Summary
Signal-til-støy-forholdet mellom data er et av de viktigste hensynene for å utføre røntgendiffraksjonsmålinger fra mikrokrystaller. VMXm-strålelinjen gir et miljø med lite støy og mikrostråle for slike eksperimenter. Her beskriver vi prøveforberedelsesmetoder for montering og kjøling av mikrokrystaller for VMXm og andre makrofokusmakromolekylære krystallografistråler.
Abstract
Montering av mikrokrystaller (<10 μm) for enkeltkrystallokrystallografi utgjør en ikke-triviell utfordring. Forbedringer i datakvaliteten er sett for mikrokrystaller med utvikling av strålelinjeoptikk, strålestabilitet og variabel strålestørrelse med fokus fra submikron til mikron, for eksempel ved VMXm-strålelinjen ved Diamond Light Source1. Ytterligere forbedringer i datakvaliteten vil bli oppnådd gjennom forbedringer i prøvemiljø og prøvepreparering. Mikrokrystaller genererer iboende svakere diffraksjon, derfor er forbedring av signal-til-støy nøkkelen til å samle inn røntgendiffraksjonsdata av høy kvalitet og vil hovedsakelig komme fra reduksjoner i bakgrunnsstøy. Store kilder til røntgen bakgrunnsstøy i et diffraksjonseksperiment er fra deres interaksjon med luftbanen før og etter prøven, overflødig krystalliseringsløsning rundt prøven, tilstedeværelsen av krystallinsk is og spredning fra andre stråleinstrumentering eller røntgenvinduer. VMXm-strålelinjen består av instrumentering og en prøveforberedelsesprotokoll for å redusere alle disse støykildene.
For det første fjerner et in-vacuum-prøvemiljø på VMXm luftbanen mellom røntgenkilde og prøve. Deretter benytter prøveforberedelsesprotokoller for makromolekylær krystallografi ved VMXm en rekke prosesser og verktøy tilpasset fra kryoTEM. Disse inkluderer kobbergitter med hullete karbonstøttefilmer, automatisert blotting og dypdykkkjølingsrobotikk som bruker flytende etan. Disse verktøyene muliggjør tilberedning av hundrevis av mikrokrystaller på et enkelt cryoTEM-rutenett med minimal omkringliggende væske på en lavstøystøtte. De minimerer også dannelsen av krystallinsk is fra gjenværende væske rundt krystallene.
Vi presenterer prosessen for å forberede og vurdere kvaliteten på løselige proteinmikrokrystaller ved hjelp av synlig lys og skanning av elektronmikroskopi før vi monterer prøvene på VMXm-strålelinjen for røntgendiffraksjonsforsøk. Vi vil også gi eksempler på prøver av god kvalitet samt de som krever ytterligere optimalisering og strategier for å gjøre det.
Introduction
En stor barriere for bestemmelse av høyoppløselige strukturer av biologiske molekyler ved makromolekylær krystallografi (MX) forblir produksjonen av godt diffracting krystaller i en mottagelig størrelse. Det er mange strategier for å oppnå dette målet fra rekombinant protein genkonstruksjon design gjennom til store sparsomme matrise søk etter kjemiske cocktailer som kan generere innledende krystaller2. For sistnevnte er det ofte slik at krystallografen må optimalisere eventuelle innledende treff for å oppnå krystaller med tilstrekkelig diffraksjonskvalitet og størrelse for strukturbestemmelsesstudier3. Til tross for disse alternativene kan noen målmolekyler aldri generere store (> 10 μm), godt diffracting krystaller og som et resultat må krystallografen holde ut med sine mikrokrystaller og utfordringene som slike prøver presenterer. Disse inkluderer passende montering og kryobeskytte krystallene, håndtere iboende svakere diffraksjon og økt strålingsfølsomhet. Mikrokrystaller dannes fra færre enhetsceller og molekyler enn større krystaller, og som sådan forsterkes diffraksjonen ikke i samme grad sammenlignet med større krystaller, noe som resulterer i iboende svakere diffraksjonsintensiteter. Det er viktig at bakgrunnssignalet ikke maskerer disse refleksjonene, spesielt ved høyere oppløsning der svake refleksjonsintensiteter kan gå tapt4. I tillegg er mikrokrystaller mer følsomme for strålingsskader, og til tross for registrering av diffraksjon ved flytende nitrogentemperaturer5, er det kanskje ikke mulig å samle inn komplette data fra en enkelt krystall, noe som gjør det nødvendig å samle inn data fra et svært stort antall krystaller for å produsere et enkelt komplett datasett6.
Den økende tilgjengeligheten av røntgenfrie elektronlasere (XFELer) og utviklingen av serielle krystallografimetoder (SFX)7 har gitt ruter til innsamling av data fra mindre mikrokrystaller. Dette er imidlertid skreddersydde prøveleveringsmetoder, som krever en betydelig mengde maskinvare- og programvareekspertise, der eksperimenter er begrenset til romtemperatur og vanligvis prøveforbruk er høyt (hundrevis av mikrolitere) og fortsatt kan kreve ytterligereoptimalisering 8. Som sådan er prosjekter der bare en begrenset mengde mikrokrystaller kan gjøres, ikke egnet for SFX.
I mellomtiden har synkrotronstrålelinjeteknologi de siste tiårene utviklet seg til å produsere mindre, mer stabilebjelker 9 med en glans som har tillatt datainnsamling fra stadig mindre krystaller10,11. Mikrofokus strålelinjer som FMX på NSLS-II og I24 på Diamond Light Source har vært i stand til å bestemme nye strukturer fra krystaller med maksimale dimensjoner på ~ 3 μm12 og demonstrere evnen til å samle brukbare data fra enda mindre krystaller som måler ~ 1 μm13. Strålelinjen må konfigureres nøyaktig, med utmerket optikk med høy oppløsning på aksen, en minimal forvirringssfære for prøverotasjon og en nøyaktig justert rotasjonsakse som sammenfaller med røntgenstrålen. Det er viktig å tilpasse røntgenstråleprofilen tett til krystallvolumet og sikre at krystallen er nøyaktig justert i røntgenstrålen - en utfordring for krystaller <5 μm14. Å møte disse eksperimentelle forholdene ved strålelinjen er viktig for å registrere data av beste kvalitet fra mikrokrystaller.
