Summary
Detta protokoll beskriver en reporter analys att studera regleringen av mRNA översättning i enstaka äggceller under in vitro mognad.
Abstract
Händelser i samband med oocyte nukleära mognad har beskrivits väl. Men mycket mindre är känt om de molekylära vägar och processer som äger rum i cytoplasman som förberedelse för befruktning och förvärv av totipotens. Under oocyte mognad beror förändringar i genuttryck uteslutande på översättning och nedbrytning av moderns budbärar-RNAs (mRNAs) snarare än på transkription. Genomförandet av översättningsprogrammet spelar därför en nyckelroll för att etablera oocyteutvecklingskompetens för att upprätthålla embryoutvecklingen. Detta dokument är en del av ett fokus på att definiera programmet för moderns mRNA översättning som äger rum under meiotisk mognad och vid oocyte-till-zygote övergången. I detta metoddokument presenteras en strategi för att studera regleringen av översättning av mål mRNAs under in vitro oocyte mognad. Här smälts en Ypet-reporter till 3' oöversatta regionen (UTR) av genen av intresse och sedan mikroin injiceras i oocyter tillsammans med polyadenylerad mRNA kodning för mCherry att kontrollera för injicerad volym. Genom att använda tidsfördröjningsmikroskopi för att mäta reporterackumulering beräknas översättningshastigheterna vid olika övergångar under oocyte meiotisk mognad. Här har protokollen för oocytisolering och injektion, timelapse-inspelning och dataanalys beskrivits, med hjälp av Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR-reportern som exempel.
Introduction
En fullvuxen däggdjur oocyte genomgår snabba förändringar i förberedelse för befruktning och förvärv av totipotency. Dessa förändringar är nödvändiga för att upprätthålla embryonal utveckling efter befruktning. Även om händelserna i samband med nukleära mognad är relativt väl beskrivna, är mycket mindre känt om de molekylära processerna och vägarna i oocyt cytoplasma. Under de sista stadierna av oocyte mognad, oocyter är transkriptionellt tyst, och genuttryck är helt beroende av mRNA översättning och nedbrytning1,2. Syntesen av proteiner som är kritiska för utvecklingskompetens förlitar sig därför på ett program för tidsbeställning av långlivade mRNAs som har syntetiserats tidigare under oocyttillväxt1,3. Som en del av ett fokus på att definiera detta program av moderns mRNA översättning utförs under meiotic mognad och vid oocyte-till-zygote övergången, presenterar detta dokument en strategi för att studera aktivering och förtryck av översättning av mål moderns mRNAs i enstaka äggceller under in vitro meiotic mognad.
I den här metoden klonas YPet:s öppna läsram uppströms 3' UTR av den avskrift av intresse. Därefter injiceras mRNAs kodning denna reporter i oocyter tillsammans med polyadenylerade mRNAs kodning mCherry för att kontrollera för injicerad volym. Reporter ackumulering mäts under in vitro oocyte meiotic mognad med tid-förfall mikroskopi. Ackumulering av gult fluorescerande protein (YFP) och mCherry registreras i enskilda oocyter, och YFP-signaler korrigeras av den platåerade nivån hos den samin injicerade mCherry. Efter datainsamling beräknas omräkningshastigheterna för olika tidsintervall under in vitro-oocyte meiotisk mognad genom beräkning av lutningen på kurvan som erhålls genom kurvpassning.
Den här metoden ger ett verktyg för att experimentellt bekräfta ändringar i översättningen av utvalda endogena mRNAs. Dessutom underlättar denna metod karakteriseringen av regleringselement som styr översättning under oocyte meiotisk mognad genom att manipulera cis-reglerande element i 3' UTR av mål mRNAs4,5,6. Manipulering av poly(A) svanslängd ger också insikt i adenylas/ deadenylase aktivitet i oocyter5. Mutagenes av cis-verkande element eller RNA immunprecipitation kan användas för att studera interaktioner med cognate RNA bindandeproteiner 6,7. Dessutom kan denna metod användas för att identifiera väsentliga komponenter i översättningsprogrammet som är avgörande för oocyteutvecklingskompetens genom att mäta mål 3' UTR-översättning i modeller associerade med minskad oocytkvalitet 8,9,10. Detta metodpapper presenterar ett representativt experiment där denuded oocyter av 21-dagars gamla C57/BL6 möss har mikro-injicerats med en Ypet reporter smält till 3' UTR il-7. Inställning och protokoll för oocyte injektion, time-lapse inspelning och data analys har beskrivits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöksförfarandena med djur godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of California i San Francisco (protokoll AN182026).
