Summary
Este protocolo descreve um método de geração de grandes volumes de microbolhas de decafluorobutano encapsuladas lipídicas usando sônica de ponta de sonda e, posteriormente, condensando-as em nanodroplets de mudança de fase usando extrusão de alta pressão e filtração mecânica.
Abstract
Existem muitos métodos que podem ser usados para a produção de gotículas vaporizáveis de mudança de fase para imagem e terapia. Cada método utiliza técnicas diferentes e varia em preço, materiais e propósito. Muitos desses métodos de fabricação resultam em populações polidispersas com limiares de ativação não uniformes. Além disso, controlar os tamanhos das gotículas normalmente requer líquidos perfluorocarbonos estáveis com altos limiares de ativação que não são práticos in vivo. Produzir tamanhos uniformes de gotículas usando gases de ponto de baixa ebulição seria benéfico para experimentos de imagem e terapia in vivo. Este artigo descreve um método simples e econômico para a formação de nanodroplets de mudança de fase estabilizadas lipídicas com decafluorobutano de ponto de baixa ebulição (DFB). Descreve-se um método comum de geração de microbolhas lipídicas, além de um novo método de condensação deles com extrusão de alta pressão em um único passo. Este método foi projetado para economizar tempo, maximizar a eficiência e gerar maiores volumes de soluções de microbolhas e nanodroplet para uma grande variedade de aplicações usando equipamentos de laboratório comuns encontrados em muitos laboratórios biológicos.
Introduction
Os agentes de contraste de ultrassom (UCAs) estão crescendo rapidamente em popularidade para aplicações de imagem e terapia. Os microbolhas, os UCAs originais, são atualmente os principais agentes utilizados em aplicações de diagnóstico clínico. Microbolhas são esferas cheias de gás, tipicamente de 1-10 μm de diâmetro, cercadas por conchas lipídicas, proteicas ou polímeras1. No entanto, seu tamanho e estabilidade in vivo podem limitar sua funcionalidade em muitos aplicativos. Nanodroplets de mudança de fase, que contêm um núcleo líquido superaquecido, podem superar algumas dessas limitações devido ao seu tamanho menor e à melhoria da vida útil da circulação2. Quando exposto ao calor ou à energia acústica, o núcleo líquido superaquecido vaporiza para formar um microbolhas de gás2,3,4,5. Uma vez que o limiar de vaporização está diretamente relacionado com o tamanho da gotícula5,6, formular suspensões de gotículas com tamanho uniforme seria altamente desejável para alcançar limites de ativação consistentes. Métodos de formulação que produzem tamanhos uniformes de gotículas são muitas vezes complexos e caros, enquanto abordagens mais econômicas resultam em soluções polidisperses7. Outra limitação é a capacidade de gerar gotículas de mudança de fase estáveis com gases de perfluorocarbono de ponto de baixa ebulição (PFC), o que é fundamental para uma ativação eficiente no vivo8. Neste manuscrito, é descrito um protocolo para gerar gotículas vaporizáveis de ponto de baixa ebulição filtradas para aplicações de imagem e terapia in vivo.
Existem muitos métodos de produção de gotículas de mudança de fase de submicron monodisperspersed7. Um dos métodos mais robustos de controle de tamanho é o uso de dispositivos microfluidos. Esses dispositivos podem ser caros, ter taxas lentas de produção de gotículas (~104-106 gotículas/s)7 e requerem treinamento extensivo. Dispositivos microfluidos também geralmente requerem gases de ponto de alta ebulição para evitar a vaporização espontânea e o entupimento do sistema7. No entanto, um estudo recente de De Gracia Lux et al.9 demonstra como o resfriamento de um microfluidizador pode ser usado para gerar altas concentrações de mudança de fase sub-micron (1010-1012/mL) usando decafluorobutano de ponto de baixa ebulição (DFB) ou octafluoropropano (OFP).
