Summary
Ce protocole décrit une méthode de génération de grands volumes de microbulles de décafluorobutane encapsulées par lipides en utilisant la sonication de la pointe de la sonde, puis de les condenser en nanogouttelettes à déphasage à l’aide d’une extrusion à haute pression et d’une filtration mécanique.
Abstract
Il existe de nombreuses méthodes qui peuvent être utilisées pour la production de gouttelettes à déphasage vaporisables pour l’imagerie et la thérapie. Chaque méthode utilise des techniques différentes et varie en prix, en matériaux et en objectif. Bon nombre de ces méthodes de fabrication aboutissent à des populations polydispersées avec des seuils d’activation non uniformes. De plus, le contrôle de la taille des gouttelettes nécessite généralement des liquides perfluorocarbures stables avec des seuils d’activation élevés qui ne sont pas pratiques in vivo. La production de gouttelettes uniformes à l’aide de gaz à faible point d’ébullition serait bénéfique pour les expériences d’imagerie et de thérapie in vivo. Cet article décrit une méthode simple et économique pour la formation de nanogouttelettes à déphasage stabilisées par lipides filtrées avec du décafluorobutane à point d’ébullition bas (DFB). Une méthode courante de génération de microbulles lipidiques est décrite, en plus d’une nouvelle méthode de condensation par extrusion à haute pression en une seule étape. Cette méthode est conçue pour gagner du temps, maximiser l’efficacité et générer de plus grands volumes de solutions de microbulles et de nanogouttelettes pour une grande variété d’applications utilisant des équipements de laboratoire courants trouvés dans de nombreux laboratoires biologiques.
Introduction
Les agents de contraste à ultrasons (UCA) gagnent rapidement en popularité pour les applications d’imagerie et de thérapie. Les microbulles, les UCA originales, sont actuellement les agents courants utilisés dans les applications de diagnostic clinique. Les microbulles sont des sphères remplies de gaz, généralement de 1 à 10 μm de diamètre, entourées de lipides, de protéines ou de coquilles de polymères1. Cependant, leur taille et leur stabilité in vivo peuvent limiter leur fonctionnalité dans de nombreuses applications. Les nanogouttelettes à déphasage, qui contiennent un noyau liquide surchauffé, peuvent surmonter certaines de ces limitations en raison de leur plus petite taille et de leur durée de vie améliorée2. Lorsqu’il est exposé à la chaleur ou à l’énergie acoustique, le noyau liquide surchauffé se vaporise pour former une microbulle de gaz2,3,4,5. Étant donné que le seuil de vaporisation est directement lié à la taille des gouttelettes5,6, il serait hautement souhaitable de formuler des suspensions de gouttelettes de taille uniforme pour atteindre des seuils d’activation cohérents. Les méthodes de formulation qui produisent des tailles de gouttelettes uniformes sont souvent complexes et coûteuses, tandis que les approches plus rentables aboutissent à des solutions polydispersées7. Une autre limitation est la capacité de générer des gouttelettes à déphasage stables avec des gaz perfluorocarbonés (PFC) à faible point d’ébullition, ce qui est essentiel pour une activation efficace in vivo8. Dans ce manuscrit, un protocole est décrit pour générer des gouttelettes de déphasage vaporisables à point d’ébullition filtrées stables pour des applications d’imagerie et de thérapie in vivo.
Il existe de nombreuses méthodes de production de gouttelettes à déphasage submicroniques monodispersées7. L’une des méthodes les plus robustes de contrôle de la taille est l’utilisation de dispositifs microfluidiques. Ces appareils peuvent être coûteux, avoir des taux de production de gouttelettes lents (~104-106 gouttelettes/s)7, et nécessiter une formation approfondie. Les dispositifs microfluidiques nécessitent également généralement des gaz à point d’ébullition élevé pour éviter la vaporisation spontanée et le colmatage du système7. Cependant, une étude récente de de Gracia Lux et al.9 démontre comment le refroidissement d’un microfluidisateur peut être utilisé pour générer des concentrations élevées de déphasage submicronique (1010-1012 / mL) en utilisant du décafluorobutane à point d’ébullition bas (DFB) ou de l’octafluoropropane (OFP).