1. Förberedelse av medier
- Tillsätt alla komponenter, enligt beskrivningen i tabell 1, föratt göra det grundläggande oocytsamlingsmediet och oocytemognadsmediet. För det grundläggande insamlingsmediet ställer du in pH-7.4. För både insamlings- och mognadsmedium, tillsätt 3 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) och 1 μM cilostamid på användningsdagen.
2. Förberedelse av mRNA-kodning för Ypet-3' UTR och mCherry
- Erhåll 3′ UTR-sekvenserna i mRNAs av intresse.
OBS: För denna studie erhölls sekvenser tidigare från musen oocyte cDNA. - Design primers för att förstärka målet 3' UTR från oocyte cDNA och delar av pcDNA 3.1 vektor som innehåller en Ypet kodningssekvens, V5-epitop tagg och en T7 promotor.
- Förstärk med hjälp av ett DNA-polymeraskit med hög återgivning. Kör produkterna för polymeraskedjereaktion (PCR) på en gel för att kontrollera om fragmenten har rätt storlek, skär ut banden och extrahera DNA från gelén med hjälp av ett gelextraktionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Säkring PCR fragment till en vektor med hjälp av en PCR kloning kit.
OBS: PCR fragment inkuberades på is i 4 h för att underlätta en effektivare rekombination process. Detta strider mot tillverkarens instruktioner, som rekommenderar en inkubationstid på endast 45 minuter. - Transfektera PCR-fragment till kompetenta 5-α Escherichia coli-bakterier.
- Tillsätt blandningen och plasmiden till bakterierna och inkubera på is i 30 min.
- Värm blandningen och plasmiden genom att placera blandningen i ett vattenbad vid 42 °C i 45 s och svalna omedelbart på is i 3 minuter.
- Tillsätt 500 μL Super Optimal buljong med katabolitförtryck (SOC) medium och inkubera i 1 timme vid 37 °C.
- Snurra ner vid 7000 × g i 2 min och ta bort det mesta av supernaten. Återanvänd och plätera på en Luria buljong (LB) agar platta med lämpligt urvalsantibiotikum.
OBS: Karbinicillin användes i denna studie. - Inkubera över natten vid 37 °C. Isolera kolonierna genom att lätt trycka på en pipettspets på en av kolonierna och placera den i 3 ml LB-medium med 100 μg/ml karbinicillin. Inkubera i 12-24 timmar vid 37 °C.
- Extrahera plasmidernas DNA med hjälp av plasmid DNA-isoleringssatsen enligt tillverkarens instruktioner och bekräfta sekvenserna via DNA-sekvensering.
- För Ypet/3' UTR:
- Skapa en linjär PCR-mall för in vitro-transkription. Använd en framåtriktad primer uppströms Ypet-sekvensen och en omvänd primer med ytterligare 20 timminrester. Se tabell 2 för sekvensen av Ypet/IL-7 3' UTR och sekvenserna för de främre och omvända primersna.
OBS: Dessa ytterligare tyminrester kommer att lägga till oligo(A) till det linjära mRNA efter in vitro-transkription . - In vitro transkriberar PCR-produkten med hjälp av ett T7-transkriptionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Rena det resulterande kompletterande RNA (cRNA) med hjälp av ett transkriptionsrensningskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Elute det renade cRNA i RNAse-fritt vatten, mät koncentration och utvärdera integritet med agarose elektrofores. Förvara vid −80 °C.
- Skapa en linjär PCR-mall för in vitro-transkription. Använd en framåtriktad primer uppströms Ypet-sekvensen och en omvänd primer med ytterligare 20 timminrester. Se tabell 2 för sekvensen av Ypet/IL-7 3' UTR och sekvenserna för de främre och omvända primersna.
- För mCherry:
- Producera en linjär PCR-mall för in vitro-transkription med hjälp av ett enzym med hög återgivningsbegränsning; använd begränsningsenzymet mfEI-HF om du replikerar det här exemplet. Smält i en rötningsbuffert över natten vid 37 °C.
