Здесь мы представляем протокол для микроскопии ионной проводимости Hopping Probe (HPICM), бесконтактного метода сканирования, который позволяет наноразмерную визуализацию пучков стереоцилий в живых слуховых волосковых клетках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация пучка стереоцилий с наноразмерным разрешением в слуховых волосковых клетках живых млекопитающих
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Волосковые клетки внутреннего уха обнаруживают звуковые смещения и преобразуют эти стимулы в электрические сигналы в пучке волос, который состоит из стереоцилий, расположенных в рядах увеличивающейся высоты. Когда стереоцилии отклоняются, они тянут крошечные (~ 5 нм в диаметре) внеклеточные кончиковые звенья, соединяющие стереоцилии, которые передают силы механочувствительным каналам трансдукции. Хотя механотрансдукция изучалась в живых волосковых клетках в течение десятилетий, функционально важные ультраструктурные детали механотрансдукционного механизма на кончиках стереоцилий (такие как динамика кончиковых звеньев или трансдукционно-зависимое ремоделирование стереоцилий) все еще могут быть изучены только в мертвых клетках с помощью электронной микроскопии. Теоретически, методы сканирования зондов, такие как атомно-силовая микроскопия, имеют достаточное разрешение для визуализации поверхности стереоцилий. Однако, независимо от режима визуализации, даже малейший контакт зонда атомно-силовой микроскопии со пучком стереоцилий обычно повреждает пучок. Здесь мы представляем подробный протокол для микроскопии ионной проводимости прыжкового зонда (HPICM) визуализации слуховых волосковых клеток живых грызунов. Этот бесконтактный метод сканирования зонда позволяет проводить покадровую визуализацию поверхности живых клеток со сложной топографией, такой как волосковые клетки, с разрешением в один нанометр и без физического контакта с образцом. HPICM использует электрический ток, проходящий через стеклянную нанопипетку, для обнаружения поверхности ячейки в непосредственной близости от пипетки, в то время как пьезоэлектрическая система 3D-позиционирования сканирует поверхность и генерирует ее изображение. С помощью HPICM мы смогли визуализировать пучки стереоцилий и звенья, соединяющие стереоцилии в живых слуховых волосковых клетках в течение нескольких часов без заметных повреждений. Мы ожидаем, что использование HPICM позволит непосредственно исследовать ультраструктурные изменения в стереоцилиях живых волосковых клеток для лучшего понимания их функции.
Введение
Несмотря на то, что пучки стереоцилий в слуховых волосковых клетках достаточно велики, чтобы их можно было визуализировать оптической микроскопией и отклонять в живых клетках в эксперименте с зажимом, основные структурные компоненты механизма трансдукции, такие как кончиковые звенья, могут быть изображены только с помощью электронной микроскопии в мертвых клетках. В слуховых волосковых клетках млекопитающих механизм трансдукции расположен на нижних концах кончиковых звеньев, т. е. на кончиках стереоцилий более короткого ряда1 и регулируется локально через сигнализацию на кончиках стереоцилий2,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальными институтами здравоохранения. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Кентукки (протокол 00903M2005).
1. Производство и тестирование нанопипет
- Создайте программу в съемнике микропипетки для получения пипеток с сопротивлением от 200 до 400 МОм, что соответствует внутренним диаметрам наконечника примерно 50-70 нм. Параметры будут зависеть от съемника микропипетки. Чтобы получить короткие пи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, представленный в данной работе, может быть использован для визуализации любых живых клеток со сложной топографией. Следуя этим шагам, мы обычно получаем изображения живых слуховых пучков волосковых клеток крыс(рисунок 6B,D). Несмотря на более низкое разрешение X-Y по сравнению с изображениями SEM, наши изображения HPICM могут успешно разрешать различные ряды стереоцилий, форму кончиков стереоцилий и даже небольшие звенья (~ 5 нм в диаметре), соединяющие соседние ст.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для получения успешных изображений HPICM пользователям необходимо установить систему с низким уровнем шума и вибрации и изготовить соответствующие пипетки. Мы настоятельно рекомендуем использовать калибровочные стандарты AFM для проверки стабильности системы перед попыткой выполнения любой визуализации живых клеток. После тестирования разрешения системы пользователи могут рассмотреть возможность визуализации неподвижного органа образцов Корти, чтобы ознакомиться с настройками визуализации, прежде чем пытаться получить ка.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Мы благодарим профессора Юрия Корчева (Имперский колледж, Великобритания) за долгосрочную поддержку и консультации на всех этапах проекта. Мы также благодарим докторов Павла Новака и Андрея Шевчука (Имперский колледж, Великобритания), а также Олега Белова (Национальный исследовательский центр аудиологии, Россия) за помощь в разработке программного обеспечения. Исследование было поддержано NIDCD/NIH (R01 DC008861 и R01 DC014658 до G.I.F.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аналоговый осциллограф | B& K Precision | 2160C | Аналоговый осциллограф для мониторинга тока нанопипеток в режиме реального времени и стандартов калибровки |