En général, les gaz à point d’ébullition bas tels que le DFB ou l’OFP sont plus faciles à manipuler à l’aide de bulles de gaz préformées. Des gouttelettes vaporisables peuvent être produites à partir de bulles stabilisées par les lipides précurseurs en condensant le gaz à basse température et à pression élevée5,10. La concentration de gouttelettes produites à l’aide de cette méthode dépend de la concentration en microbulles précurseurs et de l’efficacité de la conversion des bulles en gouttelettes. Des microbulles concentrées ont été rapportées à partir d’une sonication de pointe approchant > 1010 MB / mL11, tandis qu’une étude distincte a rapporté des concentrations de gouttelettes allant de ~ 1-3 x1011 gouttelettes / mL de bulles condensées OFP et DFP12. Lorsque les gouttelettes monodispersées ne sont pas préoccupantes, les méthodes de condensation sont les méthodes les plus simples et les moins coûteuses pour générer des gouttelettes à déphasage stabilisées par les lipides à l’aide de PFC à point d’ébullition bas. Les méthodes de génération de bulles de taille uniforme avant la condensation peuvent aider à créer des populations de gouttelettes plus monodispersées. Cependant, la génération de bulles précurseurs monodispersées est également difficile, nécessitant des approches plus coûteuses telles que la microfluidique ou les techniques de centrifugation différentielle répétée11. Une approche alternative pour produire des nanogouttelettes DFB et OFB a récemment été publiée en utilisant la nucléation spontanée de gouttelettes dans les liposomes13. Cette méthode, utilisant un effet « Ouzo », est un moyen simple de générer des gouttelettes de PFC à faible point d’ébullition sans avoir besoin de condenser des bulles. La distribution granulométrique des gouttelettes de PFC peut être contrôlée par un titrage délicat et un mélange de composants PFC, lipidiques et éthanol utilisés pour initier la nucléation des gouttelettes. Il convient également de noter que le mélange de perfluorocarbures peut être utilisé pour contrôler la stabilité et les seuils d’activation des nanogouttelettes14,15. Des travaux plus récents de Shakya et al. démontrent comment l’activation des nanogouttelettes peut être réglée en émulsionnant des PFC à point d’ébullition élevé dans un endosquelette d’hydrocarbures pour faciliter la nucléation hétérogène dans le noyau de gouttelettes16, ce qui est une approche qui peut être envisagée avec d’autres formes de filtration de la taille des gouttelettes.
Une fois formées, les gouttelettes à déphasage peuvent être extrudées après la formation pour créer des populations plus monodispersées. En fait, un protocole similaire à la méthode décrite ici a été publié précédemment par Kopechek et al.17 en utilisant le dodécofluorpentane à point d’ébullition élevé (DDFP) comme noyau de gouttelettes. Les lecteurs qui cherchent à utiliser des gouttelettes à déphasage avec des perfluorocarbures à point d’ébullition élevé (stables à température ambiante) devraient plutôt se référer à l’article ci-dessus. La génération et l’extrusion de gouttelettes avec des gaz à faible point d’ébullition, tels que DFB et OFP, sont plus compliquées et sont mieux approchées en condensant des bulles de gaz préformées.
Dans ce protocole, une méthode courante de génération de microbulles lipidiques préformées avec un noyau de gaz DFB à l’aide de la sonication de la pointe de la sonde est décrite. Ensuite, une extrudeuse commerciale est utilisée pour condenser des microbulles préformées en nanogouttelettes à déphasage submicroniques (Figure 1). Les gouttelettes résultantes sont ensuite activables par la chaleur et les ultrasons. Cette méthode peut produire de plus grands volumes de solution de nanogouttelettes que les méthodes de condensation conventionnelles avec des distributions de taille plus étroites sans avoir besoin de dispositifs microfluidiques coûteux. La production de solutions de nanogouttelettes avec des distributions de taille étroite peut probablement générer des seuils de vaporisation plus uniformes. Cela maximisera leur potentiel pour de nombreuses applications telles que l’imagerie, l’ablation, l’administration de médicaments et l’embolisation1,3,4,6.