Det gjenværende og muligens viktigste aspektet ved datainnsamling fra mikrokrystaller er presentasjonen av krystallen til røntgenstrålen. Mikrokrystaller har ofte blitt montert på mikromesh prøvefester, produsert av polyimid, et lavt røntgenspredningsmateriale med blenderåpninger så små som 10 μm15,16. Polyimidnettet er montert på en standardpinne som er satt inn i en magnetisk SPINE-base, noe som gjør den kompatibel med de fleste MX-bjelkelinjer17. Nettingbraketten brukes til å fiske krystaller fra krystalliseringsfallet ofte etter samme prosedyre som montering av en 100 μm krystall ved hjelp av en standard sløyfestilbrakett. Mens krystallene kan fordeles over nettet, er en viktig ulempe at et relativt stort volum væske kan bæres av masken og pinnen under høsting (Figur 1C,D). Dette volumet av væske, som kan være mange ganger større enn krystallene selv, vil bidra til bakgrunnsstøy når det belyses med røntgenstråler. Denne bakgrunnsspredningen kan være enda sterkere hvis væsken danner krystallinsk is under blitskjøling, noe som reduserer signal-til-støy-forholdet mellom allerede svake intensiteter innenfor oppløsningene av isdiffraksjon. Derfor er det viktig at overflødig væske fjernes fra prøven, for å sikre at alle mulige signaler kan registreres. Denne utfordringen er enda større når det gjelder membranproteinkrystaller dannet i lipid kubikkfasen (LCP), hvor LCP genererer sterk bakgrunnsspredning og også er vanskelig å fjerne fra rundt krystallene 18.
Den nye allsidige macromolecular crystallography microfocus (VMXm) strålelinjen ved Diamond Light Source gir betingelsene for å samle inn data fra krystaller som potensielt måler mindre enn et mikron i størrelse. Strålelinjen er designet for å levere en stråleprofil som måler 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, et goniometer med en forvirringssfære som ikke er større enn 60 nm og et vacuo prøvemiljø. Disse designfunksjonene til VMXm-endestasjonen minimerer genereringen av røntgenstøy i bakgrunnen av stråleapparatet under datainnsamling med den største gjenværende bakgrunnskilden generert avprøven 14.
Spesifikke prøveforberedelsesmetoder designet for VMXm-strålelinjen gir en mulighet til å redusere denne bakgrunnen og ytterligere forbedre signal-til-støy av diffraksjonsdata, og maksimere kvaliteten på dataene som kan registreres fra mikrokrystaller som måler < 10 μm. Mange av kravene som er skissert her for lav bakgrunn diffraksjon fra mikrokrystaller er også vanlige for kryogene overføringselektronmikroskopi (cryoTEM)19 og mikrokrystallelektrondiffraksjon (microED)20. Som et resultat er mange av verktøyene som allerede er utviklet for fremstilling av cryoTEM-prøver egnet, med noen tilpasninger, for fremstilling av mikrokrystaller. Ved utarbeidelse av prøver for enkeltpartikkelkryoTEM er partiklene som undersøkes innebygd i svært tynne lag (vanligvis <100 nm) av glassaktig is slik at elektroner er i stand til å overføre gjennom prøven. Det tynne ensartede laget oppnås ved å blåse bort overflødig væske og vitrifisering av prøven oppnås ved rask kjøling av prøven (~ 104 K s-1)21 gjennom å stupe inn i flytende etan holdt ved ~ 93 K22. Flytende nitrogen, som brukes rutinemessig til MX-prøvepreparering, er derimot et mindre effektivt kryoogen enn etan og har større tilbøyelighet til krystallinsk isdannelse iprøven 21. Dannelsen av krystallinsk is, som kan forringe diffraksjon og generere bakgrunnsstøy, reduseres normalt ved bruk av kryo-beskyttede forbindelser23. Lavmolekylære polymerer som polyetylenglykol (PEG) 400 og metyl-2,4-pentandiol (MPD), sukker, oljer eller mettede salter kan tilsettes til et aliquot av krystalliseringsløsning i lave konsentrasjoner24- det er ikke en "en størrelse passer alle" -løsning for å velge det mest hensiktsmessige kryoprektantet, og dette krever ofteoptimalisering 25 . Krystallen gjennomgår også flere manipulasjoner under høsting og kryobeskyttende prosess som kan føre til skade på krystallen, muligheten til å bruke flytende etan tillater utelatelse av dette trinnet og bidrar til å beskytte krystallens integritet.
Mens flytende etan er et effektivt kryogen for mikrokrystaller (<10 μm) på grunn av tynnheten i prøven, er det alternative metoder for å forhindre krystallinsk isdannelse, spesielt i større krystaller, inkludert å redusere vanninnholdet i krystallet ved hjelp av et tett kontrollert fuktig miljø26, eller gjennom fukting av overflødig væske bort fra både sløyfen og overflaten avkrystallen 27 , men disse krever igjen større manipulering av prøven. Bruken av automatisert blotting og dykkfrysing med flytende etan, som i cryoTEM, fjerner sammen overflødig krystalliseringsløsning og gir et middel til å blinke kjølige mikrokrystaller på en kontrollert måte mens du prøver å minimere manipulering.