- Kör en gel för att rena provet och extrahera det linjära DNA:t med hjälp av ett gelextraktionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- In vitro transkriberar PCR-produkten med hjälp av ett T7-transkriptionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Polyadenylate cRNA (150-200 nukleotider) med hjälp av en poly (A) tailing kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Rena det resulterande cRNA med hjälp av ett transkriptionsrensningskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Elute den renade cRNA i RNAse-fritt vatten, mät mRNA koncentrationer och utvärdera meddelandet integritet med gel elektrofores. Förvara vid −80 °C.
3. Experimentellt förfarande
OBS: En schematisk översikt över oocytmikroinjektion och efterföljande tidsfördröjningsmikroskopi ges i figur 1.
- Dag 1
- Intraperitoneally injicera 21-dagars gamla möss med 5 IE av gravida mares serum gonadotropin för att främja follikel tillväxt till antral steg11.
- Dag 3
- Oocyt samling
- Offra möss 44-48 h efter priming för att samla äggstockarna och placera dem i en plast Petri-maträtt med grundläggande oocytsamlingsmedium.
- Öppna försiktigt antralsäckarna genom att göra ett litet snitt i follikelväggen med en 26 G nål. Isolera intakta cumulus-inneslutna äggceller (COC) med flera lager av cumulus celler med hjälp av en mun-operated glaspipett.
- Använd en mindre pipett (något större än oocytens diameter) och denude mekaniskt COC: erna genom upprepad pipettering.
OBS: Alternativt, utför mikroinjektion på intakta COC. - Använd en större pipett, aspirera de denuded oocyterna och placera dem i en Petri-maträtt med mognadsmedium kompletterat med 1 μM av fosfodiesterashämmaren, cilostamid, för att förhindra återupptagande av meiotisk mognad12. Placera skålen i inkubatorn i 2 h för att låta äggcellerna återhämta sig från stressen som induceras av isolering av äggcellerna från folliklarna.
- Oocyt mikroinjektion
- Förbered injektionsnålarna genom att placera ett 10 cm långt borosilikatglas kapillärrör i en mekanisk puller. För optimal injektion, böj nålspetsen i 45° vinkel med en uppvärmd glödtråd.
- Förbered polystyrenrätter med 20 μL droppar av grundläggande oocytuppsamlingsmedium och täck dropparna med lätt mineralolja.
- Förbered en reportermix genom att tillsätta 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR och 12,5 μg/μL mCherry. Förbered en större volym och gör alikvoter för framtida experiment för att säkerställa liknande reporterkoncentrationer. Förvara dessa alikvoter vid -80 °C. Vid upptining, först centrifugera alikvoten i 2 min vid 20 000 x goch överför till ett nytt mikrocentrifugrör.
OBS: Denna centrifugation förhindrar att injektionsnålen blir igensatt av potentiella aggregat i reporterblandningen. - Ladda injektionsnålen med kapilläritet med cirka 0,5 μL reporterblandning.
- Placera den inhållande pipetten och den laddade injektionsnålen i hållarna och placera den i droppen av oocytuppsamlingsmediet. Aspirera in en del av mediet i den hållande pipetten.
- Öppna injektionsnålen genom att försiktigt knacka den mot den hållande pipetten.
- Placera äggceller i en droppe av grundläggande samlingsmedium och injicera 5-10 pL av reporterblandningen.
- Inkubera äggcellerna i mognadsmediet med 1 μM cilostamid i 16 timmar för att låta mCherry-signalen platå.
- Förbered en petriskål som kommer att användas för tidsfördröjningsmikroskopi med minst två 20 μL droppar mognadsmedium för varje injicerad reporter: en droppe med 1 μM cilostamid för kontrollprofas I-arresterade äggceller och en droppe utan cilostamid för mognande oocyter. Täck dropparna med lätt mineralolja och placera i inkubator.
- Tidsfördröjning mikroskopi
- Efter förinkubation, ta bort de injicerade äggcellerna från inkubatorn och tvätta dem fyra gånger i mognadsmedium utan cilostamide. Förvara några äggceller i mognadsmedium med 1 μM cilostamid som profas I-arresterad oocytkontrollgrupp.