Figure 1 : Schéma de la configuration d’extrusion à haute pression pour la condensation de microbulles préformées en nanogouttelettes à déphasage. Une solution de microbulles est ajoutée et contenue dans la chambre d’extrusion, et 250 psi, à partir du réservoir d’azote, sont appliqués à travers la vanne d’entrée de la chambre. L’azote gazeux poussera la solution de microbulles à travers le filtre à la base de la chambre, condensant l’échantillon en nanogouttelettes. La solution est finalement poussée hors de l’extrudeuse à travers le tube de sortie de l’échantillon et collectée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
1. Faire des films lipidiques
- Préparer des films lipidiques pour la génération de microbulles en utilisant 90% de DSPC et 10% de DSPE-PEG2K en mélangeant les lipides au bon rapport en utilisant les instructions suivantes:
- Fabriquer des lipides de DSPC et de DSPE-PEG2K dans le chloroforme. Peser 50 mg de chaque poudre lipidique dans des flacons séparés. Ajouter 1 mL de chloroforme à chaque flacon à l’aide d’une seringue en verre de 1 mL.
- Ajouter 287 μL de bouillon DSPC et 113 μL de bouillon DSPE-PEG2K (tous deux 50 mg/mL) dans un flacon de scintillation de 20 mL à l’aide d’une seringue en verre.
- Sécher les lipides mélangés pour éliminer le chloroforme à l’aide d’azote. À l’aide d’une longueur appropriée de tube relié à l’azote domestique, faire circuler légèrement l’azote gazeux sur l’espace de tête du flacon pendant le mélange. Continuez jusqu’à ce qu’aucun chloroforme ne soit observé et que le film lipidique restant commence à devenir blanc. Utilisez des bouchons à vis en polypropylène, couvrez l’échantillon tout en introduisant de l’azote dans l’espace de tête.
- Placez les flacons sous vide pendant la nuit à l’aide d’un dessiccateur sous vide pour éliminer tout chloroforme résiduel. Il restera un mince film translucide qui recouvre le fond du flacon.
- Conserver les flacons à -20 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
2. Générer des microbulles à partir de films lipidiques
- Pour fabriquer les microbulles, ajoutez 10 mL de 1x solution saline tampon phosphate (PBS) contenant 20% v/v de propylène glycol et 20% v/v de glycérol (pH final 7,2-7,4) à un film lipidique sec.
- Rebouchez l’échantillon et réchauffez l’échantillon à 65 °C pendant 30 min sur un bloc chauffant (ou un bain-marie chauffé).
- Pendant que l’échantillon se réchauffe, préparez le sonicateur de bain en augmentant la température du bain à 65 °C.
REMARQUE: Ce processus est plus rapide si l’eau est préchauffée dans un micro-ondes ou une plaque chauffante avant de la placer dans le sonicator de bain. - Placer le flacon de scintillation contenant l’échantillon réchauffé dans le sonicator de bain de sorte que seule la partie du flacon contenant la solution lipidique soit immergée dans le bain-marie.
- Sonicate la solution lipidique chaude pendant au moins 15 min. Assurez-vous que la température de l’eau reste à 65 °C. Continuer à soniquer à des intervalles de 10 à 15 minutes jusqu’à ce que la solution soit complètement claire (Figure 2).
REMARQUE: Si un sonicateur de bain n’est pas disponible, la solution peut être soniquée à 10% de puissance jusqu’à ce qu’elle soit claire. Cependant, la micro-pointe s’usera plus rapidement et est plus coûteuse à remplacer.
Figure 2 : Exemple de films lipidiques hydratés. Exemple de film lipidique hydraté (A) avant et (B) après sonication par bain pour former des vésicules unilamellaires. Après la sonication du bain, la solution lipidique devrait passer d’une solution plus opaque à une solution translucide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Lorsqu’il fait encore chaud, retirez le capuchon et fixez le flacon dans le boîtier insonorisé du sonicateur afin que la fixation micro-embout du sonicator soit immergée juste sous l’interface air/liquide (Figure 3).
- Placez le réservoir de décafluorobutane à côté de l’enceinte insonorisée du sonicator.
- Préparez un bain de glace et placez-le à côté de l’enceinte insonorisée. Cela sera utilisé plus loin à l’étape 2.14.
- Allumez l’interrupteur d’alimentation du sonicator.
- Une fois le système démarré, réglez le niveau de puissance sur 70 %. Ne dépassez pas 70% d’amplitude avec la fixation micro-pointe. Ne démarrez pas le sonicator pour le moment.
- Fixez une longueur appropriée de tuyau pour guider le gaz de la sortie du réservoir DFB dans la solution lipidique chaude maintenue dans l’enceinte. Le tube doit être placé juste dans le col du flacon pour permettre au gaz de s’écouler dans l’espace de tête pendant la sonication (Figure 3).