Her presenterer vi en protokoll som ikke bare kan brukes av både brukere av VMXm-strålelinjen og ved andre mikrofokusstrålelinjer for å samle inn høye signal-til-støy-diffraksjonsdata, men kan også være nyttige for de som forbereder løselige proteinkrystall- og vaskemiddelbaserte membranproteinkrystallprøver for mikroED-eksperimenter. Mens alle anleggene for å forberede og vurdere prøver er tilgjengelige på VMXm, er mange strukturelle biologilaboratorier i økende grad utstyrt for kryoTEM prøvepreparering. Som et resultat ser vi for oss at noen brukere kan ønske å bruke sine egne fasiliteter for å forberede sine prøver for stråletid på VMXm.
Protocol
1. Oppsett av utstyr
MERK: Metodene som er beskrevet her, bruker et dykkfrysende instrument med en enkelt blottingsarm. Noen instrumenter er utstyrt med to blotting armer, og vi anbefaler brukeren å sjekke produsentens instruksjoner for å justere instrumentet slik at bare en blotting arm er i bruk.
- Sørg for at et lysmikroskop er plassert i nærheten av det dype fryseinstrumentet, ideelt sett slik at både mikroskopet og dykkfryseren er lett tilgjengelig for brukeren.
- Sett opp og avkjøl den automatiske dykkfryseren i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Prøvekammertemperaturen bør stilles inn på temperaturen der krystallene ble dyrket. Ikke plasser blottingspapir i prøvekammeret.
FORSIKTIG: Flytende etan er et svært brannfarlig eksplosiv og må kun brukes i et godt ventilert område vekk fra potensielle gnistkilder. - Merk gitterboksene på riktig måte og avkjøl dem i en liten dewar ved hjelp av flytende nitrogen.
- Plasser forsiktig gitter, karbonfilmsiden opp, på en passende bærer for glødutladning (for eksempel et glassmikroskopsklie innpakket i parafilm).
- Glødutladning cryoTEM-gitter for 25 s ved 0,39 mBar, ved hjelp av en strøm på 15 mA. Glødutladning rett før gitteret skal brukes. Hold gløden utladet gitter i en dekket Petri-tallerken til de er klare; Hvis 30 min faller ut etter glødutladning, gjentar du glødutladningen.
MERK: Når stempelfryseren er klar og gitteret klargjort, kan oppmerksomheten vende seg til prøven.
2. Bestemme innledende blotting parametere
- Sett den relative fuktigheten til prøvekammeret til 90% og blottingstiden til 5 s og sørg for at dykkfryseren er satt til å automatisk stupe prøven etter at oppblåstheten er fullført.
MERK: Disse startparametrene er mest egnet for Leica GP-dykkfryseren, andre parametere som blotting force er tilgjengelige på FEI Vitrobot. Men etter vår erfaring er krystallintegritet mer sannsynlig å opprettholdes ved bruk av en enkelt blotting arm. - For å kunne forsegle krystalliseringsbrettet når brønnen av interesse er åpnet, kutt en liten stripe tape og brett over den ene enden for å lage en fane for å lette åpningen av forseglingen og forsiktig plassere til den ene siden.
- Skjær opp forseglingen over krystalliseringsbrønnen, inkludert reservoaret. Arbeid raskt, bruk 2-5 μL reservoarløsning på krystallholdig dråpe for å opprettholde væskevolumet i dråpen.
- Bruk tapetappen til deretter å reseal brønnen og sørg for at krystalliseringsfallet ikke tørker ut.
- Mens du midlertidig holder opp båndet over krystalliseringsbrønnen, overfør 10 μL av reservoarløsningen til et 0,5 ml rør for å bruke til senere trinn.
- Eseal brønnen.
- Legg et stykke forhåndskuttet blottingspapir på blottingsarmen på det dype fryseinstrumentet.
- Plasser et enkelt glødutladet gitter i de dype frysende tangene og last inn i instrumentet slik at karbonsiden vender bort fra blottingsarmen.
- Sørg for at den relative fuktigheten i blottingskammeret er på 90%.
- Roter tangene slik at karbonfilmsiden vender mot blottingsarmen.
- Bruk en 2,5 μL pipette, påfør 2 μL reservoarløsning fra 0,5 ml-røret til den ikke-støttende (skinnende kobber) siden av cryoTEM-rutenettet.
- Roter gitteret slik at karbonstøttesiden vender bort fra blottingsarmen og gjenta prosessen, og bruk væsken forsiktig på karbonfilmstøttesiden av rutenettet. Unngå å berøre karbonfilmen med pipettespissen for ikke å skade karbonfilmen. Væsken skal spre seg over nettet på grunn av ladningen som ble avsatt under glødutladning.
- Start blottingsprosessen mens du observerer rutenettet. Et visningsomfang er tilgjengelig på Leica GP2 for dette formålet.
- Vær oppmerksom på om væsken trekkes fra karbonoverflaten på rutenettet i løpet av denne tiden, dette starter med at mesteparten av væskebolusen på gitteret flater ut når væsken er fuktet gjennom gitteret. Etter hvert som væsken i hver rutenettstorg reduseres ytterligere, kan man observere en bølge av "popping" over overflaten av rutenettet. Hvis denne effekten observeres, kan blotting stoppes innen 2-3 s etter popping effektavslutningen. Det er ikke nødvendig å stupe testnettet som kan kastes.
- Hvis den såkalte 'popping' effekten ikke blir observert, gjenta trinn 2.11-2.14, hver gang forlenger blottingstiden med 1-2 s til popping effekten observeres like før blotting armen trekker seg tilbake fra rutenettet. Legg merke til denne gangen for trinn 3.
MERK: Det er viktig at blotting stopper så snart denne popping effekten har skjedd for å sikre at krystaller ikke blir dehydrert fra overblåsing under prosessen. Bruk krystalliseringsløsningen fra reservoaret for tilbakeblåsing og fortynning av prøven, da det sikrer at krystallene er utsatt for en konsistent løsning, noe som reduserer risikoen for å destabilisere krystallene.
3. Høsting av krystaller
- Plasser krystalliseringsplaten under lysmikroskopet og plasser målbrønnen innenfor synsfeltet.