| АСМ ПО | PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | Эти калибровочные стандарты 100 и 20 нм используются для проверки производительности системы HPICM |
| Настольный виброизолятор | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Активная виброизоляция |
| Капилляры из боросиликатного стекла | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Капилляры из боросиликатного стекла для нанопипеток |
| D-(+)-глюкоза | Sigma-Aldrich | G8270 | Будет добавлено в ванну решение для регулировки осмолярности |
| Дигитайзер | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Многоканальный вход/выход Дигитайзер |
| Быстрый аналоговый пропорционально-интегрально-производный (ПИД) контроль для движения по оси Z | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Измерительные модули интегрированы во внешний ПИД-регулятор для движения по оси Z. Он требует быстрого отклика, который обычно не реализован в коммерческих пьезоусилителях. |
| Клетка Фарадея | AMETEK/TMC | Type II | Требуется для экранирования электромагнитных помех |
| Стеклянное дно тарелки | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Используется в качестве тарелки для камеры для ткани |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Внеклеточный (ванночный) раствор |
| Измерительный усилитель | Brownlee Прецизионный | модели 440 | обеспечивает требуемые смещения, фильтрацию и вторичное увеличение или ослабление |
| Лазерный вытягиватель микропипеток | Sutter Instrument | P-2000/G | Съемник микропипеток для изготовления нанопипеток. Лазер нужен для острых кварцевых пипеток. |
| Lebovitz's L-15, без фенола красного | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Внеклеточный (ванночный) раствор |
| Микроманипулятор | Scientifica | PatchStar | Используется для «курсового» позиционирования Z-пьезоактуатора |
| Микроскоп Nikon | Eclipse TS100 | Инвертированный оптический микроскоп | |
| Патч-усилитель | Молекулярные устройства | Axopatch 200B | Усилитель патч-клещей измеряет ток через нанопипетный |
| пьезоусилитель (оси XY) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509. C2A | Усилитель и ПИД-управление для пьезоусилителя XY пьезотрансляционного каскада |
| Пьезоусилитель (ось Z) | Пьезосистема jena | ENT 400 & 800 | Пользовательский усилитель, состоящий из источника питания ENT 400 и двух усилителей ENT 800 параллельно для достижения максимального тока 1,6 нА |
| Пластиковые покровные стекла | TED PELLA Inc | 26028 | Используются при изготовлении камер для тканей |
| Контроллер и программное обеспечение SICM* | Ionscope, Великобритания (ionscope.com) | N/A | Пользовательский контроллер на основе SBC6711 платы цифровой обработки сигналов от Innovative Integration Ltd |
| Силиконовый эластомер (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Используется для крепления гибких стеклянных волокон к камере для ткани |
| Силиконовый клей | The Dow Chemical Company | 734 | Используется для склеивания различных частей камеры для ткани |
| Вольфрамовый стержень | A-M Systems | 717500 | Используется для удержания нитей зубной нити в камере для ткани |
| XY пьезо-нанопозиционер | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY трансляционный столик с емкостными датчиками |
| Z пьезо-нанопозиционер | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring пьезоактуатор с тензодатчиком |
| *Ionscope больше не продает отдельные контроллеры SICM. Существует несколько других коммерческих систем: NX12-Bio и NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Корея и модули SICM от ICAPPIC Limited, Великобритания (icappic.com). Все эти системы основаны на оригинальных... | |||
| Принципы HPICM. Тем не менее, визуализация пучков стереоцилии в волосковых клетках требует нескольких пользовательских модификаций, которые технически | |||
| сложная (или даже невозможная) в замкнутом « Готово к работе» системы, такие как Ionscope или NX12-Bio/NX10. В настоящее время существует только один | |||
| модульная система (ICAPPIC), которая обладает гибкостью, подходящей для любого эксперимента SICM/HPICM, но требует некоторой интеграции компонентов. |
Ссылки
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