- Ouvrez lentement la vanne du réservoir jusqu’à ce que le gaz puisse être vu s’écouler sur la solution lipidique. Cela provoquera de légères ondulations à la surface du liquide. Si le débit de gaz est trop élevé, la solution débordera lors de la formulation des microbulles.
- Démarrez le sonicator et exécutez pendant 10 s en continu pour générer des microbulles. Si la solution à bulles commence à déborder pendant la sonication, arrêtez immédiatement le sonicator.
- Éteignez le sonicator et fermez immédiatement la vanne du réservoir DFB.
- Boucher rapidement la solution de microbulles et immerger le flacon dans le bain de glace pour refroidir l’échantillon en dessous de 55 °C (température de transition vitreuse du DSPC)
- Laissez les échantillons de microbulles dans le bain de glace jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
Figure 3 : Placement de la pointe de la sonde dans la solution lipidique pour optimiser la formation de microbulles. Veillez à ne pas laisser la pointe de la sonde toucher le verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Préparation de l’extrudeuse pour la condensation des microbulles
- Assemblez l’extrudeuse haute pression comme indiqué dans le manuel de l’utilisateur à l’aide d’un filtre en céramique de 200 nm (fourni par le fabricant).
- Placez l’extrudeuse au centre d’un récipient étanche afin que le tube de sortie de l’échantillon ne soit pas pressé contre le côté ou serti.
- Couplez l’extrudeuse au réservoir d’azote gazeux à l’aide de l’adaptateur fourni par le fabricant.
- Faire un bain de glace salée à -2 °C dans le récipient étanche autour de l’extrudeuse en utilisant 400 mL d’eau et 10 g de chlorure de sodium.
- Placez l’extrémité du tube de sortie dans un flacon de scintillation pour prélever l’échantillon extrudé.
REMARQUE: Fixez le tube au récipient avec du ruban adhésif s’il ne repose pas à plat ou ne reste pas dans le flacon.
4. Amorçage de l’extrudeuse pour la condensation des microbulles
- Ouvrez et fermez la vanne de déverrouillage pour vous assurer qu’il n’y a pas de pression dans l’extrudeuse.
- Retirez le couvercle de la chambre et ajoutez 5 mL de 1x PBS à la chambre d’extrusion.
- Remplacez le couvercle en vous assurant qu’il est remis en place en toute sécurité.
- Ouvrez le réservoir d’azote gazeux de sorte que le manomètre indique 250 psi. Assurez-vous que la soupape de régulation de pression est en position fermée.
- Fermez le réservoir de gaz et ouvrez la vanne d’entrée de la chambre d’extrusion. La solution PBS sera poussée à travers le système et hors du tube de sortie de l’échantillon dans le flacon de scintillation.
- Lorsque seul du gaz sort du tube, ouvrez la soupape de dégagement et laissez la pression tomber à 0 psi.
- Retirez le flacon de scintillation.
5. Microbulles de pré-refroidissement pour l’extrusion
- Ouvrez et fermez la vanne de déverrouillage pour vous assurer qu’il n’y a pas de pression dans l’extrudeuse. Placez un nouveau flacon de scintillation à l’extrémité du tube de sortie.
- Remplissez un récipient en acier avec du 2-méthyl butane et ajoutez de la glace carbonique pour ramener la température à -18 °C.
- Insérez la solution de microbulles dans le 2-méthyl butane réfrigéré afin que l’échantillon soit immergé pendant 2 min. Déplacez le flacon de scintillation pendant 2 minutes pour mélanger doucement les bulles. Ajouter de la glace carbonique au besoin pour maintenir la température entre -15 et -18 °C. Veillez à ne pas dépasser -20 °C sinon la solution d’excipient gèlera et détruira l’échantillon de bulles.
REMARQUE: Les étapes 5.2 et 5.3 peuvent également être effectuées en refroidissant l’échantillon de bulles dans un congélateur de laboratoire sur une période plus longue. Cependant, il faut faire preuve de prudence pour surveiller attentivement la température du congélateur et éviter de congeler l’échantillon. - Après 2 min, retirer les microbulles du 2-méthyl butane réfrigéré, agiter doucement le flacon pour mélanger les microbulles et utiliser une seringue réfrigérée de 10 mL pour transférer la solution à l’extrudeuse.