- Legg et friskt, glødet utladet rutenett i stempelfryseren og monter tangene i dykkfryseren, med karbonfilmsiden vendt bort fra blottingsarmen.
- Roter tangene slik at karbonfilmsiden vender mot blottingsarmen.
- Bruk en 2,5 μL pipette, påfør 2 μL reservoarløsning fra 0,5 ml-røret til den ikke-støttende siden av cryoTEM-rutenettet og roter rutenettet slik at karbonfilmstøttesiden vender mot prøveporten til den dype fryseren.
- Skrell tilbake den midlertidige forseglingen og med pipetten satt til 2 μL, aspirer krystalliseringsfallet forsiktig gjentatte ganger for å suspendere mikrokrystallene (det er viktig å ikke introdusere luftbobler til dråpen).
MERK: Det er viktig å observere denne prosessen under lysmikroskopet for å sikre at krystaller frigjøres fra overflatehud eller bunnen av brønnen. Hvis krystallene sitter fast og ikke trekkes opp med aspirasjon, kan enten pipettespissen eller andre krystalliseringsverktøy som en akupunkturnål brukes til forsiktig å løsne krystallene. Avhengig av størrelsen på krystallene og dybden på feltet til lysmikroskopet, er det noen ganger mulig å se, ved hjelp av mikroskopet, krystallene som kommer inn i pipettespissen. - Overfør 2 μL av den aspirerte mikrokrystallslammet til dykkfryseren og påfør all prøven på karbonsiden av cryoTEM-rutenettet.
- Blot for tiden bestemt i trinn 2 og umiddelbart starte frysing. Mens du blåser, observere for forekomsten av en popping bølge effekt over rutenettet og merke om dette skjedde helt over rutenettet. Tilstedeværelsen av krystaller kan påvirke den første blottingstiden, og dette må kanskje justeres for etterfølgende gitter med 1-2 s.
- Arbeid raskt, overfør rutenettet fra flytende etan til rutenettkassen nedsenket i flytende nitrogen. Rest etan kan vende seg til et ugjennomsiktig hvitt fast stoff på rutenettet når det kommer inn i flytende nitrogen. For å redusere dette, fjern rutenettet jevnt fra det flytende etanet, og overfør deretter raskt til det flytende nitrogenreservoaret.
- Når 4 gitter er plassert i gitterkassen, fester du lokket på esken med skruen og overfører den enten til en skumdewar av flytende nitrogen for å tillate videre prøvevurdering med et skanneelektronmikroskop (SEM) eller til en flytende nitrogenlagringsdewar ved hjelp av en passende lagringsbeholder.
4. Prøvetetthetsvurdering ved lysmikroskopi
FORSIKTIG: Denne metoden er destruktiv. Hvis det er begrenset tilgjengelighet av utvalg, for eksempel bare ett eller to krystalliseringsdråper, anbefales det at dette trinnet hoppes over. Etter dykkfrysingsprøver (trinn 3.7) kan fordelingen av krystaller over hele rutenettet vurderes.
- Monter et tørt kryoTEM-rutenett for romtemperatur i stempelfryseren og legg tangene på siden på lysmikroskopet, med rutenettet i synsfeltet. Angi riktig forstørrelse og fokus slik at hele rutenettet og individuelle rutenettstorg kan løses.
- Følg trinn 3.1-3.7.
- I stedet for å overføre rutenettet til rutenettboksen (trinn 3.8), trekker du det stupte rutenettet tilbake fra det flytende etanet ved å tilbakestille dykkfryseren.
FORSIKTIG: Gitteret og prøven vil varme opp til romtemperatur og kan ikke brukes til ytterligere diffraksjonsforsøk. - Fjern tangene fra det dypfryseinstrumentet.
- Mens du holder rutenettet i tangene, plasser rutenettet under lysmikroskopet - fokuset vil allerede være grovt sett.
- Utfør et fint fokus og vurder tettheten av krystallene over rutenettet. Et godt rutenett vil inneholde flere isolerte krystaller vekk fra rutenettstengene i hvert rutenett firkantet og klumping av krystaller er minimal.
- Der tettheten av krystaller i rutenettet resulterer i klumping av krystaller med bare noen få isolerte krystaller, fortynn krystallslammet ytterligere med reservoarløsning og gjenta trinn 3. Vær forsiktig når du fortynner prøver slik at fortynning ikke resulterer i oppløsning av krystallene.
- Fortynn krystallene i trinn ved hjelp av små volumer på 0,5-1 μL.
5. Prøvevurdering ved skanning av elektronmikroskopi
MERK: Mikrokrystallforberedelse på cryoTEM-gitter vurderes best med en skanningselektronmikroskopi (SEM) under kryogene forhold, dette kan oppnås med en SEM utstyrt med et kryo-stadium. Hos VMXm benyttes en JEOL JSM-IT100 SEM (wolframkilde) med en quorums-PP3006-luftsluse og gråtoner. For å sikre minimal strålingsskade ved visning av prøver på VMXm28,29, brukes følgende innstillinger: 5 kV akselererende spenning; en spotstørrelse på 40 (vilkårlige enheter på JEOL JSM-IT100); 10 mm arbeidsavstand. Bilder registreres ved hjelp av sekundær elektrondetektor, for prøvejustering og fokusering brukes en oppholdstid på 0,8 μs mens høyoppløselige bilder av enkeltkrystaller fanges ved hjelp av en oppholdstid på 16 μs. Det er viktig før du laster inn en prøve i SEM at mikroskopet er justert i henhold til produsentens instruksjoner. Det anbefales at bare et enkelt rutenett lastes inn i SEM mens eventuelle gjenværende rutenett forberedt med de samme parametrene er reservert for røntgendiffraksjonseksperimenter.
- Forbered SEM ved å kjøle prøven kryo-trinn til -180 °C i henhold til produsentens instruksjon. Følg instruksjonene for lasting av cryoTEM-rutenett i det spesifikke systemet som er tilgjengelig.