Em geral, gases de ponto de baixa ebulição, como DFB ou OFP, são mais fáceis de manusear usando bolhas de gás pré-formadas. Gotículas vaporizáveis podem ser produzidas a partir de bolhas precursoras estabilizadas lipídios, condensando o gás usando baixas temperaturas e pressão elevada5,10. A concentração de gotículas produzidas usando este método depende da concentração precursora de microbolhas e eficiência da conversão de bolhas em gotículas. Microbolhas concentradas foram relatadas a partir da sônica de ponta que se aproxima > 1010 MB/mL11, enquanto um estudo separado relatou concentrações de gotículas que variam de ~1-3 x1011 gotículas/mL de bolhas condensadas OFP e DFP12. Quando gotículas monodisperadas não são uma preocupação, os métodos de condensação são os métodos mais simples e de menor custo de gerar gotículas de mudança de fase estabilizadas lipídicas usando PFCs de ponto de baixa ebulição. Métodos de geração de bolhas de tamanho uniforme antes da condensação podem ajudar a criar populações mais monodispersas de gotículas. No entanto, a geração de bolhas precursoras monodisperses também é difícil, exigindo abordagens mais caras, como microfluidos ou técnicas repetidas de centrifugação diferencial11. Uma abordagem alternativa para a produção de nanodroplets DFB e OFB foi publicada recentemente usando nucleação espontânea de gotículas em lipossomos13. Este método, utilizando um efeito "Ouzo", é uma maneira simples de gerar gotículas PFC de ponto de baixa ebulição sem precisar condensar bolhas. A distribuição de tamanho das gotículas PFC pode ser controlada por delicadas titulação e mistura de componentes PFC, lipídios e etanol usados para iniciar a nucleação das gotículas. Também vale a pena notar que a mistura de perfluorocarbonos pode ser usada para controlar os limiares de estabilidade e ativação de nanodroplets14,15. Trabalhos mais recentes de Shakya et al. demonstram como a ativação de nanodroplets pode ser ajustada ao emulsionar PFCs de alto ponto de ebulição dentro de um endoesqueleto de hidrocarbonetos para facilitar a nucleação heterogênea dentro do núcleo gotícula16, que é uma abordagem que pode ser considerada juntamente com outras formas de filtragem do tamanho de gotícula.
Uma vez formadas, gotículas de mudança de fase podem ser extrudadas após a formação para criar populações mais monodispersas. Na verdade, um protocolo semelhante ao método descrito aqui foi publicado anteriormente por Kopechek et al.17 usando o ponto de ebulição alto dodecofluorpentano (DDFP) como o núcleo gotícula. Os leitores que procuram usar gotículas de mudança de fase com perfluorocarbonos de ponto de alta ebulição (estáveis à temperatura ambiente) devem fazer referência ao artigo acima. Gerar e extrudar gotículas com gases de ponto de ebulição baixos, como DFB e OFP, é mais complicado e é melhor abordado pela condensação de bolhas de gás pré-formadas.
Neste protocolo, é descrito um método comum de geração de microbolhas lipídicas pré-formadas com um núcleo de gás DFB usando a sônica da ponta da sonda. Em seguida, uma extrusora comercial é usada para condensar microbolhas pré-formadas em nanodroplets de mudança de fase de submicron (Figura 1). As gotículas resultantes são então ativadas por calor e ultrassom. Este método pode produzir volumes maiores de solução de nanodroplet do que métodos convencionais de condensação com distribuições de tamanho mais estreitas sem a necessidade de dispositivos microfluidos caros. A produção de soluções de nanodroplet com distribuições de tamanho estreito pode provavelmente gerar mais limites de vaporização uniformes. Isso maximizará seu potencial para inúmeras aplicações, como imagem, ablação, entrega de medicamentos e embolização1,3,4,6.