- Retirez le couvercle de la chambre d’extrusion et ajoutez la solution de microbulles à la chambre en poussant lentement le piston de la seringue. Remplacez le capuchon de l’extrudeuse en vous assurant qu’il est bien en place.
- Vérifiez que la vanne de régulation de pression et la vanne de desserrage de l’extrudeuse sont en position fermée.
- Ouvrez le réservoir d’azote gazeux jusqu’à ce que le manomètre indique 250 psi, fermez le réservoir d’essence et tournez la soupape de régulation de pression en position ouverte.
- Lorsque la solution a rempli le flacon de scintillation au niveau du tube de sortie et que seul le gaz sort du tube, ouvrez lentement la soupape de décompression et laissez la pression tomber à 0 psi.
- Placez le flacon de scintillation dans un bain de glace ou un réfrigérateur pour le stockage.
- Pour un stockage à long terme et minimiser la vaporisation spontanée, conservez l’échantillon dans un congélateur standard. Assurez-vous que la température est de -20 °C ou plus pour éviter de congeler l’échantillon (la solution d’excipient de 20 % de PPG et de 20 % de glycérol empêchera l’échantillon de geler dans la plupart des congélateurs de laboratoire).
6. Séparer les gouttelettes des liposomes par centrifugation
- Transférer 10 mL de la solution de gouttelettes extrudées dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
- Centrifuger l’échantillon extrudé à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille composée de nanogouttelettes DFB sera apparente au fond du tube (Figure 4). Des gouttelettes vaporisées spontanément apparaîtront en haut de la solution et doivent être jetées.
Figure 4 : Exemple de granulation de gouttelettes DFB à déphasage après centrifugation. Les nanogouttelettes DFB sont plus denses que les liposomes et s’accumulent au fond du tube de centrifugeuse dans une pastille (boîte rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Retirer le surnageant et remettre la pastille dans 2 mL de 1x PBS avec 20% de glycérol et 20% de propylène glycol.
- Mélanger doucement le tube pour obtenir une solution homogène et transférer les gouttelettes dans un tube centrifugeur plus petit de 2 mL.
- Laver l’échantillon deux fois de plus dans un tube de centrifugeuse de 2 mL.
- Après le dernier lavage, remettez la pastille dans 100 μL de 1x PBS avec 20% de glycérol et 20% de propylène glycol et conservez-la sur de la glace ou au congélateur jusqu’à ce que nécessaire.
7. Vérification microscopique de la vaporisation des gouttelettes
- Faire une solution de gouttelettes diluées en ajoutant 2,5 μl de gouttelettes concentrées à 7,5 μl de 1x PBS.
- Préparer une lame de microscope avec 10 μl de l’échantillon dilué. À l’aide d’un objectif 40x, observez l’échantillon et enregistrez les images.
- Retirez la lame du microscope et placez-la sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 1 min pour vaporiser les nanogouttelettes en microbulles.
- Utilisez le même objectif 40x pour observer l’échantillon après chauffage afin de vérifier la vaporisation des gouttelettes.
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Representative Results
Les résultats représentatifs de la distribution granulométrique sont inclus à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de l’analyse par détection d’impulsions résistives accordables (TRSP). La figure 5 montre la distribution granulométrique des solutions de bulles condensées avec et sans extrusion. Sans extrusion, le protocole se termine à l’étape 5.3. Les bulles réfrigérées sont condensées en évacuant l’échantillon à la pression atmosphérique lorsqu’il fait froid. L’échantillon condensé seulement a une distribution beaucoup plus large centrée près de 400 nm. L’échantillon extrudé a une distribution plus étroite centrée à 200 nm. Les deux échantillons comprennent à la fois des liposomes et des gouttelettes, qui ne sont pas discernables à l’aide de DLS. La figure 6 montre un échantillon représentatif de gouttelettes à déphasage après avoir été lavées par centrifugation pour éliminer l’excès de liposomes (étape 6.7). TRPS a été utilisé pour cette analyse afin d’évaluer à la fois la distribution de taille et la concentration des gouttelettes seules. Semblable à DLS, TRPS affiche les tailles de gouttelettes proches de 200 nm. Les concentrations varient entre 1011 et 1012 gouttelettes par mL après réutilisation des 100 μL de solution finale de gouttelettes dans 1 mL. Les données TRPS sont en moyenne trois mesures par échantillon.
