Summary
De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.
Abstract
De juiste ontwikkeling van het zoogdierbrein is afhankelijk van een fijne balans van neurale stamcelproliferatie en differentiatie in verschillende neurale celtypen. Deze balans wordt strak gecontroleerd door genexpressie die op meerdere niveaus is verfijnd, waaronder transcriptie, posttranscriptie en vertaling. In dit opzicht benadrukt een groeiende hoeveelheid bewijs een cruciale rol van translationele regulatie bij het coördineren van beslissingen over het lot van neurale stamcellen. Polysoomfractie is een krachtig hulpmiddel voor de beoordeling van de mRNA-translationele status op zowel globaal als individueel genniveau. Hier presenteren we een interne polysomale profileringspijplijn om de translationele efficiëntie in cellen van de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te beoordelen. We beschrijven de protocollen voor sucrose gradiëntvoorbereiding, weefsellysis, ultracentrifugatie en fractioneringsgebaseerde analyse van de mRNA-translationele status.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling van de hersenen van zoogdieren verspreiden neurale stamcellen zich en differentiëren ze om neuronen en glia1,2 te genereren. De verstoring van dit proces kan leiden tot veranderingen in de hersenstructuur en -functie, zoals te zien is bij veel neuroontwikkelingsstoornissen3,4. Het juiste gedrag van neurale stamcellen vereist de georkestreerde expressie van specifieke genen5. Hoewel de epigenetische en transcriptiecontrole van deze genen intensief is bestudeerd, suggereren recente bevindingen dat genregulatie op andere niveaus ook bijdraagt aan de coördinatie van neurale stamcelproliferatie en differentiatie6,7,8,9,10. Het aanpakken van de translationele controleprogramma's zal dus ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de beslissing over het lot van neurale stamcellen en de ontwikkeling van de hersenen aanzienlijk bevorderen.
Drie hoofdtechnieken met verschillende sterktes zijn op grote schaal toegepast om de translationele status van mRNA te beoordelen, waaronder ribosoomprofilering, het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) en polysoomprofilering. Ribosoomprofilering maakt gebruik van RNA-sequencing om ribosoombeveiligde mRNA-fragmenten te bepalen, waardoor de globale analyse van het aantal en de locatie van het vertalen van ribosomen op elk transcript indirect de vertaalsnelheid kan afleiden door het te vergelijken met transcriptie overvloed11. TRAP maakt gebruik van epitoop-gelabelde ribosomale eiwitten om ribosoomgebonden mRNAs te vangen12. Aangezien de gelabelde ribosomale eiwitten kunnen worden uitgedrukt in specifieke celtypen met behulp van genetische benaderingen, maakt TRAP de analyse van vertaling op een celtypespecifieke manier mogelijk. Ter vergelijking, polysoomprofilering, waarbij sucrosedichtheidsgradiëntfractie wordt gebruikt om vrije en slecht vertaalde porties (lichtere monosomen) te scheiden van die welke actief worden vertaald door ribosomen (zwaardere polysomen), biedt een directe meting van de ribosoomdichtheid op mRNA13. Een voordeel van deze techniek is de veelzijdigheid om de vertaling van specifiek mRNA van belang te bestuderen, evenals genoombrede vertaalanalyse14.
In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol van polysomale profilering om de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te analyseren. We gebruiken een zelfgeassembleerd systeem om sucrosedichtheidsgradiënten voor te bereiden en fracties te verzamelen voor downstreamtoepassingen. Het hier gepresenteerde protocol kan eenvoudig worden aangepast om andere soorten weefsels en organismen te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het diergebruik werd gecontroleerd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Calgary. CD1-muizen die voor het experiment werden gebruikt, werden gekocht bij de commerciële leverancier.
1. Voorbereiding van oplossingen
OPMERKING Om RNA-afbraak te voorkomen, moet u de werkbank en alle apparatuur met RNase-ontsmettingsoplossing spuiten. Voor het experiment worden RNase-vrije tips gebruikt. Alle oplossingen worden bereid in RNase-vrij water.
- Bereid cycloheximide voorraadoplossing (100 mg/ml) in DMSO en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 2,2 M sacharosevoorraadoplossing door 75,3 g sacharose toe te voegen aan RNase-vrij water en het volume bij te vullen tot 100 ml (voor ~16 gradiëntvoorbereiding). De oplossing kan op -20 °C worden bewaard voor langdurige opslag.