Figura 1: Esquema de configuração de extrusão de alta pressão para condensar microbolhas pré-formadas em nanodroplets de mudança de fase. A solução de microbolhas é adicionada e contida na câmara extrusora, e 250 psi, do tanque de nitrogênio, é aplicada através da válvula de entrada da câmara. O gás nitrogênio empurrará a solução de microbolhas através do filtro na base da câmara, condensando a amostra em nanodroplets. A solução é finalmente empurrada para fora da extrusora através do tubo de saída de amostra e coletada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Fazer filmes lipídes
- Prepare filmes lipídeis para a geração de microbolhas usando 90% DSPC e 10% DSPE-PEG2K misturando os lipídios na razão correta usando as seguintes instruções:
- Faça lipídios de estoque de DSPC e DSPE-PEG2K em clorofórmio. Pesar 50 mg de cada pó lipídico em frascos separados. Adicione 1 mL de clorofórmio a cada frasco usando uma seringa de vidro de 1 mL.
- Adicione 287 μL de estoque DSPC e 113 μL de estoque DSPE-PEG2K (ambos 50 mg/mL) em um frasco de cintilação de 20 mL usando uma seringa de vidro.
- Seque os lipídios mistos para remover o clorofórmio usando nitrogênio. Usando um comprimento apropriado de tubulação conectada ao nitrogênio da casa, flua levemente gás nitrogênio sobre o espaço da cabeça do frasco durante a mistura. Continue até que nenhum clorofórmio seja observado, e o filme lipíduo restante começa a ficar branco. Use tampas de parafuso de polipropileno, cubra a amostra enquanto introduz nitrogênio no espaço para a cabeça.
- Coloque frascos sob vácuo durante a noite usando um desiccador de vácuo para remover qualquer clorofórmio residual. Uma fina película translúcida permanecerá que reveste a parte inferior do frasco.
- Armazene frascos a -20 °C até que seja necessário.
2. Gerando microbolhas de filmes lipídidos
- Para fazer os microbolhas, adicione 10 mL de soro fisiológico tampão fosfato de 1x (PBS) contendo 20% v/v Propileno Glycol e 20% v/v Glicerol (pH final 7.2-7.4) a uma película lipídica seca.
- Recapque a amostra e aqueça a amostra a 65 °C por 30 minutos em um bloco de aquecimento (ou banho de água aquecida).
- Enquanto a amostra estiver aquecendo, prepare o sonicator do banho aumentando a temperatura do banho para 65 °C.
NOTA: Este processo é mais rápido se a água estiver pré-aquecido em um micro-ondas ou placa quente antes de colocar no sonicator do banho. - Coloque o frasco de cintilação contendo a amostra aquecida no sônico de banho para que apenas a porção do frasco contendo a solução lipídica fique submersa no banho de água.
- Sonicar a solução lipídica quente por um mínimo de 15 min. Certifique-se de que a temperatura da água permanece em 65 °C. Continue a sonicar em intervalos de 10-15 min até que a solução esteja completamente clara (Figura 2).
NOTA: Se um sônico de banho não estiver disponível, a solução pode ser sônica com 10% de potência até ficar clara. No entanto, a microfina se desgastará mais rápido e é mais cara para substituir.
Figura 2: Exemplo de filmes lipídes hidratados. Exemplo de filme lipídeca hidratado (A) antes e (B) após a sônica do banho para formar vesículas uni-lamelar. Após a sônica do banho, a solução lipídica deve passar de uma solução mais opaca para translúcida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Enquanto ainda estiver quente, remova a tampa e aperte o frasco no gabinete à prova de som do sonicator para que a fixação da microtipa do sonicator fique submersa logo abaixo da interface ar/líquido (Figura 3).
- Coloque o tanque de decafluorobutano ao lado do gabinete à prova de som do sonicator.
- Prepare um banho de gelo e coloque-o ao lado do gabinete à prova de som. Isso será usado mais tarde na etapa 2.14.
- Ligue o interruptor de alimentação para o sonicator.
- Após o início do sistema, defina o nível de potência para 70%. Não exceda 70% de amplitude com o acessório de microtipo. Não inicie o sonicator neste momento.