La figure 7 montre des données microscopiques représentatives de la vaporisation de nanogouttelettes lorsqu’elles sont chauffées. Dans la figure 7A (avant vaporisation), quelques microbulles sont apparentes dans le champ de vision (flèches blanches). Cela est dû à la vaporisation spontanée des nanogouttelettes surchauffées lorsque les lames de microscope sont préparées et imagées à température ambiante. Après chauffage, de grandes microbulles sont observées (figure 7B). Les données ici ne capturent pas les bulles immédiatement après la vaporisation. Il est probable que la coalescence des bulles se produise après la vaporisation avant qu’elles ne puissent être ré-imagées. Cette stratégie est utile pour confirmer la présence de nanogouttelettes avant le dimensionnement ou l’utilisation in vivo de TRPS.
Refroidir les bulles avant la condensation est une étape essentielle pour maximiser le rendement en gouttelettes. La figure 8 montre des images représentatives des gouttelettes après vaporisation lorsqu’aucun refroidissement n’est effectué (Figure 8A), que l’extrudeuse est refroidie à 0 °C, mais que les microbulles ne sont pas refroidies à -18 °C (Figure 8B) et lorsque le protocole est suivi avec précision (Figure 8C).
Ce protocole a également été mis en œuvre, tel qu’il est écrit, pour condenser les bulles OFP à point d’ébullition bas. La figure 9 montre des images représentatives des gouttelettes d’OFP avant et après la vaporisation à partir de la chaleur. Comme pour les gouttelettes DFB, une quantité importante de coalescence est probable après le chauffage. Ainsi, les tailles de bulles ne sont probablement pas représentatives des gouttelettes ou des bulles initiales lors de la vaporisation. La granulation et la microscopie confirment la présence et l’activité de gouttelettes OFP à déphasage.
Figure 5 : Données de diffusion dynamique de la lumière comparant les suspensions de gouttelettes avec (ligne continue) et sans extrusion (ligne pointillée). Les échantillons ont été mesurés immédiatement après la condensation et l’extrusion à l’aide d’un système de diffusion de la lumière DLS. Les données présentées ici sont en moyenne de trois mesures par échantillon. L’analyse est effectuée avant le lavage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Distribution granulométrique des gouttelettes de décafluorobutane filtrées par taille à partir de l’analyse TRPS. Les données proviennent en moyenne de trois mesures sur un seul échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Exemples d’images microscopiques de gouttelettes de décafluorobutane à déphasage avant et après la vaporisation. (A) Certaines bulles peuvent être observées avant la vaporisation, probablement en raison de la vaporisation spontanée de gouttelettes DFB à point d’ébullition bas en bulles (microscopie effectuée à température ambiante). (B) Une augmentation significative des microbulles est observée après chauffage. Les barres d’échelle sont de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8 : Exemples d’images microscopiques après vaporisation de gouttelettes à déphasage condensées à des températures variables. (A) Des microbulles sont insérées directement dans l’extrudeuse sans prérefroidissement. (B) L’extrudeuse est refroidie à 0 °C dans un bain de glace et des microbulles sont insérées dans la chambre et laissées s’équilibrer pendant 2 min. (C) L’extrudeuse est refroidie à 0 °C dans un bain de glace et les microbulles sont pré-refroidies à -18 °C pendant 2 min avant d’être placées dans l’extrudeuse. Les microbulles pré-refroidies auront généralement des tailles plus petites et un rendement plus élevé en gouttelettes. Les barres d’échelle sont de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9 : Exemple d’images microscopiques de gouttelettes d’octofluorpropane à déphasage avant et après la vaporisation. Les barres d’échelle sont de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Un corpus complet de littérature est disponible qui traite de la formulation, de la physique et des applications potentielles des microbulles et des gouttelettes à déphasage pour l’imagerie et la thérapie in vivo. Cette discussion porte explicitement sur la génération de microbulles lipidiques et leur conversion en gouttelettes à déphasage submicroniques à l’aide d’un gaz DFB à faible point d’ébullition et d’une extrusion à haute pression. La méthode décrite ici vise à fournir une méthode relativement simple de production de grandes quantités de microbulles lipidiques et de gouttelettes à déphasage DFB en combinant les méthodes de condensation de microbulles précédentes avec l’extrusion de gouttelettes en une seule étape. Cette méthode a l’avantage de générer de fortes concentrations de bulles utilisées pour former des gouttelettes DFB avec des distributions de taille étroite basées sur la sélection du filtre. La distribution étroite de la taille est importante en raison des seuils de vaporisation d’échantillon cohérents qui en résultent. Cette méthode est plus simple et moins coûteuse que d’autres méthodes courantes utilisées pour générer une distribution de taille étroite. En outre, le volume potentiel de solution est supérieur à celui d’autres méthodes comparables. Le protocole peut être séparé en trois grandes catégories : (1) Génération de microbulles lipidiques, (2) Condensation et extrusion de microbulles, (3) Séparation des gouttelettes à déphasage des liposomes par centrifugation.