- Överför de injicerade äggcellerna till sina respektive droppar på den tidigare beredda tidsfördröjningsmikroskopformen. Gruppera äggcellerna med hjälp av en sluten glaspipett (en sluten pipett kan beredas genom att hålla spetsen i en låga i några sekunder).
OBS: Klustring av äggceller hjälper till att förhindra deras rörelse under inspelningen. - Placera skålen under mikroskopet utrustad med ett ljusavgivande diodbelysningssystem och ett motoriserat steg utrustat med en miljökammare som hålls vid 37 °C och 5 % CO2. För att replikera denna studie, använd följande parametrar: filteruppsättning: tärande spegel YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP-kanal (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Utsläpp (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Ange lämpliga inställningar för tidsfördröjningsexperimentet (se Innehållsförteckning för programvaran som används i den här studien): Klicka på Appar | Flerdimensionellt förvärv. Välj den första fliken Huvud och välj timelapse, flera stegpositioner och flera våglängder.
- Välj fliken Spara för att ange den plats där experimentet ska sparas.
- Välj fliken Timelapse om du vill ange antalet tidspunkter, varaktighet och tidsintervall.
OBS: Varaktigheten av tidsfördröjningsexperimentet beror på de studerade djurarterna, eftersom tidpunkten för oocyte meiotisk mognad skiljer sig mellan arter. I detta experiment med mus oocyter registrerades oocyter var 15 min i 16 h. - Välj fliken Scen. Slå på brightfield och lokalisera oocyternas position genom att öppna ett nytt fönster genom att välja | Skaffa | Visa Live. När äggcellerna är placerade växlar du tillbaka till fönstret Flerdimensionellt förvärv och trycker på + för att ställa in oocyternas placering.
- Välj fliken Våglängderoch ställ in 3 olika våglängder för brightfield (exponering 15 ms), YFP (exponering 150 ms för Ypet/IL7 3' UTR) och mCherry (exponering 75 ms för Ypet/IL7 3' UTR).
OBS: Justera exponeringen för varje Ypet/3' UTR-reporter baserat på graden av reporterackumulering och den injicerade volymen. Se till att YFP-signalen hamnar i mitten av detektionsområdet i början av experimentet för att förhindra underskattning eller mättnad vid aktivering av översättning. För mCherry, justera exponeringen för varje sats mCherry eftersom signalen beror på antalet adeninnukleotider som tillsattes under polyadenyleringsförfarandet. På grund av variationen i polyadenylering effektivitet, använd samma sats av mCherry i olika experiment för en bättre jämförelse mellan experiment. - Starta tidsfördröjningsexperimentet genom att klicka på Hämta. Se figur 2 och tilläggsfilen för ett exempel på en timelapse-inspelning i en enda äggcell.
- Analys av Ypet-3' UTR-översättning
- För denna analys (se Tabell över material för den programvara som används i denna studie), utför två regionmätningar för varje äggcell: själva äggcellen-klicka på ellipsregionen och omge oocyt-och en liten region nära äggaocyten som ska användas för bakgrund subtraktion-klicka på rektangulär region.
OBS: Se till att äggcellerna inte flyttar ut ur det valda området under timelapse-inspelningen. Var särskilt uppmärksam på placeringen av regionmätningen runt polär kroppsprofilering, eftersom detta orsakar rörelse i äggcellen och kan förvränga inspelningen. - Exportera regionens mätdata till ett kalkylblad genom att klicka först på Öppna logg och sedan på Loggdata för att exportera dataanalysprogramvaran.
- För varje enskild oocyt och för alla uppmätta tidpunkter subtraherar du bakgrundsregionmätningen från mätningen av oocytregionen. Gör detta för YFP och mCherry våglängder separat.
- Registrera tidpunkten för germinal vesikelnedbrytning (GVBD) och polarkroppens extrudering (PBE) för senare referens.
OBS: Uteslut mogna musoocyter när GVBD överstiger 2 h. - Plot YFP och mCherry uttryck över tid för varje oocyte att kolla efter avvikande värden.
OBS: Detta bör vara en jämn kurva, om det inte är detta kan indikera att äggaocyten rörde sig under inspelningen. - För varje enskild oocyt beräknar du genomsnittligt mCherry-uttryck för de sista tio tidpunkterna i inspelningen. För varje tidpunkt delar du YFP-uttrycket med det genomsnittliga mCherry-uttrycket för att korrigera för injicerad volym för att erhålla ett YFP/mCherry-förhållande vid varje tidpunkt för varje enskild oocyt.