- Når prøven er lastet inn i SEM, slår du på elektronstrålen, justerer prøven og setter fokus ved hjelp av en høy forstørrelse (0,8 μs oppholdstid).
- Først utfører du den første vurderingen med hele rutenettet i sikte ved lav forstørrelse (x45). Spill inn et bilde med denne forstørrelsen.
- Øk forstørrelsen for å tillate nærmere inspeksjon av individuelle rutenett firkanter, individuelle krystaller bør være svært tydelig observerbare.
- Beveg deg rundt i rutenettet og ta stillbilder (16 μs oppholdstid) med krystaller, slik at de oppfyller følgende krav før du fortsetter:
- Sørg for at gitteret er flatt, og karbonstøttefilmen er i stor grad intakt.
- Sørg for at det er mange enkeltkrystaller med en smal glorie av vitrifisert væske rundt krystallen.
- Påse at hullene i karbonstøttefilmen er synlige.
- Forsikre deg om at det ikke er noen store områder med vitrifisert væske som definert av et mørkt og glatt utseende.
- Sørg for at det er lite eller ingen sekskantet is, eller overflateis spredt over gitteret.
- Sørg for at krystallene er jevnt fordelt over støttefilmen og ikke overlapper.
- På dette tidspunktet måler du nøyaktig dimensjonene til en rekke krystaller for å muliggjøre en nøyaktig røntgenstrålestørrelseskorrelasjon under senere diffraksjonseksperimenter.
- Prøver som på en pålitelig måte kan hentes fra SEM og vedlikeholdes ved kryogeniske temperaturer, kan senere brukes til røntgendiffraksjonsforsøk. Hvis dette ikke er mulig, kast disse prøvene.
MERK: Mens du ser på både hele rutenettet og individuelle mikrokrystaller (henholdsvis x45 og x700 forstørrelse), bør det vurderes om du vil gå videre til strålelinjen med gitter utarbeidet ved hjelp av de samme parametrene, eller om noen parametere kan trenge justering i trinn 3. Nettene skal oppfylle testene som er beskrevet i trinn 5.5. Hvis rutenettene ikke oppfyller disse kriteriene, kreves ytterligere optimalisering i trinn 3 før du gjentar trinn 5.
6. Klargjøring av rutenett for diffraksjonsforsøk på VMXm
- Avkjøl ønsket antall VMXm prøveholdere (Figur 4A) (opptil 5) lastet inn i prøvepatronen (med lokk) med prøvelasteren i en stor skumdewar (Figur 4B) ved hjelp av flytende nitrogen - dette kan kreve et stort volum flytende nitrogen. Det flytende nitrogennivået skal være like over prøveposisjonen på prøvelasteren.
- Forbered sirkler og verktøy.
- Plasser verktøy som klippeverktøy, tang og VMXm-prøvespring, i hull i prøvelasteren for å avkjøle. Det kan være nyttig å ordne et søkelys over dewar.
- Overfør raskt rutenettboksen som inneholder de mikrokrystallbelastede rutenettene til rutenettboksens utsparing på prøvelasteren og skru av lokket slik at det er løst og roterbart (ikke fjern).
- Under flytende nitrogen fjern lokket fra prøvepatronen med store tang og legg det under prøvelasteren.
- Bruk VMXm-prøvepinnene til å løfte prøveholderen på prøvelasteren, og sørg for at holderen vender oppover slik at den kan godta et rutenett. Når du er i riktig posisjon, vil en liten pinne på prøvelasteren gripe inn med det lille hullet midt på prøveholderen.
- Med de avkjølte fine tangene løfter du forsiktig rutenettet fra gitterboksen og overfører nær gitteråpningen på prøveholderen. Roter rutenettet slik at det ligger flatt (det spiller ingen rolle hvilken vei støttefilmsiden vender mot).
- Senk tangene forsiktig slik at gitteret er så nært som mulig over gitteråpningen (pass på at du ikke bøyer rutenettet) og slipper gitteret inn i åpningen. Hvis gitteret ikke sitter riktig, bruk forsiktig de fine tangene til å skyve rutenettet på plass eller trykk forsiktig på prøveholderen med større tang.
- Plasser det ferdigkjølte circlip-verktøyet raskt over gitteret i gitteråpningen og sett sirkelen på plass ved å trykke på knappen. Det kan være nyttig å bruke 2 depresjoner på knappen for å sikre at sirkelen sitter riktig.
- Fyll opp det flytende nitrogenet slik at nivået er ~ 1,5 cm over prøveholderen. Bruk VMXm-prøvestiftene til å løfte den lastede prøveholderen forsiktig opp og over den lille pinnen på prøvelasteren og tilbake i prøvepatronen. Legg merke til plasseringsnummeret til prøveholderen i prøvepatronen.
- Fortsett å laste inn gitter i prøveholderne til alle prøvene er lastet inn.
- Returner rutenettboksene til lagringsdewaren hvis prøvene forblir inne og fjern prøvelasteren fra dewar for å skape mer plass.
- Sett patronlokket på patronen tilbake, og pass på at pinnen på toppen av patronen griper inn med hullet i lokket.
- Avkjøl og fyll VMXm luftslusekrig med flytende nitrogen og plasser ved siden av skumdewaren som inneholder den lastede prøvepatronen.
- Bruk VMXm-patronverktøyet til å gripe verktøyet forsiktig inn i kantene på siden av patronen og løft patronen raskt inn i luftslusekrigeren.
- Påse at det flytende nitrogennivået dekker patronen.
- Sett lokket på luftslusenden og fortsett til VMXm-endestasjonen med den lastede prøvepatronen.
MERK: Lasting av prøvepatronen i VMXm-endestasjonen vil bli utført av strålelinjepersonalet.
