המאמר הנוכחי מפרט פרוטוקול שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרמות מוצלחות ובעלות רעש נמוך במספר סוגים של יתושים, כולל נקבות וזכרים כאחד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
נקבות יתושים הן החיות הקטלניות ביותר על פני כדור הארץ, ותובעות את חייהם של יותר ממיליון בני אדם מדי שנה בשל פתוגנים שהם מעבירים בעת רכישת ארוחת דם. כדי לאתר פונדקאי להיזון ממנו, יתושים מסתמכים על מגוון רחב של רמזים חושיים, כולל חזותיים, מכניים, תרמיים וחוש ריח. המחקר מפרט טכניקה, אלקטרואנטנוגרפיה (EAG), המאפשרת לחוקרים להעריך אם היתושים יכולים לזהות כימיקלים בודדים ותערובות של כימיקלים באופן תלוי ריכוז. בשילוב עם כרומטוגרפיית גז (GC-EAG), טכניקה זו מאפשרת לחשוף את האנטנות לתערובת מלאה של מרחב ראש / מורכב וקובעת אילו כימיקלים נוכחים במדגם המעניין, היתוש יכול לזהות. זה חל על ריחות גוף מארחים, כמו גם זרי פרחים צמחיים או ריחות רלוונטיים אחרים מבחינה אקולוגית (למשל, ריחות אתרי oviposition). כאן, תיארנו פרוטוקול המאפשר משכי זמן ארוכים של היענות הכנה והוא ישים הן ליתושים נקבות והן ליתושים זכרים מסוגים שונים, כולל יתושי Aedes, Culex, Anopheles ו - Toxorhynchits . מכיוון שחוש הריח ממלא תפקיד מרכזי באינטראקציות יתושים-מארחים ובביולוגיה של יתושים באופן כללי, EAGs ו-GC-EAG יכולים לחשוף תרכובות מעניינות לפיתוח אסטרטגיות חדשות לשליטה בווקטורי מחלות (למשל, פיתיונות). יחד עם בדיקות התנהגותיות, ניתן לקבוע את הערכיות (למשל, מושכת, דוחה) של כל כימיקל.
מבוא
יתושים הם האורגניזמים הקטלניים ביותר על פני כדור הארץ, גובים את חייהם של יותר ממיליון בני אדם בשנה ומעמידים יותר ממחצית אוכלוסיית העולם בסיכון לחשיפה לפתוגנים שהם מעבירים, תוך עקיצה1. חרקים אלה מסתמכים על מגוון רחב של רמזים (כלומר, תרמיים, חזותיים, מכניים, חוש ריח, שמיעתי) כדי לאתר פונדקאי להיזון ממנו (הן צמח והן בעל חיים), להזדווגות ולביציות, כמו גם כדי להימנע מטורפים הן בשלב הזחל והן בשלב הבוגר 2,3. בין חושים אלה, חוש הריח ממלא תפקיד קריטי בהתנהגויות שהוזכרו לעיל, במיוחד לזיהוי לטווח בינוני עד ארוך של מולקולות ריח 2,3. ריחות ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תמיסת מלח
- מכינים את המלוחים מראש ומאחסנים במקרר.
- עקוב אחר Beyenbach ו- Masia26 כדי להכין את הפתרון.
הערה: מתכון מלוחים ב-mM: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 גלוקוז, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl 2 ו-1.0 MgCl2. ה- pH מותאם ל- 7.1 עם 1 M NaOH. אין להוסיף גלוקוז או סוכרוז להכנה בשלב זה כדי להגדיל את אחסון המדף. הוסיפו את הכמות הדרושה לתמיסת מלח ממש לפני הרצת ה-EAGs (כ-50 מ"ל לניסוי).
2. הכנת ריחות ואחסונם
- הכינו מראש את תערובות הריח או דילולי תרכובת בודדת בבקבוקוני ענבר של 1.5 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של -20°C כדי למנוע התפרקות תרכובת.
הערה: הריכו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אלקטרואנטנוגרפיה היא כלי רב עוצמה כדי לקבוע אם כימיקל או תערובת של כימיקלים מזוהה על ידי אנטנת חרקים. הוא יכול לשמש גם כדי לקבוע את סף הזיהוי של כימיקל נתון באמצעות עלייה הדרגתית בריכוז (כלומר, תגובת עקומת המינון, איור 4B). יתר על כן, כדאי לבדוק את ההשפעות של דוחה על התגובה לריחות הקשורים למארח29.
