酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。
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この記事について
サマリー
要約
微生物の成長速度における菌株間および内の不均一性の正確な測定は、ストレス耐性、病原性、およびフィットネスの他の重要な構成要素への遺伝的および環境的な入力を理解するために不可欠です。この原稿は、実験ごとに約105 サッカロミセスセレビシエ の微小コロニーを追跡する顕微鏡ベースのアッセイを記述しています。マルチウェルプレートに固定化された酵母の自動タイムラプスイメージング後、マイクロコロニーの成長率はカスタム画像解析ソフトウェアで容易に解析できます。各マイクロコロニーについて、蛍光タンパク質の発現と局在化、急性ストレスの生存もモニタリングできます。このアッセイにより、株の平均成長率を正確に推定できるほか、クローン集団内の増殖、遺伝子発現、ストレス耐性の不均一性を総合的に測定できます。
概要
成長フェノタイプは酵母のフィットネスに重要に貢献します。自然選択は、有効人口規模の逆数によって異なる成長率を有する系統間を効率的に区別することができ、これは1個1の1を超える可能性がある。さらに、人口内の個体間の成長率の変動は、ベットヘッジ2、3、4、5、6などの生存戦略の基礎となる可能性があるため、進化的に関連するパラメータである。したがって、増殖表現型とその分布を極めて正確に測定できるアッセイは、微生物の研究にとって極めて重要です。ここで述べたマイクロコロニー成長アッセイは、実験ごとに〜105マイクロコロニーの個々の増殖速度測定を生成することができる。したがって、このアッセイは、酵母進化遺伝学とゲノミクスを研究するための強力なプロトコルを提供します。遺伝的に同一の単一細胞の集団内の変動が生成され、維持され、集団適合性7、8、9、10
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プロトコル
1. ランダムプレートの作成(実験日前)
- 成長アッセイで試験される株および条件を計画する。この時点で、任意のウェルにひずみと条件をランダムに割り当てます。
注:プレートの設定を検討する場合、測定で適切に関連するノイズを考慮するために、1つのプレートに1つの歪みと成長条件ごとに複数の反復を含めるのが賢明です。詳細については、「ディスカッション」を参照してください。 - 異なる日に実行されるプレート複製の各ひずみと環境条件の位置を計算的にランダム化します。
- 30°C(または他の適切な温度)でシェーカー中の酵母エキスペプトンデキストロース(YEPD;2%グルコース)培地で飽和する実験で使用されるすべての細胞を成長させます。
- ランダム化ストックプレートを手動で作成するか、液体処理ロボットで作成します。滅菌U-底組織培養プレートの各ウェルに、指定された飽和細胞の 10 μL を加えます。複数の株が単一のウェルでテストされる場合は、この時点でそれらを組み合わせないでください。この結合は、実験の日に細胞希釈の直前に行われ、マイクロコロニー形成細胞としてメッキされた場合にすべての株が正しい濃度であることを確認する。
- 各プレートの各ウェルに30%のグリセロールの10 μLを加えます。細胞とグリセロールがよく混ざるように上下にピペット。
- 各プレートをホイルカバーで密封し、すぐに-70°Cで凍結して使用できる状態にします。
注....