- Beräkna omräkningshastigheter för ett visst tidsintervall genom att anpassa kurvans lutning efter linjär regression. Bedöma skillnaderna i omräkningshastigheter med hjälp av statistisk slutsats.
- För denna analys (se Tabell över material för den programvara som används i denna studie), utför två regionmätningar för varje äggcell: själva äggcellen-klicka på ellipsregionen och omge oocyt-och en liten region nära äggaocyten som ska användas för bakgrund subtraktion-klicka på rektangulär region.
- Oocyt samling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denuded prophase I-arresterade oocyter av 21-dagars gamla C57/BL6 möss injicerades med en reporter blandning som innehåller mRNA kodning Ypet reporter smält till 3' UTR il-7 och mRNA kodning mCherry. YFP och mCherry uttryck registrerades i 39 äggceller, varav 30 mognades, och 9 arresterades i prophase I som en negativ kontroll. Tre mognande äggceller uteslöts för analys eftersom de antingen hade en fördröjd GVBD (N=2) eller flyttades i skålen under inspelningen (N=1). Figur 3 visar mCherry- och YFP-uttryck i profas I och mognande äggceller. Figur 4 visar YFP-uttryck av mognande oocyter korrigerade för platåerat mCherry-uttryck (genomsnittligt mCherry-uttryck under de senaste 10 tidpunkterna) för att korrigera för den injicerade volymen. Reporterns översättningshastigheter mättes genom kurvpassning (linjär regression) YFP/mCherry-värdena i profas I och i mognande äggceller under de första 0-2 h eller 8-10 h efter cilostamide release (Figur 5A). Ackumuleringen av reportern följer inte ett linjärt mönster, vilket indikeras av en betydande skillnad i översättningshastigheter mellan 0-2 h och 8-10 h efter cilostamide release (p<0.0001; Figur 5B). Därför tyder dessa resultat på aktivering av IL-7 översättning under oocyte meiotic mognad.
Figur 1: Schematisk översikt över försöksförfarandet. Oligoadenylerade Ypet/3' UTR och polyadenylerade mRNA kodning mCherry är mikroinjekterade i denuded oocyter av 21-dagars gamla C57/BL6 möss. Oocyter förinkuberas i 16 timmar i cilostamid som innehåller mognadsmedium så att mCherry-signalen kan nå en platå. Efter pre-inkubation startas en timelapse inspelning där oocyter antingen hålls i medium med cilostamide för att skapa en prophase I-arresterad kontrollgrupp eller släpps i cilostamide-fritt medium att mogna. Förkortningar: UTR = oöversatt region; YFP = gult fluorescerande protein; fw primer = framåt primer; rev primer = omvänd primer; Ampr = ampicillinresistens; polyA = polyadenyl; oligoA = oligoadenyl; GV = germinal vesikel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Exempel på en enda oocyt-timelapse-inspelning. Brightfield, YFP och mCherry inspelningar av en enda oocyte injiceras med mRNAs kodning Ypet/Interleukin-7 3' UTR och polyadenylated mCherry vid prophase I, MI (6 h efter cilostamide release) och MII (15 h efter cilostamide release). Skalstång = 25 μm. Förkortningar: YFP = gult fluorescerande protein; GV = germinal vesikel; MI = metafas I; MII = metafas II. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:YFP- och mCherrysignaler som registreras av tidsfördröjningsmikroskopi. YFP- och mCherry-signaler av oocyter injicerade med oligoadenylerad Ypet/IL7 3' UTR och polyadenylerad mRNA-kodning mCherry. Oocyter hölls antingen i medium med cilostamide för att generera en prophase I-arresterad kontrollgrupp (N=9) eller släpptes i cilostamide-fria medium för att möjliggöra mognad (N=30). Data är individuella oocytmätningar. Förkortningar: IL-7 = interleukin-7; YFP = gult fluorescerande protein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:YFP-signalen korrigerad för saminsprutad mCherry-nivå. YFP signaler av prophase I-arresterade och mognande äggceller korrigerades för injicerad volym genom att dividera YFP signalen med den genomsnittliga mCherry signalen av de senaste 10 tidpunkterna. Individuella YFP/mCherry-förhållanden för( A) profas I-arresterade äggceller och (B) mognande oocyter och betyder ± standardfel av de genomsnittliga YFP/mCherry-förhållandet mellan (C) profas I-arresterade och (D) mognande oocyter. Förkortningar: YFP = gult fluorescerande protein; GVBD = germinal vesikelnedbrytning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Beräknade översättningshastigheter vid 0-2 timmar och 8-10 h mognad. (A) Gula fluorescerande protein (YFP) signaler av enstaka oocyter korrigerade för mCherry (YFP/mCherry) vid 0-2 h eller 8-10 