- Bereid 10x zoutoplossing (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2).
- Bereid 60% (w/v) sucrose chase-oplossing, die 30 g sacharose, 5 ml 10x zoutoplossing bevat en vul het volume aan tot 50 ml met RNase-vrij water.
- Voeg eventueel een vlekje bromofenolblauw of ongeveer 5 μL 1% bromoffenolblauw in RNase-vrij water toe aan de chase-oplossing. 1.6. Bewaar oplossingen bij 4 °C.
2. Voorbereiding van sacharosegradiënt
OPMERKING: Nauwkeurigheid bij de voorbereiding van sacharosegradiënten is van cruciaal belang voor het verkrijgen van consistente en reproduceerbare resultaten.
- Om zes 10-50% sacharosegradiënten te bereiden, verdun 2,2 M sacharoseoplossing zoals in tabel 1.
| Sucrose-oplossing | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 M sucrose | 2 ml | 4 ml | 6 ml | 8 ml | 10 ml |
| 10X zoutoplossing | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml |
| Cycloheximide | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| Water | 11,5 ml | 9,5 ml | 7,5 ml | 5,5 ml | 3,5 ml |
| Totaal volume | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml |
Tabel 1: Sacharoseverdunningen voor preparaten van sacharosegradiënten.
OPMERKING: Bereid sucrosegradiënten altijd in veelvouden van twee voor om het gewicht tijdens ultracentrifugatie in evenwicht te brengen.
- Veeg de metalen stompe eindnaald af met RNase decontaminatieoplossing. Spoel de ultracentrifugebuizen, slangen en de spuit kort af met RNase-vrij water. Droog de buizen aan de lucht zodat er geen waterdruppel in de buizen achterkomt, omdat het resterende water de sacharoseconcentratie zal veranderen.
- Plaats de metalen naald op de klemhouder en de centrifugebuis op het gemotoriseerde podium. Om gradiënten consistent voor te bereiden, werd een zelfgemonteerd systeem gebruikt dat een gemotoriseerde fase bevat om de ultracentrifugebuis vast te houden en een spuitpomp om sacharoseoplossingen te injecteren(figuur 1,zie stap 9 voor meer informatie).
- Vul een spuit van 30 ml met ~16 ml 10% sacharose (genoeg voor zes verlopen), plaats deze op de spuitpomp en sluit deze aan op de naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit, slang en naald zitten. Veeg de punt van de naald af om eventuele restoplossing te verwijderen.
- Beweeg het gemotoriseerde podium zo omhoog dat de punt van de naald het midden van de buis aan de onderkant raakt.
- Stel de spuitpomp in op een debiet van 2 ml/min voor een volume van 2,3 ml.
- Na het doseren van 2,3 ml 10% sacharoseoplossing, gaat u de gemotoriseerde fase in en herhaalt u het proces voor alle zes gradiënten.
- Herhaal stap 2.4-2.7 om 20% sacharoseoplossing aan de onderkant van de buizen toe te voegen, gevolgd door 30%, 40% en 50% sacharoseoplossingen op dezelfde manier.
- Sluit na de bereiding van de gradiënt de ultracentrifugebuis af met een paraffinefilm.
- Laat de buizen 's nachts bij 4 °C staan, zodat de verschillende sacharoselagen samen diffuus zijn om een continue gradiënt te geven.
3. Weefseldissectie
OPMERKING: Zwangere muizen werden geëuthanaseerd door cervicale dislocatie voorafgegaan door anesthesie met 5% isofluraan.
- Verzamel CD1-muisembryo's op embryonale dag 12, of indien nodig andere tijdspunten, en plaats embryo's in een Ø 10 cm plaat met ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
- Breng onder dissectiebereik één embryo over op een plaat van Ø 6 cm met ijskoude HBSS.
- Gebruik naalden van 21-23 G om de positie van het hoofd te bevestigen door onder een hoek van ongeveer 45° door de ogen te penetreren en kracht uit te brengen om ervoor te zorgen dat de naalden op de plaat zijn bevestigd (afbeelding 2A).
- Gebruik no.5 tang om huid en schedel te verwijderen, van het midden naar de zijkanten.
- Gebruik een tang om de olfactorische bollen te snijden en de hersenvliezen te verwijderen om de corticale weefsels bloot te leggen.3.6.Gebruik gebogen tangen om de corticale weefsels in 2-3 ml neurobasaal medium op ijs te snijden (Figuur 2B). Pool corticale weefsels van verschillende embryo's indien nodig. Weefsels van 8-10 embryo's geven meestal ~200 μg totaal RNA.