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結果
このプロトコルの新しい点は、タイムラプスイメージングを通じてマイクロコロニーへの成長を追跡することによって、集団内の個々の細胞の成長率を計算できることである(図2A)。コンカナリアニンAの存在により、マイクロコロニーは平面的に何時間も成長するため、その領域は実験全体を通して追跡することができ、時間の経過とともに領域の自然対数の変化に直線的に適合し、観察された個々のコロニーの成長率を7、9、10、13で観察する。 同じ環境における個々の同位体細胞のマイクロコロニー成長速度の違いは明らかに記録されている(図2A、2B)。画像解析ソフトウェアは、マイクロコロニーサイズと蛍光の変化を自動的に追跡するために使用する必要があります (図 2C);
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルは、細胞増殖と遺伝子発現を個々のマイクロコロニーのレベルで同時に監視することを可能にする汎用性の高いアッセイです。これら2つのモダリティを組み合わせることで、ユニークな生物学的洞察が得られます。例えば、以前の研究では、このアッセイを用いて、同時に7,10の両方を測定することにより、アイソジェニック型野型細胞におけるTSL1遺伝子の発現とマイクロコロニー増殖速度との間に負の相関を示す。また、蛍光タグ付きタンパク質の増殖速度と細胞内局在ダイナミクスとの関係を、記載されたアッセイで監視することもできる。例えば、増殖率とRFPタグ付き転写因子Msn2の核占有率との間の負の関係は、増殖アッセイ10を初期化する前に毎分細胞の蛍光を30分間イメージングすることによって同定された。最後に、このプロトコルは、環境ストレスや摂動に対する細胞応答の監視を可能にします。熱ショックなどの治療は、成長アッセイを通じて途中で投与することができる。このような研究は.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
ナオミ・ジヴ、サーシャ・レヴィ、双李は、このプロトコルの開発に貢献してくれたことに感謝し、共有機器のデビッド・グレシャム、ビデオ制作に協力してくれたマリッサ・ノールに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金R35GM118170によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| 500 mLボトルトップフィルター.22 µm PES滅菌、低タンパク質結合、W / 45mmネック | フィッシャー | CLS431154 | 、メディア |
| BDファルコン*組織培養プレート、マイクロテストuボトム | フィ | ッシャー08-772-54 | の凍結、細胞の事前成長、および希釈に使用される96ウェル培養チューブ |
| 針なしBDシリンジ、50mL | ッシャー13-689-8 | Concanavalin A | |
| Costar滅菌使い捨て試薬リザーバーをろ過するために使用されます | フィッシャー | 07-200-127 | マルチチャンネルピペットで溶液をピペットするために使用される試薬リザーバー |
| コスターサーモウェル アルミニウムシーリングテープ | フィッシャー | 07-200-684 | 96ウェルプレートシール 成長前および凍結 |
| 用 糸くずと静電気フリーのキムワイプ | フィッシャー | 06-666A | 顕微鏡プレートの底に破片や傷がないようにするための糸くずと静電気フリーワイプ |
| Nalgene シリンジフィルター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 199-2020 | 0.2 μm細孔サイズ、直径25mm;コンカナバリンA溶液 |
| 培地 コンポーネント | |||
| 最小限の化学的に定義された培地(MD;2%グルコース) | 代替顕微鏡培地 酵母の予備成長および顕微鏡中の成長に使用される代替顕微鏡培地 | ||
| 合成完全培地(SC;2%グルコース) | の予備成長および顕微鏡 | ||
| 検査中の成長に使用される顕微鏡培地酵母抽出物-ペプトン-デキストロース(YEPD;2%グルコース) ランダム | 化されたプレートを凍結する前に | ||
| 顕微鏡 材料 | |||
| Breathe-Easyシーリング膜 | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | 通気性メンブレンは、顕微鏡実験中にプレートをシールするために使用されます。この段階では、ウェル内の結露を防ぎ、より良い顕微鏡画像を可能にするため、通気性のあるメンブレンは推奨されます |
| ブルックス 96ウェルフラットクリアガラス底顕微鏡プレート | ドットサイエンティフィック | MGB096-1-2-LG-L | 顕微鏡プレート |
| canavalia ensiformis(ジャックビーン)のConcanavalin A、凍結乾燥粉末 | ミリポアシグマ | 45-C2010-1G | 5x concanavalin A 溶液を調製し、5ml の 5x concanavalin A を 50 mL コニカルチューブで -80 °C で凍結します。 |
| CStrains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Hall and Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strainy, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 96ピンアタッチメント | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System | 自動ステージとオートフォーカスシステム付き倒立顕微鏡 |
参考文献
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320(2013).
- Kussell, E., Leibler, S.
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再版と許可