timmar efter att cilostamid släppts och (B) omräkningshastigheter (medelvärdets standardfel ±) beräknat med kurvpassning (linjär regression) YFP/mCherry-värdena vid 0-2 h och 8-10 h efter att cilostamid släppts. Data analyserades med hjälp av det oparerade tvåsidiga t-testet. *p < 0.0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Exempel på förtryck av översättning: Oosp2. Återanalyserade data från ett experiment där oocyter injicerades med Ypet-Oosp2 3′ UTR och polyadenylerad mRNA kodning mCherry. YFP-signaler av prophase I-arresterade (N=63) och mognande äggceller (N=72) korrigerades för injicerad volym genom att dividera YFP-signalen med den genomsnittliga mCherry-signalen för de senaste 10 tidpunkterna. YFP- och mCherry-uttrycksdata erhölls med hjälp av en Xenon Arc-lampa, till skillnad från IL-7-experimentet där en LED-ljuskälla användes. Data representerar medelvärdet ± standardfel av medelvärdet av enskilda oocytmätningar och publicerades tidigare i Luong et al. 5.Förkortningar: YFP = gult fluorescerande protein; Oosp2 = oocyt utsöndrat protein 2; UTR = oöversatt region; IL-7 = interleukin-7; LED= lysdiod; GVBD = germinal vesikelnedbrytning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:Effekten av mikroinjektion och fluorescensexponering vid tidpunkten för GVBD och PBE. Tidpunkt för GVBD och PBE för äggceller som antingen mikroin injicerades och exponerades för fluorescens (injicerades) eller inte injicerades och inte exponerades för fluorescens (ej injicerad). Data är individuella oocytmätningar. Data analyserades med hjälp av det oparerade tvåsidiga t-testet. *p<0.001. Förkortningar: GVBD = germinal vesikelnedbrytning; PBE= polär kroppsprofilering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Grundläggande oocyte samling medium | ||
| komponent | För 500 ml | |
| HEPES modifierad minsta essentiella medelstora örn | 7,1 g | |
| bikarbonat | 252 mg | |
| Natrium pyruvat | 1,15 ml | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 ml | |
| Ultrapure destillerat vatten (Invitrogen, 10977-015) | Upp till 500 ml | |
| Mognadsmedium | ||
| komponent | För 500 ml | |
| MEM alfa 1x | Upp till 500 ml | |
| Natrium pyruvat | 1,15 ml | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 ml | |
Tabell 1: Förberedelse av media. Lista över komponenter som måste läggas till för att förbereda grundläggande oocyte insamling medium och oocyte mognad medium.
| sekvens | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTG GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCCGCC GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAAA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTTCATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATG AGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATACATATAAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAACCGTTCCAAATGTTTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTCTTAGC AAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAG ACTGGAGATACTGGAGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAACAAGAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCAACAAATGTAGTTAAATGAATGTATAACA CATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTAATTT TGGCATTCTGTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTATCTATCTATATATATAATA ATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACAC TGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAGTGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAA AACACTAATTTCTTGTTTTATAGGGTCTTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGC CAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATCCTATCCTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTGTAAGGTCTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATACGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTCCCCCCCCCTATAATGCTCTACTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCACAATTGAGAAACACCAATTATTTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGTGTCAGTCCTTTCCTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATTTTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT |
||||
| Framåt primer | GAGAACCCACTGCTTAC (OLIKA) | ||||
| Omvänd primer | TTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTATTTTG CCAAAATC (CCAAAATC) |
||||
Tabell 2: Exempel på reporter- och primersekvenser Sekvens av YFP/IL7 3'UTR-reporter och sekvenser av framåt- och omvända primers som användes för att producera en linjär PCR-mall för in vitro-transkription.