Representative Results
Målet med denne protokollen er å oppnå vitrifiserte mikrokrystaller med et minimalt volum væske rundt krystallen som muliggjør røntgendiffraksjonseksperimenter med minimal bakgrunnsspredning for å forbedre diffraksjonssignalet. Eksempel SEM-bilder av mikrokrystaller som er utarbeidet på cryoTEM-rutenett for minimal bakgrunnsspredning, vises i Figur 1A, B og Figur 2. Gitter med jevnt fordelte enkeltkrystaller vil gi den mest effektive bruken av rutenettet, med god signal-til-støy. Dette er imidlertid vanligvis ikke mulig i hele rutenettet, og noen regioner kan vise en viss klumping (Figur 2A,B). Til tross for denne klumpingen viser disse eksemplene fortsatt et nyttig antall enkeltisolerte krystaller som gir lav bakgrunnsdiffraksjon (figur 5). Nivået av blotting som fortsatt opprettholder lav bakgrunn scatter kan variere. Sterk blotting slik at hullene i karbonstøttefilmen er godt synlige, men krystallene forblir hydrert er målet (Figur 2C,D). Rutenett av god kvalitet kan imidlertid fortsatt vise litt væske i hullene i støttefilmen, selv om hullenes posisjon fortsatt skal være identifiserbar (Figur 2A,B). Det er viktig at alle disse eksemplene viser enkle, isolerte krystaller med en vitrifisert glorie av væske rundt krystallen for å opprettholde hydrering mellom blotting og dypfrysing.
Mange prøver kan kreve ytterligere optimalisering (figur 3), som kan omfatte variasjon av oppblåsthetstiden eller konsentrasjonen av mikrokrystallene. Gitter overbelastet med krystaller vil demonstrere redusert blotting effektivitet og kan føre til at flere gitter blir registrert i enkelt diffraksjon bilder (Figur 3A, B). Mer viskøse krystalliseringsforhold, slik som for trypsin som inneholder 8% PEG 4000 og 15% etylenglykol (figur 3C), kan føre til behov for lengre blotting ganger (>10 s). På den annen side kan krystalliseringsforhold med svært lav viskositet som flekker veldig raskt, lide av distribusjonsproblemer på grunn av tyngdekraften som forårsaker sedimentering før blotting oppstår, noe som resulterer i at alle mikrokrystaller bosetter seg langs den ene siden av rutenettet (Figur 3D).
Optimal forberedelse av prøver gjør det mulig å utnytte de fulle egenskapene til VMXm for å samle inn røntgendiffraksjonsdata av høy kvalitet med høyest mulig oppløsning med høy signal-til-støy (figur 5). Disse prøvene drar nytte av å være kompatible med in-vacuo-eksempelmiljøet, noe som resulterer i svært lave eller null gjennomsnittlige bakgrunnstall i diffraksjonsbilder. Bruk av flytende etan, uten kryobeskyttelse, resulterer i fravær av isringer (figur 5), men der krystaller ligger nær kobbergitterstengene, kan røntgenstrålen se på stolpene som resulterer i kobberpulverdiffraksjonsringer på ~ 2,1 Å og ~ 1,8 Å.
Figur 1: Sammenligning av mikrokrystallmontering på mikromesh-fester og cyoTEM-gitter. Skanning elektronmikrografer av dypfrysende frosne mikrokrystaller av viruspolyhedral som måler 2,5 μm over (A, B) 5 kV akselererende spenning, en spotstørrelse på 39 (vilkårlige enheter) og botid på 16 μs. Gitteret er fritt for overflødig væske (A), en smal glorie av væske observeres rundt krystallene (B). De samme prøvene montert på en mikromesh (20 μm blenderåpninger) før blitskjøling i flytende nitrogen og observert ved hjelp av aksevisningssystemet ved strålelinje I24 ansikt-på (C) og side på (D). De optiske forvrengningene (C) når du ser på forsiden, gir en indikasjon på omfanget av væsketykkelsen over mikromalingen, dette er tydeligere når du ser på mikromalingen side-on (D). Det røde målet i C og D representerer røntgenstrålens posisjon og størrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på prøver av god kvalitet. Polyhedra krystaller (A) observert over en enkelt ~ 100 μm rutenett firkant. Mens noen av krystallene er litt klumpete og viser noen tilkobling av den omkringliggende væsken, er det en rekke isolerte enkeltkrystaller med en liten glorie av væske rundt krystallen. Litt større insulinkrystaller (B) som måler ~ 5 x 5 μm viser også litt klumping, men igjen er det godt isolerte individuelle krystaller. Nålekrystaller kan ha en veldig smal dimensjon og krever en mikrostråle, for eksempel disse nålformede lysozymekrystallene (C). Et smalt bånd av væske kan ses rundt disse krystallene (lysegrå glorie). Større mikrokrystaller opptil titalls mikron kan også monteres godt på cryoTEM-gitter, for eksempel disse ~ 7 μm proteinase K-krystallene (D). I både (C) og (D) og i mindre grad i (A) er hullene i karbonstøttefilmen tydelig synlige, noe som viser tilstedeværelsen av svært lite / ingen væske. I eksempel B, mens ingen tomme hull observeres, kan hullenes posisjon fortsatt identifiseres, noe som indikerer at væsken bare fyller hullene i støttefilmen. I alle disse eksemplene kan en glorie av væske ses rundt kanten av rutenettplassen (en avrundet indre firkant), hvor hullene har et lysere grått utseende. Dette er et vanlig trekk ved godt forberedte nett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på prøver som krever ytterligere optimalisering. Gitter overbelastet med mikrokrystaller (A, B) kan øke bakgrunnsspredningen når prøvene blokkerer hullene i støttefilmen og reduserer blottingseffektiviteten, og med en høyere overflatespenning mellom krystallene gjenstår mer væske. I tillegg til en nedbrytning i signal-til-støy som resulterer i tap av informasjon, er det sannsynlig at flere gitter vil bli registrert. Bruk av en blottingstid som ikke er lang nok, eller en svært viskøs krystalliseringsløsning kan resultere i en altfor våt prøve (C), som også produserer lav signal-til-støy. Krystalliseringsforhold uten utfellingsmidler, for eksempel de for storfeinsulin (D), har en svært lav viskositet. Selv om dette resulterer i en veldig kort blottingstid, kan det