4. Cellysis
- Bereid op de dag van weefseldissectie een nieuwe cellysebuffer voor zoals beschreven in tabel 2.
| oplossing | Eindconcentratie | volume |
| Tris-HCl (pH 7,5) | 20 mM | 100 μL |
| Kcl | 100 mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| Triton X-100 | 1% (v/v) | 500 μL |
| Natriumdeoxycholaat | 0,5% (w/v) | 500 μL |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 mM | 5 μL |
| Cycloheximide | 100 μg/ml | 5 μL |
| RNase vrij water | Opvullen tot 5 ml | |
| totaal | 5 ml | 5 ml |
Tabel 2: Bereiding van polysoomlysebuffer.
OPMERKING: Vul de lysisbuffer aan met protease- en fosfataseremmers.
- Voeg cycloheximide toe aan het neurobasale medium met ontlede weefsels tot een eindconcentratie van 100 μg/ml en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C. Cycloheximide blokkeert de verlenging van de vertaling en voorkomt daarom ribosoom afvloeiing 15.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Was de weefsels tweemaal met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 100 μg/ml cycloheximide.
- Voeg 500 μL cellysebuffer toe, aangevuld met 4 μL RNase-remmer. Pipetteer op en neer om het weefsel in de lysisbuffer te resuspenderen. Gebruik een insulinenaald om het weefsel voorzichtig te lyseren.
- Incubeer de weefsels gedurende 10 minuten op ijs met korte vortexing elke 2-3 minuten.
OPMERKING: Om weefselafbraak te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat alle stappen van weefsellyse op ijs worden uitgevoerd. - Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis op ijs.
- Centrifugeer bij ~13.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis op ijs.
- Meet de RNA-concentratie in het weefsellysaat met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.
OPMERKING: Als er meerdere monsters in het experiment zijn opgenomen, verdun de monsters dan tot dezelfde concentratie met een extra cellysebuffer om variatie te minimaliseren.
5. Monsterbelasting en ultracentrifugatie
- Koel de ultracentrifugatierotor en zwenkbakken vooraf af op 4 °C en stel de temperatuur van de ultracentrifuge in op 4 °C.
- Houd 20 μL van het weefsellysaat als totale RNA-input.
- Bemonsteringsmonsters (50-300 μg RNA met een gelijk volume) op de bovenkant van de sacharosegradiënten door het lysaat langzaam aan de wanden van de ultracentrifugebuizen te doseren.
- Plaats de ultracentrifugebuizen voorzichtig in de schommelemmer. Zorg ervoor dat alle diametraal tegenover elkaar geplaatste emmers in evenwicht zijn.
- Laad de zwenkemmers op de rotor. Zet de ultracentrifuge gedurende 90 minuten op 190.000 x g (~39.000 tpm) bij 4 °C.
- Plaats de hellingen voorzichtig op ijs na centrifugeren.
6. Fractionering en monsterverzameling
OPMERKING: Voor de analyse en het verzamelen van monsters uit de gradiënten wordt een zelfgeassembleerd fractionerings-, opname- en verzamelsysteem gebruikt(figuur 3, zie Apparaatcomponenten).
- Plaats een lege ultracentrifugebuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem.
- Schakel de UV-monitor in en open de digitale signaalopnamesoftware.
- Vul een spuit van 30 ml met 25 ml 60% sucrose chase-oplossing. Druk voorzichtig op de spuit zodat de chase-oplossing de lege buis vult en door de 254 nm UV-monitor gaat om de basislijn voor detectie in te stellen.
- Druk op auto-zero op de UV-monitor om een basislijn voor detectie te registreren. Druk op afspelen op de software om te beginnen met opnemen.
- Zodra het systeem een basislijn heeft vastgesteld, pauzeert u de opname op de software en trekt u de chase-oplossing in. Zorg ervoor dat er geen restachtervolgingsoplossing in het systeem achter blijft.
OPMERKING: Spoel het systeem af met RNase-vrij water om resterende sacharoseoplossingen uit de vorige run te verwijderen. - Plaats één monsterbuis in de buispiercing. Penetreer voorzichtig de buis met de naald vanaf de onderkant.