La génération de microbulles à l’aide de la sonication de la pointe de la sonde est l’un des moyens les plus courants de fabriquer des microbulles lipidiques. Il existe de nombreuses publications qui décrivent cette procédure. Ce protocole est adapté de Feshitan et al.11 et optimisé pour fabriquer 10 mL de solution de microbulles, ce qui est la capacité maximale de l’extrudeuse de paillasse. Cette méthode peut également être mise à l’échelle pour générer de plus grands volumes de solution de microbulles lipidiques en supprimant la fixation de la micro-pointe et en augmentant le volume de la solution lipidique à 100 mL ou plus, comme l’ont démontré Feshitan et al11. De même, des extrudeuses à plus grande échelle commerciale qui peuvent accueillir des volumes de 100 mL à 800 mL peuvent être utilisées pour accueillir des volumes accrus de microbulles, maximisant ainsi la production de gouttelettes. Les résultats de la méthode ne sont limités que par l’équipement utilisé, qui peut être modifié pour augmenter le volume en conséquence. La production de gouttelettes filtrées par taille est bénéfique pour diverses applications en raison de seuils de vaporisation plus uniformes. Des modifications futures pourraient être apportées au protocole pour individualiser les résultats en fonction de besoins spécifiques, tels que la fonctionnalisation des coquilles de microbulles et de gouttelettes pour la charge d’anticorps et le ciblage moléculaire.
La méthode d’extrusion utilisée ici est couramment utilisée pour la préparation de liposomes monodispersés. Une méthode similaire a également été utilisée dans le passé pour générer des gouttelettes à déphasage à l’aide de gouttelettes DDFP à point d’ébullition plus élevé17. Il existe certaines différences critiques dans cette méthodologie décrite, à savoir (1) la génération de microbulles préformées avec des gaz à point d’ébullition bas (DFB), (2) le refroidissement de la solution à bulles et du système d’extrusion pour former efficacement des gouttelettes et (3) l’application rapide de pression pour maximiser l’efficacité de condensation des gouttelettes et éviter la dissolution du gaz à bulles10.
Le refroidissement de l’échantillon de microbulles pour l’extrusion est une étape critique dans la génération de fortes concentrations de gouttelettes DFB stables. Dans ce protocole, l’ensemble de l’extrudeuse est placé dans un bain de glace contenant du sel et maintenu à -2 °C. L’extrudeuse dispose d’orifices d’entrée et de sortie pour la circulation du fluide afin de permettre un refroidissement plus efficace et plus rapide, nécessitant une pompe de circulation. Pour la production de gouttelettes DFB, des concentrations élevées de gouttelettes (gouttelettes 1011-1012/mL) peuvent être générées sans système d’eau en circulation. Cependant, on s’attend à ce que l’efficacité de la production de gouttelettes puisse être encore améliorée en incluant un bain de circulation froide, réduisant ainsi le temps d’attente pour le refroidissement. Ce protocole exact a également été utilisé pour les microbulles OFP. Fait intéressant, les bulles d’OFP semblaient être plus nombreuses et plus petites lorsqu’elles étaient observées par microscopie (Figure 9), bien que le rendement en gouttelettes soit sensiblement inférieur après le lavage et la collecte de la pastille. Refroidir encore plus l’extrudeuse et augmenter la pression du réservoir d’azote améliorerait probablement la production de gouttelettes d’OFP. Les gouttelettes d’OFP sont également notoirement instables et nécessitent une manipulation douce et des conditions de stockage appropriées pour minimiser la vaporisation spontanée.