- Conecte um comprimento adequado de tubulação para guiar o gás da saída do tanque DFB na solução lipídica quente mantida no gabinete. O tubo deve ser colocado apenas no pescoço do frasco para permitir que o gás flua para dentro do espaço da cabeça durante a sônica (Figura 3).
- Abra a válvula do tanque lentamente até que o gás possa ser visto fluindo sobre a solução lipídica. Isso causará pequenas ondulações na superfície do líquido. Se o fluxo de gás for muito alto, a solução transbordará durante a formulação de microbolhas.
- Inicie o sonicator e execute por 10 s continuamente para gerar microbolhas. Se a solução de bolha começar a transbordar durante a sônica, pare imediatamente o sonicator.
- Desligue o sonicador e feche imediatamente a válvula do tanque DFB.
- Tampar rapidamente a solução de microbolhas e submergir o frasco no banho de gelo para resfriar a amostra abaixo de 55 °C (temperatura de transição de vidro do DSPC)
- Deixe as amostras de microbolhas no banho de gelo até que seja necessário.
Figura 3: Colocação da ponta da sonda na solução lipídica para otimizar a formação de microbolhas. Tome cuidado para não permitir que a ponta da sonda toque no vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Preparação de extrusora para condensação de microbolhas
- Monte a extrusora de alta pressão conforme detalhado no manual do usuário usando um filtro cerâmico de 200 nm (fornecido pelo fabricante).
- Coloque a extrusora no centro de um recipiente impermeável para que o tubo de saída da amostra não seja pressionado contra o lado ou amassado.
- Junte a extrusora ao tanque de gás nitrogênio usando o adaptador fornecido pelo fabricante.
- Faça um banho de gelo salgado de -2 °C no recipiente impermeável ao redor da extrusora usando 400 mL de água e 10 g de cloreto de sódio.
- Coloque a extremidade do tubo de saída em um frasco de cintilação para coletar a amostra extrudada.
NOTA: Fixar o tubo no recipiente com fita adesiva se ele não estiver liso ou ficar dentro do frasco.
4. Escorraçando a extrusora para condensação de microbolhas
- Abra e feche a válvula de liberação para ter certeza de que não há pressão dentro da extrusora.
- Retire a tampa da câmara e adicione 5 mL de 1x PBS à câmara extrudora.
- Substitua a tampa certificando-se de que ela clique com segurança de volta no lugar.
- Abra o tanque de gás nitrogênio para que o medidor de pressão leia 250 psi. Certifique-se de que a válvula de controle de pressão está na posição fechada.
- Feche o tanque de gasolina e abra a válvula de entrada da câmara extrusora. A solução PBS será empurrada através do sistema e para fora do tubo de saída de amostra para o frasco de cintilação.
- Quando apenas o gás estiver saindo da tubulação, abra a válvula de liberação e deixe a pressão cair para 0 psi.
- Remova o frasco de cintilação.
5. Microbolhas pré-resfriamento para extrusão
- Abra e feche a válvula de liberação para ter certeza de que não há pressão dentro da extrusora. Coloque um novo frasco de cintilação no final do tubo de saída.
- Encha um recipiente de aço com butano de 2 metila e adicione gelo seco para baixar a temperatura para -18 °C.
- Insira a solução de microbolhas no butano de 2 metila refrigerado para que a amostra fique submersa por 2 minutos. Mova o frasco de cintilação ao longo dos 2 minutos para misturar suavemente as bolhas. Adicione gelo seco conforme necessário para manter a temperatura entre -15 e -18 °C. Tenha cuidado para não exceder -20 °C ou a solução excipiente congelará e destruirá a amostra de bolha.
NOTA: As etapas 5.2 e 5.3 também podem ser feitas resfriando a amostra de bolha em um congelador de laboratório por um período de tempo mais prolongado. No entanto, deve-se ter cuidado para monitorar cuidadosamente a temperatura do congelador e evitar o congelamento da amostra. - Depois de 2 min, remova os microbolhas do butano de 2-metil refrigerado, agite suavemente o frasco para misturar as microbolhas e use uma seringa de 10 mL refrigerada para transferir a solução para a extrusora.