- Begin met opnemen op de software. Start de spuitpomp (debiet van 1 ml/min voor een volume van 25 ml) en de fractiecollector om polysomale fracties te verzamelen. Stel fractionatorinstellingen in op 30 s.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er voor elke run geen luchtbellen in de spuit of de slang zitten door zachtjes op de spuit te drukken om de achtervolgingsoplossing continu door de naald te laten stromen. - Verzamel de fracties in buizen van 1,5 ml (elk 500 μL) met behulp van een fractiecollector.
- De fracties kunnen onmiddellijk worden verwerkt of opgeslagen bij -80 °C.
- Spoel het systeem na het verzamelen van de fractie af met RNase-vrij water om eventuele resten sacharose te verwijderen.
7. Extractie van RNA
- Voeg aan elke fractie 10 ng luciferase mRNA spike-in control toe.
- Voeg drie volumes guanidium hydrocholride gebaseerd commercieel RNA isolatiereagens toe aan elke fractie.
- Vortex kort gedurende 15 s.
- Extract RNA met behulp van een RNA-extractiekit die compatibel is met de oplossing die in 7.2 wordt gebruikt.
8. Omgekeerde transcriptie en real-time PCR
- Meet de concentratie van het RNA met behulp van UV-Vis spectrofotometer.
- Onderwerp RNA aan omgekeerde transcriptie met behulp van een cDNA-synthesekit, volgens het protocol van de fabrikant.
- Gebruik kwantitatieve real-time PCR (qPCR) om de polysomale verdeling van gapdh mRNA als voorbeeld te onderzoeken. qPCR werd uitgevoerd met behulp van een qPCR-detectiesysteem en een qPCR mastermix-reagens, met de volgende cyclusomstandigheden: 95 °C gedurende 10 minuten, vervolgens 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C voor 30 s, 72 °C gedurende 40 s, gevolgd door 95 °C gedurende 60 s.
- Verkrijg drempelwaarde (Ct) waarden uit de versterkingspercelen en gebruik deze om vouwverandering te berekenen met behulp van de ΔΔCt-methode.
9. Sucrose gradiënt maken systeemassemblage
OPMERKING: Volg de stappen om elk onderdeel (zoals beschreven in tabel 3) van de sacharosegradiëntmaker (figuur 1) te monteren.
- Monteer twee verticale beugels (A2) op de plint (A1).
- Gebruik twee slanke haakse beugels (B2) om de lineaire trapactuator op de plint (A1) te monteren.
- Gebruik de setcrew op de Ø12,7 mm aluminium paal (C2) om deze op de buishouder plint (C1) te bevestigen als standaard voor de buishouder.
- Monteer de haakse Ø1/2" tot Ø6 mm paalklem (C3) met de paal (C2) en de optische post uit de miniserie (C4).
- Gebruik de stelschroef op de optische paal (C4) om een kleine V-klem (C5) als buishouder aan te sluiten.
- Plaats een centrifugebuis in de buishouder en pas de hoek aan om deze verticaal te maken. Markeer de positie van de buis en monteer de voetstukpenhouder (C6) op de plint (C1) om de buis te ondersteunen.
- Gebruik aan de andere kant van het breadboard (A1) de stelschroef van de Ø12,7 mm aluminium paal (D1) om deze te bevestigen en sluit een optische paal uit de miniserie (D3) aan met behulp van een haakse Ø1/2" tot Ø6 mm paalklem (D2).
- Sluit de miniatuur V-klem (D4) met stompe naald (D5) aan op de paal (D3). Pas de hoek van de klem aan om de naald verticaal in te stellen en pas de lengte van de paal aan om ervoor te zorgen dat de naald de centrifugebuis ontmoet.
- Sluit de actuator (B1) aan op de stappenmotordriver (E1) en gebruik de UNO R3-controllerkaart en de joystickmodule uit de UNO-starterkit (E2) om de actuator te bedienen. Een voedingsadapter (bijv. 9-24 V AC/DC verstelbare voedingsadapter) kan worden gebruikt om de motor afzonderlijk aan te drijven.
- Plaats de spuitpomp (F) naast het verloopvormingsstation en sluit de spuit aan op de naald.