L’application rapide de la pression est une autre étape critique de cette procédure. L’utilisation de l’extrusion dans ce protocole dépend d’une accumulation de pression et de l’application immédiate de cette pression aux microbulles dans la chambre d’extrusion. Dans les protocoles standard d’extrusion lipidique, la pression est augmentée lentement jusqu’à ce que l’échantillon commence à passer à travers le filtre à membrane. Les observations expérimentales ont indiqué qu’une application lente de la pression peut entraîner la dissolution du gaz du noyau de la bulle, plutôt que la condensation des bulles en gouttelettes. Par conséquent, il a été décidé d'«amorcer » les tubes d’entrée de l’extrudeuse avec de l’azote gazeux en fermant la vanne d’entrée de gaz et en réglant la pression du réservoir à 250 psi. Le réservoir doit ensuite être fermé avant d’ouvrir la vanne d’entrée à l’extrudeuse. Le non-respect de cette partie de la procédure entraînera une expulsion rapide et une perte d’échantillon de la sortie de l’extrudeuse. Des pressions supérieures à 250 psi peuvent également entraîner une perte d’échantillon en raison de l’expulsion rapide de l’échantillon, même lorsque le réservoir a été fermé correctement. Lors de la préparation, de l’exécution des étapes ou de l’utilisation de l’extrudeuse de quelque manière que ce soit, il convient de veiller à vérifier les manomètres et les vannes. Si la pression ne tombe pas à zéro ou si la solution ne sort pas de l’extrudeuse comme prévu, vérifiez d’abord que toutes les vannes sont dans la bonne position; la soupape de décompression peut toujours être ouverte pour relâcher la pression sans impacter le contenu de la chambre. Il est également important d’écouter le gaz qui s’échappe et de surveiller les manomètres lorsque la pression est appliquée à l’extrudeuse. Généralement, si une pression est appliquée, soit la solution commencera à sortir du tuyau de sortie, soit il y aura une fuite dans le système. Assurez-vous toujours d’amorcer le système pour vous assurer que l’extrudeuse est correctement assemblée avant d’ajouter une solution de microbulles à la chambre. Au fil du temps, les joints toriques peuvent s’user et empêcher le système de s’étanchéifier correctement. Pour de meilleurs résultats, assurez-vous que toutes les pièces fonctionnent correctement et qu’un joint étanche est créé. Dans le protocole décrit ici, une seule extrusion a été effectuée. Il est possible de réduire davantage la distribution de taille en réintroduisant l’échantillon de gouttelettes dans l’extrudeuse et en effectuant plusieurs étapes d’extrusion (généralement entre 5 et 10). L’extrusion multiple réduira probablement le rendement total des gouttelettes. Compte tenu des distributions de taille de DLS et TRSP, une seule extrusion est probablement suffisante pour la plupart des applications. Enfin, ce protocole a été optimisé pour les filtres 200 nm. Les pressions devraient probablement être optimisées pour les filtres de plus ou moins grandes tailles.
Une fois que l’échantillon a été extrudé avec succès, il doit être testé pour vérifier si les bulles ont été correctement condensées en gouttelettes. Les gouttelettes submicroniques ne sont pas visibles à l’aide des techniques d’imagerie lumineuse standard, elles doivent donc d’abord être vaporisées pour devenir plus visibles6. Il est toujours important d’imager l’échantillon avant la vaporisation pour vérifier l’absence de microbulles ou déterminer le niveau de vaporisation spontanée avant de chauffer les gouttelettes. Un logiciel d’imagerie peut être utilisé pour compter et dimensionner les microbulles de l’image afin de fournir indirectement des données sur les nanogouttelettes. Cependant, il convient de noter qu’après la vaporisation, les bulles fusionneront rapidement pendant le réchauffement. Ainsi, la taille des bulles et les nombres d’analyses microscopiques ne reflètent probablement pas la taille et les concentrations initiales des gouttelettes. Les mesures directes de la distribution et de la concentration des gouttelettes sont mieux effectuées à l’aide de la détection d’impulsion résistive accordable (TRPS), si elle est disponible. Des données représentatives sur la distribution des gouttelettes du TRSP ont été fournies (figure 6).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Dominique James dans le laboratoire du Dr Ken Hoyt d’avoir fourni une analyse TRSP de nanogouttelettes à déphasage vaporisables
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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