også føre til bevegelse av krystaller over rutenettet før og under oppblåsthet på grunn av effekten av tyngdekraften. Dette resulterer vanligvis i et stort sett tomt rutenett med høy konsentrasjon av krystaller langs en kant (D). Det kan være fordelaktig å legge til et viskøst middel som etylenglykol til krystallslammet kort tid før du bruker dem på rutenettet for å redusere krystallstrømmen og forbedre fordelingen av krystallene. Dette kan også forlenge blottingstiden, noe som gjør det lettere å observere blotting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Verktøy for prøvelasting ved VMXm. Et skreddersydd sett med verktøy er utformet for å laste inn VMXm-prøveholderne (A). Prøvelasteren (B) har plass til en enkelt VMXm-prøveholder, rutenettboks og verktøylagring mens du arbeider. Den er også designet for å tillate arbeid like under overflaten av det flytende nitrogenet og la prøvepatronen passe under (B). Luftslusen dewar (C), som passer til luftsluse nitrogengassboksen på VMXm-endestasjonen, brukes til å ta den lastede prøvepatronen fra laboratoriet til den eksperimentelle strålelinjen. For å se prøver i offline SEM, er det gjort en skreddersydd shuttle (D) som består av VMXm-prøveholderen uten base for å muliggjøre vurdering i prøveholderen som brukes på bjelkelinjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempeldiffraksjon fra mikrokrystaller ved VMXm. Et enkelt diffraksjonsbilde tatt opp ved hjelp av en Pilatus 3 6M-detektor ved VMXm av et ~ 3 μm viruspolyedral krystall montert på et kryoTEM-rutenett ved hjelp av dykkfrysingsmetoden. Diffraksjon observeres til over 1,7 Å og en refleksjon (blå firkant) ved 1,74 Å er innsettende, noe som viser den lave bakgrunnsspredningen, med et høyt antall piksler med null antall. Etylenglykol til en endelig konsentrasjon på 50% v / v ble lagt til krystallslammet før du påførte den på rutenettet. Den lave bakgrunnsnaturen til VMXm-prøveposisjonen demonstreres av den konstante bakgrunnen over bildet, som vist av intensiteter plottet under den blå stiplede linjen, selv i nærheten av strålesenteret. De plottede intensitetene viser at bakgrunnen forblir under 3 tellinger. To svake ringer er observert på 2,15 Å og 1,86 Å som genereres ved pulverdiffraksjon av kobberet i cryoTEM-nettet. Det er ingen påvisbare isringer, som viser effektiviteten av blotting etterfulgt av kjøling med flytende etan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen viser hvordan verktøy fra cryoTEM prøvepreparering kan brukes til fremstilling av mikrokrystaller for røntgendiffraksjonsforsøk ved mikrofokusbjelker. Standard strålelinjeinstrumentering er sentrert rundt en pinnemontert prøve, og selv om det er gjort en innsats for å gi prøvestøtte på disse monteringene for mikrokrystaller, er de ofte utfordrende å laste med prøve samtidig som de sikrer at det høyeste signal-til-støy oppnås (Figur 1C,D). Mange av disse prøvene kan også kreve optimalisering av kryobeskyttelsesforholdene for å sikre at prøven er glasslegemet. Frysingsmetoden gir en repeterbar måte å fjerne overflødig væske og blitskjøle prøven i et effektivt kryoogen (Figur 1A,B). Mens gitteret deretter kan monteres på en standard bjelkelinje med en pin-basert pinbrakett, er VMXm-prøveholdere spesielt designet for å akseptere gitter og holde dem under glassovergangstemperaturen i et vakuummiljø via ledende kjøling. Eksempelmiljøet i VMXm muliggjør innsamling av data med lav bakgrunn, der prøven er den gjenværende bakgrunnskilden, og gir et mikrostråle som kan brukes til å matche krystaller med dimensjoner som er mindre enn 10 μm. Denne prøveprepareringsmetoden kan også brukes til å forberede nanokrystaller for elektrondiffraksjon der det også er krav om svært lite overflødig væske og en glassaktig prøve på grunn av svak penetrasjon av elektroner. Mens cryoTEM-rutenettene er skjøre, vil de som oppleves i høsting av krystaller i løkker raskt tilpasse seg håndteringen av rutenettene. Med litt erfaring vil få rutenett gå tapt i løpet av blotting, frysing og lasting av protokollen. Optimaliseringstrinnene er imidlertid avgjørende for denne suksessen, og forsiktig forberedelse vil redusere sjansene for å miste krystaller eller redusere krystallintegriteten.
CryoTEM-rutenett gir en relativt stor enkeltbrakett som kan inneholde mange hundre krystaller, og dermed forbedre gjennomstrømningen der det bare kan være mulig å registrere en liten kile med diffraksjonsdata. Et enkelt rutenett kan også gi nok krystaller til å bestemme proteinstrukturen, spesielt i krystaller med høy symmetri. Der bare en eller to enkelt krystalliseringsdråper har generert mikrokrystaller, kan prøveblussing av krystalliseringstilstanden alene bidra til å sikre at når mikrokrystallene er flekkete, er tidene som brukes så nært som mulig for de som trengs for å generere innledende prøver av god kvalitet. Karbonfilmstøttene er usynlige for røntgenstråler og er tilgjengelige med forskjellig hullavstand, som kan brukes til å passe til en bestemt morfologi. Vi bruker oftest støttefilmer med 2 μm hull med en avstand på 2 μm, men mindre hull med større avstand kan være mer passende for krystaller mindre enn 2 μm. Andre støttefilmer som de med 1 μm hull med en avstand på 4 μm samt støttefilmer med forskjellige formede hull er tilgjengelige, som alle vil påvirke blottingstiden. En rutenett firkantet maskestørrelse på 200 (200 kvadrater per tomme) gir også nok plass (~ 100 μm) mellom kobbergitterstengene slik at røntgenstrålen ikke sterkt samhandler med kobberet samtidig som den gir nok strukturell støtte til karbonfilmen lastet med krystaller. Bruken av flytende etan negerer behovet for kryoprektanter, noe som igjen reduserer kravet til prøvevolum som ville ha blitt brukt til optimalisering av kryotopektantforhold.
