Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.
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Artigo de método
Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito
Neste artigo
Resumo
Resumo
A desregulação epitelial é um nó para uma variedade de condições e doenças humanas, incluindo ferimentos crônicos, inflamação e mais de 80% de todos os cânceres humanos. Como tecido forro, o epitélio da pele é frequentemente sujeito a lesões e tem se adaptado evolutivamente adquirindo a plasticidade celular necessária para reparar tecido danificado. Ao longo dos anos, vários esforços foram feitos para estudar a plasticidade epitelial usando modelos in vitro e ex vivo baseados em células. No entanto, esses esforços têm sido limitados em sua capacidade de recapitular as várias fases da plasticidade celular epitelial. Descrevemos aqui um protocolo para a geração de esferoides epidérmicos 3D e células derivadas de esferoides epidérmicos de queratinócitos humanos neonatais. Este protocolo descreve a capacidade das culturas eferóides epidérmicas de modelar funcionalmente estágios distintos da plasticidade generativa de queratinócitos e demonstra que a re-platide epidérmica pode enriquecer culturas heterogênicas normais de queratinócitos (NHKc) para subpopulações intenα6hi/EGFRlo queraatinóte com características avançadas de tronco. Nosso relatório descreve o desenvolvimento e manutenção de um sistema de alto rendimento para o estudo da plasticidade da queratinócito da pele e da regeneração epidérmica.
Introdução
O epitélio estratificado dos mamíferos é a arquitetura epitelial mais complexa em todos os sistemas vivos e está frequentemente sujeito a danos e lesões. Como um tecido protetor, o epitélio estratificado evoluiu para gerar uma resposta complexa e eficaz de danos teciduais. Após a lesão, essas células devem ativar programas de plastifica de linhagem, que permitem migrar para o local lesionado e realizar o reparo1,2,3. Essa resposta multifacetada ocorre em várias etapas sequenciais que permanecem mal compreendidas.
Um grande obstáculo no estudo do in....
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Protocolo
O protocolo de coleta e manuseio de amostras de pele e isolamento de queratinócitos humanos foi revisado pela Universidade da Carolina do Sul (UofSC) IRB e classificado como "pesquisa não envolvendo seres humanos", pois os espécimes de prepúcio eram descartes cirúrgicos produzidos durante procedimentos cirúrgicos de rotina (circuncisão de meninos recém-nascidos) e eram completamente desprovidos de identificação de informações. O protocolo também foi revisado e aprovado pelo Comitê de Biossegurança da UofSC regularmente, e todos os funcionários do laboratório foram submetidos a treinamento de biossegurança laboratorial. Todos os procedimentos foram realizados em concor....
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Resultados
Durante o ensaio da epidermófera da pele, as culturas NHKc são semeadas em poços revestidos de agarose de uma placa de 96 poços(Figura 1A). As células formadoras de esferoides devem se auto-agregar dentro de 48h. A formação de esferoides autônomos pode ser avaliada a partir de 24 horas usando um microscópio de contraste de fase invertido padrão. formação da epidermófera da pele e re-plating modelo de ensaio várias fases da regeneração do tecido epidérmico(Figura 1B
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Discussão
O uso de sistemas de cultura esferoide 3D tem tido ampla utilidade na avaliação da haste celular. Esses sistemas têm sido demonstrados para melhorar o enriquecimento das células-tronco teciduais13, mas sua utilidade para o estudo de células-tronco epidérmicas humanas tem sido explorada limitadamente. Aqui, descrevemos uma estratégia para enriquecer células-tronco de queratinócitos humanos usando técnicas de cultura 3D. Neste sistema, o NHKc é cultivado como suspensões eferóides multicelulares auto.......
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Divulgações
Os autores não têm relações financeiras para divulgar.
Agradecimentos
A UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) forneceu acesso a equipamentos de triagem de imagens e células e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão 1R21CA201853. O MCF e o IRF recebem apoio parcial da concessão do NIH P20GM103499, SC INBRE. O MCF também recebe apoio da concessão do NIH P20GM109091. Yvon Woappi foi apoiado em parte por bolsas nih 2R25GM066526-06A1 (PREP) e R25GM076277 (IMSD), e por uma Bolsa pelo Programa de Professores Grace Jordan McFadden da UofSC. Geraldine Ezeka e Justin Vercellino foram apoiados por bolsas NIH 2R25GM06526-10A1 (PREP) na UofSC. Sean M. Bloos foi apoiado pelo Prêmio Magellan Sc....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Plataforma Affymetrix | Affymetrix | Para experimentos de microarray | |
| Affymetrix ' s HuGene-2_0-st arquivo de biblioteca | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | Para experimentos de microarray | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Usado para isolamento de RNA |
| Console de Análise Software versão 3.0.0.466 | analisa respostas transcricionais específicas do tipo de célula usando análise de variância unidirecional entre sujeitos | ||
| BD FACSAria II citômetro de fluxo | Beckman | Para citometria de fluxo | |
| Console Software versão 3.0.0.466/Console de expressão Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Para confirmar a qualidade dos dados | |
| Citoqueratina 14 | Santa Cruz Biotecnologia | sc-53253 | diluição 1:200 |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Para meios celulares |
| anti-integrina&alfa conjugada com FITC; 6 | Abcam | ab30496 | Para análise FACS |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Para confirmar a qualidade dos dados | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Para lavagem e coloração de matrizes hibridizadas | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Para hibridização e amplificação de RNA total | |
| Forno de Hibridização GeneChip 640 | Thermo Fisher Scientific | Para hibridização e amplificação de RNA total | Amplificar amostras rotuladas | |
| GeneChip Hybridization Wash e Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Para lavagem e coloração de matrizes hibridizadas | |
| Sistema GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning matrizes hibridizadas | |
| Kit de reagentes GeneChip WT PLUS | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Para amplificação de RNA total biotinilante | |
| Fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos (hFGF basic/FGF2) | Cell Tecnologia de sinalização | 8910 | para meios celulares |
| Fator de crescimento epidérmico humano (hEGF) | Tecnologia de sinalização celular | 8916 | para meios celulares |
| Insulina humana | Millipore Sigma | 9011-M | Para meios celulares |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | usado para RT-qPCR |
| Kit de síntese de cDNA iScript | Bio-Rad | 1708890 | usado para RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina, 20 ng/ml de EGF, 10 ng/ml fator básico de crescimento de fibroblastos, 0,4% de albumina de soro bovino (BSA) e 4 µ g/ml de insulina |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Suplementado com 1% de Penicilina/Estreptomicina, 20 ng/ml de EGF, 10 ng/ml fator básico de crescimento de fibroblastos, 0,4% de albumina de soro bovino (BSA) e 4 µ g / ml de insulina |
| MCDB 153-LB meio basal | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB meio basal com tampão HEPES |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6 / PK, 12 / CS | Stellar Scientific | NST230111 | Para imunocoloração |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 diluição |
| PE-conjugado anti-EGFR (San Jose, CA; número de catálogo) | BD Pharmingen | 555997 | Para análise FACS |
| vetor de plasmídeo pMSCV-IRES-EGFP Addgene | 20672 | Para transfecção | |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | Para transfecção |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | Para experimentos de microarray | |
| Thermo Scientific™ Único uso estéril das unidades de filtro do vácuo | Thermo científico | 09-740-63D | para o uso estéril de |
| Zeiss Axionvert 135 do microscópio da fluorescência | Zeiss | com Axiovision Rel. 4,5 |
Referências
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dyna....
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Reimpressões e permissões