- Bedien de buishoudertrap op en neer met behulp van de joystick.
| bestanddeel | item |
| B1 | Lineaire stadiumactuator |
| E1 | Stappenmotor bestuurder |
| E2 | UNO project super starter kit |
| A1 | broodplank |
| A2 | Verticale beugel |
| B2 | Slanke haakse beugel |
| C1 | Mini-serie breadboard |
| C5 | Kleine V-klem |
| D4 | Miniatuur V-klem |
| C2 | Ø12,7 mm aluminium paal |
| C4, D3 | Mini-serie optische post |
| D1 | Ø12,7 mm aluminium paal |
| C3, D2 | Haakse Ø1/2" tot Ø6 mm paalklem |
| C6 | Mini-serie voetstuk posthouder basis |
| D5 | Stompe eindnaald |
| F. | Spuitpomp |
Tabel 3: Verloop maken van systeemcomponenten.
10. Fractioneren en detecteren van systeemassemblage (figuur 2).
- Gebruik een gewone ronde kaak buretklem om de optiekmodule van de UV-monitor op de buispiercing te monteren. Bevestig het ene uiteinde van de slang (1 cm lang en 0,56 mm inwendige diameter) aan de verbindingskabel van de buispiercing en het andere uiteinde aan de fluid in-poort van de optiekmodule. Sluit de Fluid Out-poort aan op de fractionator.
- Sluit de optiekmodule aan op de besturingseenheid van de UV-monitor volgens de handleiding van de fabrikant.
- Gebruik een breakout-kabel om de signaaluitgangsaansluiting aan te sluiten op de digitale converter aan de grond- en analoge ingangsaansluitingen, volgens de handleiding van de fabrikant.
- Sluit de digitale converter aan op een laptop met behulp van een gewone USB-kabel en neem de geconverteerde digitale signalen op met behulp van software voor gegevensverzameling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als demonstratie werd het corticale lysaat met 75 μg RNA (gepoold uit 8 embryo's) gescheiden door de sacharosegradiënt in 12 fracties. Pieken van UV-absorptie bij 254 nm geïdentificeerde fracties die de 40S-subeenheid, 60S-subeenheid, 80S-monosomen en polysomen bevatten (figuur 4A). Analyse van breuken door westelijke vlek voor de grote ribosomale subeenheid, Rpl10 toonde zijn aanwezigheid in de 60S subeenheid (breuk 3), monosomen (breuk 4) en polysomen (fracties 5-12) (Figuur 4B). Cytoplasmatische eiwitten Gapdh en Csde1 werden daarentegen niet geassocieerd met ribosomen, maar werden verrijkt in fracties die vrij RNA (fractie 1) bevatten (figuur 4B). In overeenstemming met de scheiding van eiwitten in verschillende fracties, ontdekten we dat gapdh en sox2 mRNAs sterk verrijkt waren in de fracties die zware polysomen bevatten (meer dan drie ribosomen in fracties 7-12), wat suggereert dat gapdh en sox2 mRNAs efficiënt worden vertaald in de zich ontwikkelende cortex (Figuur 4C,D). Rpl7 en rpl34 mRNAs daarentegen werden verrijkt in de fractie die monosomen bevatte, wat wijst op onderdrukte vertaling (figuur 4E, F)16. Deze resultaten bevestigden ons polysomenfractieprotocol.
Figuur 1: Opstelling voor de voorbereiding vande sucrosegradiënt. (A) In eigen huis gemonteerde sucrose gradiëntmaker bestaande uit een lineaire stadiumactuator, een buishouder op het gemotoriseerde podium, een set podiumcontrollers, een metalen stompe naald gemonteerd op een naaldhouder en een geautomatiseerde spuitpomp met een spuit die op de naald is aangesloten (zie tabel 3). (B) Om de sacharosegradiënt voor te bereiden, wordt de ultracentrifugebuis in de buishouder geplaatst. Sucrose-oplossingen worden via de stompe naald met behulp van een spuitpomp afgegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Dissectie van de corticale weefsels van het ontwikkelingsmuisembryo. (A) Afbeelding met een E12.5 CD1 embryo bevestigd op een Ø 6 cm plaat met behulp van 21G-23G naalden. (B) Afbeelding van de ontlede cortex na verwijdering van de huid, schedel en hersenvliezen (gemarkeerd met witte stippellijnen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Opstelling voor fractioneren, opnemen en monster verzamelen. Afbeelding van het thuisgemonteerde fractionerings-, opname- en monsterverzamelingssysteem bestaande uit een geautomatiseerde spuitpomp, een buispiercing, een fractiecollector en een UV-monitor met een digitale convertor aangesloten op een laptop voor de continue bewaking van UV-absorptie. Data-acquisitie wordt afgehandeld door de commerciële data-acquisitie software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Polysoomprofileringsanalyse van de zich ontwikkelende muisschors. (A) UV-absorptie met breuken die vrij RNA (fractie 1), 40S subunit (fractie 2), 60S subunit (fractie 3), 80S monosomen (fractie 4) en polysomen (fractie 5-12) bevatten. Er werd 75 μg totaal RNA gebruikt, gepoold uit 8 embryo's. (B) Westelijke vlekken die de verdelingen van Gapdh-, Rpl10- en Csde1-eiwitten in fracties weergeven. qPCR-analyse die de verdeling van gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) en rpl34 (F) mRNAs in fracties weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysomale profilering is een veelgebruikte en krachtige techniek om de translationele status te beoordelen op zowel single gene als genoombrede niveaus14 . In dit rapport presenteren we een protocol van polysomenprofilering met behulp van een thuisgeassembleerd platform en de toepassing ervan om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Dit kosteneffectieve platform is eenvoudig te monteren en genereert robuuste, reproduceerbare sacharosegradiënten en polysoomprofilering met hoge gevoeligheid.