Kompletterande fil: Gult fluorescerande protein(YFP) och mCherry time-lapse inspelning. YFP- och mCherry time-lapse-inspelningar av en enda oocyt injicerad med mRNAs kodning Ypet/Interleukin-7 3' UTR och polyadenylerad mCherry. YFP-kanal (Ex: S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mCherry kanal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m). Äggcellerna registrerades var 15:e minut i 16 timmar (7 bilder/sekund). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade metoden beskriver en strategi för att studera aktivering och förtryck av översättning av mål mRNA vid olika övergångar under in vitro oocyte meiotic mognad. IL-7, en cytokin som frigörs av äggcellen som kan vara involverad i oocyt-cumulus cell kommunikation8,13, valdes för att beskriva denna metod. IL-7 är känt för att alltmer översättas under oocyte mognad8 och möjliggör god visualisering av translationell aktivering med denna metod. Om översättningen sker i konstant takt under hela experimentet kommer dock ackumuleringen av en reporter att följa ett linjärt mönster, och översättningshastigheterna i början och slutet av experimentet kommer att vara liknande. Denna slutsats kan verifieras genom god passform (R) av en linjär regression genom hela inspelningsintervallet. Ett förtryck i reporteröversättningen kommer att frampla sig som platå av YFP-signalen.
Ett exempel på förtryck av 3' UTR översättning, finns i studien av Luong et al. 5, där författarna rapporterar förtryck av Oocyte Secreted Protein 2 (Oosp2) under oocyte meiotisk mognad. Dessa data har analyserats på nytt och visas i figur 6. De mogna oocyterna visar platå av YFP-signalen, vilket indikerar förtryck av översättning, medan den profasA-arresterade kontrollgruppen följer ett linjärt mönster av reporterackumulering, vilket indikerar liknande översättningshastigheter i början och slutet av experimentet. När man studerar förtryck av översättning är det särskilt viktigt att inkludera en prophase I-arresterad kontrollgrupp för att säkerställa att platån för YPF-signalen inte förklaras av en minskning av oocytkvaliteten på grund av dåliga odlingsförhållanden, vilket bekräftar äggocyternas livskraft. Ackumulering av reportern kan valideras genom kvantitativ omvänd transkription PCR med primers för YFP eller genom western blotting genom att dra nytta av V5-epitop taggen som ingår i reportern i detta protokoll.
Platåning av YFP-signalen kanske inte enbart beror på aktivt reglerat förtryck av översättning, men kan också förklaras av nedbrytningen av reportern under oocyte meiotic progression. Detta kan spegla destabilisering av det endogena mRNA, vilket är viktigt för övergången till embryonalt genomuttryck14,15,16. Denna möjlighet kan verifieras genom att mäta mål gen transkription nivåer i prophase I stadium vs. metaphase II steg för att bekräfta stabiliteten hos mRNAs. Vid beredning av oocyt cDNA, Det är att föredra att använda slumpmässiga hexamer priming över oligo-dT priming. Den senare metoden presenterar uppenbara skillnader i gen transkript nivåer som kan återspegla skillnader i poly(A) längd av dessa transkriptioner snarare än faktiska skillnader i transkription nivåer7.
Det finns flera metoder för att studera genomomfattande endogen mRNA översättning i mus oocyter. Dessa metoder inkluderar polysome profilering7,17,18 och RiboTag/RNA-Seq5,19,20. Ribosomprofilering är en annan metod för att studera genomomfattande översättning som har använts i jäst, som är en annan modellorganism som används för att studera meios21,22. Dessa genomomfattande analyser för att studera mRNA-översättning i musen kräver dock användning av 150-200 äggceller per prov medan antalet oocyter som är tillgängliga för analys vanligtvis är begränsat. Den enda oocytanalysen som beskrivs häri för att bedöma översättningen av 3' UTR av mål mRNAs kompletterar genomomfattande analyser av översättning, eftersom det möjliggör karakterisering av element i 3' UTR som reglerar översättningsprogrammet under oocyte meiotisk mognad4,5,6. Tidigare användes luciferasbaserade analyser för att bedöma översättningen av 3' UTR av mål mRNAs10,20,23 eftersom det är en mycket känslig metod som bara kräver några äggceller per prov; Äggcellerna måste dock lysas för att upptäcka mängden luciferas i ett prov.