- Remova a tampa da câmara de extrusora e adicione a solução de microbolhas à câmara empurrando lentamente o êmbolo sobre a seringa. Substitua a tampa da extrusora certificando-se de que ela clique com segurança de volta no lugar.
- Verifique se a válvula de controle de pressão e a válvula de liberação da extrusora estão na posição fechada.
- Abra o tanque de gás nitrogênio até que o medidor de pressão leia 250 psi, feche o tanque de gás e gire a válvula de controle de pressão para a posição aberta.
- Quando a solução tiver preenchido o frasco de cintilação na tubulação de saída, e apenas o gás estiver saindo do tubo, abra lentamente a válvula de liberação de pressão e permita que a pressão caia para 0 psi.
- Coloque o frasco de cintilação em um banho de gelo ou geladeira para armazenamento.
- Para armazenamento a longo prazo e minimização da vaporização espontânea, armazene a amostra em um freezer padrão. Certifique-se de que a temperatura é de -20 °C ou superior para evitar o congelamento da amostra (a solução excipiente de 20% de PPG e 20% de Glicerol impedirá que a amostra congele na maioria dos freezers de laboratório).
6. Separar gotículas de lipossomos por centrifugação
- Transfira 10 mL da solução de gotícula extrudada para um tubo centrífuga de 15 mL.
- Centrifugar a amostra extrudada a 1.500 x g por 10 min a 4 °C. Uma pelota composta por nanodroplets DFB será aparente na parte inferior do tubo (Figura 4). Gotículas vaporizadas espontaneamente aparecerão no topo da solução e devem ser descartadas.
Figura 4: Exemplo de gotículas DFB de mudança de fase pelotas após centrifugação. As nanodroplets DFB são mais densas que lipossomos e serão coletadas na parte inferior do tubo de centrífuga em uma pelota, (caixa vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Remova o supernascer e resuspenda a pelota em 2 mL de 1x PBS com 20% de glicerol e 20% de propilenoglicol.
- Misture o tubo suavemente para obter uma solução homogênea e transfira as gotículas para um tubo de centrífuga menor de 2 mL.
- Lave a amostra mais duas vezes no tubo de centrífugas de 2 mL.
- Após a última lavagem, resuspenja a pelota em 100 μL de 1x PBS com 20% de glicerol e 20% de propilenoglicol e armazene no gelo ou no congelador até que seja necessário.
7. Verificação de microscopia da vaporização de gotículas
- Faça uma solução de gotícula diluída adicionando 2,5 μl de gotículas concentradas a 7,5 μl de 1x PBS.
- Prepare um slide de microscópio com 10 μl da amostra diluída. Usando um objetivo de 40x, observe a amostra e salve imagens.
- Remova o slide do microscópio e coloque-o em uma placa de calor de 65 °C por 1 min para vaporizar nanodroplets em microbolhas.
- Use o mesmo objetivo de 40x para observar a amostra após o aquecimento para verificar a vaporização de gotículas.
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Representative Results
Os resultados representativos da distribuição de tamanho estão incluídos utilizando a dispersão dinâmica de luz (DLS) e a análise de sensor de pulso resistivo (TRSP). A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho das soluções de bolha condensada com e sem extrusão. Sem extrusão, o protocolo termina na etapa 5.3. As bolhas geladas são condensadas ventilando a amostra à pressão atmosférica enquanto frias. A amostra condensada só tem uma distribuição muito mais ampla centrada perto de 400 nm. A amostra extrudada tem uma distribuição mais estreita centrada em 200 nm. Ambas as amostras incluem lipossomos e gotículas, que não são perceptíveis usando DLS. A Figura 6 mostra uma amostra representativa de gotículas de mudança de fase após terem sido lavadas por centrifugação para remover o excesso de lipossomos (Passo 6.7). Foi utilizado para esta análise trps para avaliar tanto a distribuição de tamanho quanto a concentração das gotículas. Semelhante ao DLS, o TRPS mostra os tamanhos de gotículas perto de 200 nm. As concentrações variam entre 1011-1012 gotículas por mL após a reutilização de todos os 100 μL da solução final de gotícula em 1 mL. Os dados TRPS são uma média de três medidas por amostra.