תמיד יש להשתמש בבקרות חיוביות ושליליות ב- EAGs. כאן, בנזלדהיד שימש כבקרה חיובית (איור 3B, 3C,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התנהגויות מתווכות ריח מושפעות מגורמים רבים, כולל פיזיולוגיים (למשל, גיל, שעה ביום) וסביבתיים (למשל, טמפרטורה, לחות יחסית)30. לכן, בעת ביצוע EAGs, חיוני להשתמש חרקים הנמצאים באותו מצב פיזיולוגי (כלומר, ניטור גיל, רעב, הזדווגות)31 וגם לשמור על סביבה חמה ולחה סביב התכשיר כדי למנוע התייבשות. טמפרטורה סביב 25 °C (75 °F) היא אידיאלית ו 60% עד 80% לחות עבור חברת התעופה הראשית. ניתן להשיג זאת בקלות על ידי הצבת בועה במעגל התעופה הראשי.
יתר על כן, חשוב לק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחבר אין מה לחשוף.
תודות
אני אסיר תודה לד"ר קלמנט וינאוז'ה ולד"ר ג'פרי ריפל על הדיונים המועילים. הריאגנטים הבאים הושגו באמצעות BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, שנתרמו על ידי Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, נתרם על ידי David W. Severson; Culex quinquefasciatus, זן JHB, ביצים, NR-43025. המחבר מודה לד"ר ג'ייק טו, ד"ר נישה דוגאל, ד"ר ג'יימס ווגר וג'פרי מראנו על אספקת ביצי יתושים מסוג Culex quinquefasciatus ו-Anopheles stephensi (זן: ליסטון). Aedes albopictus ו - Toxorhynchites rutilus septentrionalis מופקים מיתושי שדה שנאספו על ידי המחבר באזור עמק הנהר החדש (VA, ארה"ב). עבודה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שולחן אוויר ספסל נקי | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | מפחית רעש |
| לוח אנלוגי לדיגיטלי National | Instruments | BNC-2090A | |
| ספסל Flowbuddy שלם | Genesee Scientific | 59-122BC | כדי להרדים יתושים |
| Borosillicate זכוכית נימי | Sutter מכשיר | B100-78-10 | כדי לבצע את ההקלטה וההפניות לנימים |
| כימיקלים | סיגמא אולדריץ' | בנזלדהיד: 418099-100 מ"ל; חומצה בוטירית: B103500-100 מ"ל; 1-הקסאנול: 471402-100 מ"ל; שמן מינרלי: M8410-1L | כימיקלים המשמשים לניסויים המוצגים כאן |
| CO2 | Airgas או Praxair | N / A | להרדמת יתושים |
| מקור אור קר | Volpi | NCL-150 | |
| מזרקים חד פעמיים | BD | 1 מ"ל (309628) / 3 מ"ל (309657) | |
| כבלי אלקטרודות | World Precision Instruments | 5371 | |
| ג'ל אלקטרודות ללא מלח | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| כלוב פאראדיי | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | מפחית רעש |
| מדי זרימה | Bel-art | 65 מ"מ (H40406-0010) / 150 מ"מ (H40407-0075) | אחד מכל |
| בקבוקונים וכובעים GCMS | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | להכנת דילול ריח |
| מזרקי זכוכית (פורטונה) | Sigma Aldrich | Z314307 | לאספקת ריחות להכנה של EAG |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | מפחית רעש |
| מחזיק שקע 2 מ"מ, צר, 90 מעלות, עם מערכות חוט | A-M | 675748 | מחזיק אלקטרודות |
| בסיסים מגנטיים | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + ארגזי | כליםMathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | לאספקת הפולסים |
| אוויר רפואי | Airgas או Praxair | N/A | לחברת התעופה הראשית |
| מיקרוסקופ | Nikkon | SMZ-800N | |
| מיקרומניפולטורים מיקרומניפולטורים תלת צירים גס/עדין מיקרומניפולטור קומפקטי | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| מגבר מיקרואלקטרודה עם במה ראשונה | מערכות A-M | דגם 1800 | |
| אספקת גידול יתושים | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| מחטים | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| פיפטות פסטר | פישר סיינטיפיק | 13-678-6A | לאספקת ריח לצינורות PTFE של הכנת EAG |
| בקטרים שונים | Mc Master Carr | N / A | לחיבור שסתום סולנואיד, מד זרימה, חברת תעופה וכו'. |
| ספק כוח 30V/5A DC | ד"ר מטר | PS-305DM | |
| R גרסה 3.5.1 | R פרויקט | https://www.r-project.org/ | לניתוחי נתונים |
| ממסר לשסתום סולנואיד | N/A | בהתאמה | |
| 0.01 אינץ' | A-M Systems | 782500 | |
| שסתום סולנואיד (תלת כיווני) | חברת Lee | LHDA0533115H | |
| WinEDR תוכנה | Strathclyde אלקטרופיזיולוגיה תוכנה | WinEDR V3.9.1 | להקלטת EAG |
| נייר Whatman | Cole Parmer | UX-06648-03 | לטעינת כימיקל במזרק זכוכית / פיפטה פסטר |
מקורות
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