Andra har använt en 3' UTR / grön fluorescerande protein (GFP) reporter för att bedöma GFP ackumulering i levande mus oocyter4. I dessa experiment användes dock endast två tidpunkter: början på inkubation (prophase I) och slutet på inkubationen (metafas II). Detta minskar mätningarna kraftigt och ökar risken för fel. Kinetiska data ger exakta mätningar baserade på frekvenser (flera punkter) och definierar exakt den tid då translationell aktivering eller förtryck äger rum. Dessutom kan förtrycket av översättning inte bedömas vid dessa gemensamma tidpunkter, vilket kan leda till en felaktig slutsats. Därför justerades denna metod genom att tillämpa tidsfördröjningsmikroskopi för att bedöma Ypet/ 3 ' UTR-reporter ackumulering under in vitro-mognad av musoocyter5,6,9. Genom att använda denna strategi är det möjligt att studera översättning vid olika övergångar under oocyte mognad.
Det finns flera viktiga aspekter med denna metod att tänka på. För det första, de reportrar som används inkluderar en oligo (A) svans vars utelämnande avsevärt minskar reporter ackumulering. Detta kan bero på både minskad översättning samt reporter mRNA destabilisering24,25. Under preinkubationen i profas I justeras översättningen av en oligoadenylerad sond för att återspegla översättningshastigheten för det endogena mRNA5. För det andra är det viktigt att inse att en ökning av antalet inspelningar eller varaktigheten av fluorescensexponering potentiellt kan inducera fototoxicitet och därmed försämra oocytkvaliteten. Även om det aktuella experimentet antog 15-minutersintervaller kan provtagningshastigheten minskas när en hög fluorescensexponering måste användas vid lågt reporteruttryck.
För att begränsa mängden fototoxicitet användes en kall LED-ljuskälla, vilket kräver en kortare excitation26. För att bedöma potentiella fototoxicitetseffekter i äggcellerna jämfördes tidpunkten för GVBD och PBE i äggceller som antingen mikroin injicerades och exponerades för fluorescens eller inte injicerades och inte exponerades för fluorescens. Kombinationen av mikroinjektion och fluorescensexponering konstaterades för att fördröjning av GVBD (p<0,001), medan tidpunkten för PBE var likartad (figur 7).
Denna metod har använts för att studera translationella reglerande element i 3' UTR under in vitro oocyte meiotic mognad. På samma sätt kan det också användas för att studera funktionella 5" UTR-element som är väsentliga för reglering av översättning eller för att studera översättning under in vitro-öcytbefruktning. Även om denna metod har tillämpats på människa och musoocyter, är den också tillämplig på andra djurarter. Eftersom denna reporteranalys utförs i enstaka äggceller är den särskilt lämplig för användning i monoovulatoriska arter där antalet oocyter som är tillgängliga för analys är begränsat. I motsats till att använda denuded oocytes, en annan tillämpning av denna teknik är injektionen av reportern i cumulus-slutna äggceller, eftersom cumulus cellerna spelar en viktig roll i regleringen av translationella programmet8,10,27. Det bör dock beaktas att cumulus-inneslutna äggceller är mer benägna att flytta sig från inspelningsplanet under experimentet jämfört med denuderade äggceller på grund av cumuluscellernas rörelse under COC-expansionen. Detta kan leda till en större andel äggceller som måste uteslutas från analysen. I framtiden kan cellspårningsprogram användas som kan spåra x-, y- och z-positioner för äggcellerna i droppen, vilket kan lösa problemet.
Sammanfattningsvis representerar den beskrivna enskilda oocyte reporter analys en strategi för att undersöka translationella programmet utförs vid oocyte-till-zygote övergången. Ökad kunskap om detta translationella program kan ge viktiga ledtrådar om molekylär reglering av oocyte utvecklingskompetens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH R01 GM097165, GM116926 och Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 till Marco Conti. Enrico M. Daldello stöddes av ett stipendium från Lalor Foundation och Natasja G. J. Costermans fick stöd av ett Rubicon-stipendium från Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