A Figura 7 mostra dados representativos de microscopia de vaporização de nanodroplet quando aquecidos. Na Figura 7A (antes da vaporização), algumas microbolhas são aparentes no campo de visão (setas brancas). Isso se deve à vaporização espontânea dos nanodroplets superaquecidos à medida que os slides do microscópio são preparados e imagens à temperatura ambiente. Após o aquecimento, grandes microbolhas são observadas (Figura 7B). Os dados aqui não capturam as bolhas imediatamente após a vaporização. É provável que a coalescência das bolhas ocorra após a vaporização antes que possam ser reimagem. Esta estratégia é útil para confirmar a presença de nanodroplets antes do dimensionamento ou uso do TRPS in vivo.
Resfriar as bolhas antes da condensação é um passo fundamental para maximizar o rendimento da gotícula. A Figura 8 mostra imagens representativas de gotículas após a vaporização quando não é realizado nenhum resfriamento (Figura 8A), o extrusor é resfriado a 0 °C, mas as microbolhas não são resfriadas a -18 °C (Figura 8B), e quando o protocolo é seguido precisamente (Figura 8C).
Este protocolo também foi implementado, como escrito, para condensar bolhas ofp de ponto de baixa ebulição. A Figura 9 mostra imagens representativas de gotículas OFP antes e depois da vaporização do calor. Assim como as gotículas dfb, uma quantidade significativa de coalescência é provável após o aquecimento. Assim, os tamanhos das bolhas não são provavelmente representativos das gotículas iniciais ou bolhas após a vaporização. Pelotas e microscopia confirmam a presença e a atividade de gotículas OFP de mudança de fase.
Figura 5: Dados dinâmicos de dispersão de luz comparando suspensões de gotículas com (linha sólida) e sem (linha tracejada) extrusão. As amostras foram medidas imediatamente após a condensação e extrusão utilizando um sistema de dispersão de luz DLS. Os dados aqui mostrados são uma média de três medidas por amostra. A análise é realizada antes da lavagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Distribuição de tamanho das gotículas de decafluorobutano filtradas de tamanho da análise TRPS. Os dados são de uma média de três medidas em uma única amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Exemplo de imagens de microscopia de gotículas de decafluorobutano de mudança de fase antes e depois da vaporização. (A) Algumas bolhas podem ser observadas antes da vaporização, provavelmente devido à vaporização espontânea de gotículas DFB de ponto de baixa ebulição em bolhas (microscopia realizada à temperatura ambiente). (B) Observa-se um aumento significativo das microbolhas após o aquecimento. As barras de escala são de 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Exemplo de imagens de microscopia após a vaporização de gotículas de mudança de fase condensadas a temperaturas variadas. (A) Microbolhas são inseridas diretamente na extrusora sem pré-resfriamento. (B) A extrusora é resfriada a 0°C em um banho de gelo e microbolhas são inseridas na câmara e permitidas a equilíbrio por 2 min. (C) A extrusora é resfriada a 0 °C em um banho de gelo e as microbolhas são pré-resfriadas a -18 °C por 2 min antes de serem colocadas na extrusora. Microcompletos pré-refrigerados geralmente terão tamanhos menores e um rendimento maior de gotículas. As barras de escala são de 10 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Exemplo imagens de microscopia que mudam de fase gotículas de octofluorpropano antes e depois da vaporização. As barras de escala são de 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Está disponível um corpo abrangente de literatura que discute a formulação, física e aplicações potenciais de microbolhas e gotículas de mudança de fase para imagem e terapia in vivo. Esta discussão diz respeito explicitamente à geração de microbolhas lipídicas e à conversão em gotículas de mudança de fase sub-micron usando um baixo ponto de ebulição de gás DFB e extrusão de alta pressão. O método aqui descrito destina-se a fornecer um método relativamente simples de produzir grandes quantidades de microbolhas lipídicas e gotículas de mudança de fase DFB, combinando métodos anteriores de condensação de microbolhas com extrusão de gotículas em um único passo. Este método tem a vantagem de gerar altas concentrações de bolhas usadas para formar gotículas DFB com distribuições de tamanho estreito com base na seleção do filtro. A distribuição de tamanho estreito é significativa devido aos limites consistentes de vaporização da amostra resultantes. Este método é mais simples e menos caro do que outros métodos comuns utilizados para gerar uma distribuição de tamanho estreito. Além disso, o volume potencial de solução é maior do que outros métodos comparáveis. O protocolo pode ser separado em três categorias principais: (1) Geração de microbolhas lipídicas, (2) Condensação e extrusão de microbolhas, (3) Separação de gotículas de mudança de fase de lipossomos por centrifugação.
