um sistema acoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares usando agentes de contraste de ultrassom.
Figura 2 demonstra maior entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias com trata.......
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Discussão
Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido de baixo custo que melhora a entrega intracelular de biomoléculas para aplicações de pesquisa. Existem vários fatores importantes a serem considerados na montagem e operação deste sistema. O dispositivo acoustofluido é fabricado em PDMS, que é um material biocompatível que pode ser facilmente moldado com dimensões de canal consistentes27. Os canais do dispositivo podem ser enxaguados com 15 mL de solução de 70% de eta.......
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Divulgações
Os coautores MAM e JAK possuem propriedade na DesiCorp que podem se beneficiar financeiramente de produtos relacionados a esta pesquisa.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado, em parte, por meio de financiamento da Fundação Nacional de Ciência (#1827521, #1827521, #1450370) e dos Institutos Nacionais de Saúde (U01HL127518). Os serviços de fotolitografia foram prestados pelo Centro de Tecnologia Micro/Nano da Universidade de Louisville.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fabricação de Dispositivo Acustofluídico | |||
| DOW SYLGARD 184 ENCAPSULANTE DE SILICONE TRANSPARENTE 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Reservatório Microfluídico para Tubo Falcon de 15 mL - S (2/4 porta) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Lâmina de Microscópio | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| triclorosilano | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | O clorossilano é muito hazarado e inflamável. A exposição causa queimaduras graves e danos aos olhos. |
| Tubulação de plástico macio Tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Parte #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Montagem do Sistema Acústico-fluídico | |||
| Arduino Uno | Arduino 7630049200050 | (Código de Barras) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparação de Agentes de Contraste Ultrassônicos | |||
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (gás decafluorobutato) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamadores | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polioxietileno 40 estearato | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparação de células T primárias | |||
| autoMACs executando tampão | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Nº de pedido) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Kit de isolamento de células T Pan, humano (Coquetel de anticorpos de biotina de células T Pan & Coquetel Pan T-Cell MicroBead) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Nº de pedido) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| classificador de células magnéticas (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Nº de pedido) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. Não.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Azul de tripano (0,4% em solução aquosa Pronto a usar, estéril) | VWR | 97063-702 (Cat. Não.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
Referências
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vecto....
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Reimpressões e permissões