Het is vermeldenswaardig op te merken dat de voorbereiding van consistente en kwalitatief goede sacharosegradiënten van cruciaal belang is om reproduceerbare polysoomprofileringsresultaten te verkrijgen17. Veranderingen in het volume van 10-50% sacharoseoplossingen tijdens de voorbereiding van de gradiënt kunnen leiden tot de verschuiving van de polysomenpieken en inconsistentie van de resultaten in downstreamanalyse. Bovendien kan het verstoren van de gradiënt tijdens het inbrengen en verwijderen van de naald bijdragen aan de inconsistentie van de gradiëntvoorbereiding. In vergelijking met andere benaderingen en commerciële apparaten gebruikte ons zelfgemaakte verloopsysteem een gemotoriseerde fase om verstoring van hellingen tijdens de bereiding te verminderen en een spuitpomp om sacharose-oplossingen nauwkeurig af te geven, wat een goedkope en eenvoudige oplossing biedt voor gradiëntvoorbereiding.
Door het polysoomprofileringsplatform en het hier aanwezige protocol toe te passen op de zich ontwikkelende muisschors, ontdekten we dat het ribosomale eiwit Rpl10 en cytoplasmatische eiwitten Gapdh en Csde1 in de juiste fracties werden verdeeld. Bovendien werden de sterk vertaalde gapdh- en sox2-mRNAs verrijkt in polysomale fracties, terwijl translationeel onderdrukte rpl34- en rpl7-mRNAs minder verrijking vertoonden in polysomen, die ons platform en protocol valideren. Met een vergelijkbare aanpak kan de translationele status van andere genen in de zich ontwikkelende cortex individueel worden bepaald door real-time PCR. Van belang, polysomale profilering is gebruikt om de translationele status in de zich ontwikkelende hersenen op genoombreed niveau te analyseren. In dit verband kunnen fracties die polysomen bevatten worden gecombineerd en kan RNA worden geëxtraheerd met behulp van diepe sequencing. Het hier aanwezige platform en protocol kunnen worden aangepast en verder worden geoptimaliseerd om te voldoen aan vertaalstudies met behulp van andere celtypen en weefsels. Gezien de beschikbaarheid van corticale weefsels die worden beperkt door experimentele omstandigheden (bv. <50 μg RNA), kan aanvullende optimalisatie van het protocol verdere verhogingen van de efficiëntie en reproduceerbaarheid van de experimenten opleveren.
Hoewel polysoomprofilering inzicht geeft in de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende cortex, heeft het beperkingen om specifieke celtypen te analyseren in latere ontwikkelingsfasen, wanneer verschillende neurale celtypen aanwezig zijn. Om deze vraag te beantwoorden, kan polysoomprofilering worden geïntegreerd met TRAP door pull-down van epitoop gelabeld ribosomale eiwit uitgedrukt onder een weefselspecifieke promotor11.
Concluderend, het platform en protocol dat we hier rapporteren voor het maken en fractioneren van sacharosegradiënten bieden een economische oplossing voor polysomenprofileringsexperimenten in de context van hersenontwikkeling en andere biologische contexten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.). G.Y. is een Canada Research Chair. S.K. werd gefinancierd door Mitacs Globalink Graduate Fellowship en ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