A geração de microbolhas usando a sônica de ponta de sonda é uma das formas mais comuns de fazer microbolhas lipídicas. Existem muitas publicações que descrevem esse procedimento. Este protocolo é adaptado de Feshitan et al.11 e otimizado para fazer 10 mL de solução de microbolhas, que é a capacidade máxima do extrusor de bancada. Este método também pode ser dimensionado para gerar volumes maiores de solução de microbolhas lipídicas, removendo o acessório de micropéta e aumentando o volume da solução lipídica para 100 mL ou mais, como demonstrado por Feshitan et al11. Da mesma forma, extrusoras maiores em escala comercial que acomodam volumes de 100 mL a 800 mL podem ser usadas para acomodar volumes de microbolhas aumentados, maximizando assim a produção de gotículas. Os resultados do método são limitados apenas pelo equipamento utilizado, que pode ser modificado para aumentar o volume em conformidade. A produção de gotículas filtradas de tamanho é benéfica para várias aplicações devido a limiares de vaporização mais uniformes. Futuras modificações no protocolo poderiam ser feitas para individualizar os resultados para necessidades específicas, como a funcionalização das microbolhas e conchas de gotículas para carregamento de anticorpos e direcionamento molecular.
O método de extrusão utilizado aqui é comumente usado para preparação de lipossomo monodispersed. Um método semelhante também foi usado no passado para gerar gotículas de mudança de fase usando gotículas DDFP de ponto de ebulição mais altas17. Existem algumas diferenças críticas nesta metodologia descrita, ou seja, (1) gerar microbolhas pré-formadas com gases de ponto de baixa ebulição (DFB), (2) resfriar a solução de bolhas e o sistema de extrusão para formar gotículas eficientes e (3) rápida aplicação de pressão para maximizar a eficiência da condensação de gotículas e evitar a dissolução do gás bolha10.
Resfriar a amostra de microbolhas para extrusão é um passo crítico na geração de altas concentrações de gotículas DFB estáveis. Neste protocolo, toda a extrusora é colocada em um sal contendo banho de gelo e mantida a -2 °C. A extrusora possui portas de entrada e saída para fluido circulante para permitir um resfriamento mais eficiente e mais rápido, necessitando de uma bomba circulante. Para a produção de gotículas DFB, altas concentrações de gotículas (1011-1012 gotículas/mL) podem ser geradas sem um sistema de água circulante. No entanto, espera-se que a eficiência da produção de gotículas possa ser melhorada ainda mais, incluindo um banho de circulação fria, reduzindo o tempo de espera para o resfriamento. Este protocolo exato também foi usado para microbolhas OFP. Curiosamente, as bolhas OFP pareciam ser mais numerosas e menores quando observadas usando microscopia (Figura 9), embora o rendimento das gotículas seja visivelmente menor após a lavagem e coleta da pelota. Resfriar ainda mais a extrusora e aumentar a pressão do tanque de nitrogênio provavelmente melhoraria a produção de gotículas OFP. As gotículas OFP também são notoriamente instáveis e requerem manuseio suave e condições adequadas de armazenamento para minimizar a vaporização espontânea.
A rápida aplicação da pressão é outro passo crítico neste procedimento. O uso da extrusão neste protocolo depende de um acúmulo de pressão e aplicação imediata dessa pressão aos microbolhas na câmara extrusora. Nos protocolos de extrusão lipídica padrão, a pressão é aumentada lentamente até que a amostra comece a passar pelo filtro de membrana. Observações experimentais indicaram que a aplicação lenta da pressão pode levar à dissolução do gás do núcleo da bolha, em vez de condensação de bolhas em gotículas. Por isso, decidiu-se "prime" os tubos de entrada extrudante com gás nitrogênio, fechando a válvula de entrada de gás e colocando a pressão do tanque em 250 psi. Em seguida, o tanque deve ser desligado antes de abrir a válvula de entrada para a extrusora. A não orealização desta parte do procedimento resultará em rápida expulsão e perda da amostra da saída da extrusora. Pressões superiores a 250 psi também podem causar perda amostral devido à rápida expulsão da amostra, mesmo quando o tanque foi fechado corretamente. Ao preparar, completar etapas ou usar a extrusora de qualquer forma, deve-se tomar cuidado para verificar medidores de pressão e válvulas. Se a pressão não cair para zero ou a solução não sair da extrusora como esperado, primeiro verifique se todas as válvulas estão na posição adequada; a válvula de liberação de pressão pode ser sempre aberta para liberar a pressão sem afetar o conteúdo da câmara. Também é importante ouvir para escapar do gás e observar os medidores de pressão quando a pressão é aplicada à extrusora. Geralmente, se a pressão é aplicada, então ou a solução começará a sair da tubulação de saída, ou há um vazamento no sistema. Certifique-se sempre de preparar o sistema para garantir que a extrusora seja montada corretamente antes de adicionar uma solução de microbolhas à câmara. Com o tempo, os anéis O podem se desgastar e impedir que o sistema sele corretamente. Para obter melhores resultados, certifique-se de que todas as peças funcionem corretamente e que uma vedação apertada seja criada. No protocolo aqui traçado, apenas uma única extrusão foi realizada. É possível reduzir ainda mais a distribuição de tamanho, reintroduzindo a amostra de gotícula no extrusor e realizando múltiplas etapas de extrusão (tipicamente entre 5 e 10). A extrusão múltipla provavelmente reduzirá o rendimento total das gotículas. Dadas as distribuições de tamanho de DLS e TRSP, uma única extrusão é provavelmente suficiente para a maioria das aplicações. Finalmente, este protocolo foi otimizado para filtros de 200 nm. As pressões provavelmente precisariam ser otimizadas para tamanhos de filtros maiores ou menores.
Depois que a amostra foi extrudada com sucesso, deve ser testada para verificar se as bolhas foram devidamente condensadas em gotículas. Gotículas de submicron não são visíveis usando técnicas padrão de imagem de luz, por isso devem primeiro ser vaporizadas para se tornarem mais visíveis6. Ainda é importante imaginar a amostra antes da vaporização para verificar a ausência de microbolhas ou determinar o nível de vaporização espontânea antes de aquecer as gotículas. O software de imagem pode ser usado para contar e dimensionar os microbolhas na imagem para fornecer dados sobre as nanodroplets indiretamente. No entanto, deve-se notar que após a vaporização, as bolhas se fundirão rapidamente durante o aquecimento. Assim, o tamanho da bolha e as contagens da análise de microscopia provavelmente não refletem os tamanhos e concentrações iniciais das gotículas. As medições diretas da distribuição e concentração da gotícula são melhor realizadas usando sensor de pulso resistivo (TRPS) se disponível. Foram fornecidos dados representativos de distribuição de gotículas da TRSP (Figura 6).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Dominique James no laboratório do Dr. Ken Hoyt por fornecer análises TRSP de nanodroplets vaporizáveis de mudança de fase
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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