Hovedparametrene som skal optimaliseres under prosessen er blottingstidene og prøvefortynning. Blotting ganger bør være lange nok til å observere "popping" effekten over hele rutenettet før du stuper fryse. Over blotting kan føre til dehydrering av krystallene, men kontroll av fuktigheten i prøvekammeret brukes til å minimere denne effekten. Selv om det foreslås at en relativ fuktighet på 90% brukes, kan noen prøver ha nytte av optimalisering av fuktigheten. Fuktigheten kan påvirke blottingseffektiviteten til blottingspapiret som sakte kan bli mettet med vann. I tillegg kan fuktighetskontroll i prøvekammeret brukes til å forbedre diffraksjonskvaliteten til krystallene30. Det anbefales at små endringer (<5 %) i luftfuktigheten gjøres før du kontrollerer diffraksjonsintegriteten for å sikre at diffraksjonskvaliteten ikke forringes.
Optimalisering av ikke-dyrebare prøver kan utføres ved hjelp av et lysmikroskop i stedet for en SEM. Selv om det er destruktivt, er det nyttig å vurdere tettheten av krystaller over hele rutenettet og for å muliggjøre beslutningstaking om en prøve skal fortynnes eller konsentreres for bedre å spre krystaller over rutenettet. Dette trinnet er mest nyttig når det er et stort antall krystaller tilgjengelig og spesielt høyt konsentrerte prøver. Sammen klumping av krystaller bør unngås (Figur 3), da det ikke er et betydelig problem hvis to krystaller lyser samtidig under datainnsamling6, vil det sannsynligvis være et større volum væske rundt klumpen, og dermed redusere signal-til-støy (Figur 5). Selv om det er mulig å observere store mengder væske globalt over hele rutenettet ved hjelp av et lysmikroskop, kan vurdering av væskevolumet rundt mikrokrystallene og tilstedeværelsen av krystallinsk is bare gjøres ved hjelp av et elektronmikroskop utstyrt med et kryogent vakuumoverføringssystem og stadium. Noen ganger, etter påføring av krystallene til rutenettet og før blotting oppstår, kan krystaller i lav viskositetsløsninger slå seg ned langs den ene kanten av rutenettet. Vi har funnet ut at å legge opp til en 50% endelig konsentrasjon av etylenglykol kan bremse bevegelsen av krystaller gjennom dråpen, sikre en bedre fordeling av mikrokrystaller over rutenettet, samt gi større kontroll over blotting ved å øke blottingstiden (Figur 3D).
Noen krystalliseringsløsninger som inneholder viskøse utfellingsmidler som høymolekylære PEG-er kan vise seg utfordrende å blotte, noe som krever stadig lengre blottingstider (>10 s). I slike tilfeller kan det være nyttig å redusere volumet av væske avsatt på baksiden av rutenettet, samt volumet av krystallen som inneholder løsning på støttefilmsiden av rutenettet. Strategier som å bruke 2 lag med blotting papir eller glassfibre kan også hjelpe blotting i disse vanskelige tilfellene31.
Mens denne rørledningen er egnet til oppløselige proteinkrystaller, presenterer de som dannes i svært viskøse medier som membranproteiner i LCP en annen utfordring som denne protokollen ikke passer for. Det dukker imidlertid opp strategier for å forberede LCP-krystaller på cryoTEM-rutenett for microED, som inkluderer å redusere viskositeten til prøvene ved å indusere en faseendring til LCP. Dette gjør at prøvene kan brukes på rutenett på samme måte som det som er beskrevet i denne artikkelen. Til slutt kan prøven freses med en fokusert ionstråle for å fjerne overflødig ikke-krystallmateriale32,33,34.
Totalt sett vil denne rørledningen generelt ta 1-2 timer (inkludert utstyrsoppsettstid) å følge fra prøven som ankommer VMXm for å gi optimaliserte rutenett med godt spredte, vitrifiserte prøver, avhengig av prøvetilgjengelighet, konsentrasjonen av krystaller og viskositeten til krystalliseringsløsningen. Disse metodene har allerede blitt brukt til fremstilling av mikrokrystaller for røntgendiffraksjonsforsøk som utforsker strålingsskader på mikrokrystaller der et minimalt volum væske rundt prøven var viktig28,35. Det skal bemerkes at protokollen kan brukes på alle oppløselige mikrokrystallprøver, ikke bare for godt diffracting prøver som allerede er optimalisert. Et krystalliseringseksperiment som produserer mikrokrystallinsk materiale vil tradisjonelt være et mål for optimalisering med sikte på å oppnå større krystaller, men denne prøveforberedelsesmetoden og egenskapene til VMXm kan tillate tilstrekkelige data å bli samlet inn fra slike prøver uten ytterligere optimalisering. Alternativt, hvis slike mikrokrystallinske prøver diffract dårlig, kan dataene som samles inn fra VMXm ved hjelp av denne prøveforberedelsesmetoden fortsatt fungere som en nyttig guide for videre optimalisering av krystalliseringsforhold. Verktøyene for å forberede rutenett, inkludert glødutladning og dypfrysing, er nå allment tilgjengelige i forskningsinstitutter utstyrt for cryoTEM-eksperimenter og vil være tilgjengelige for mange brukere, slik at de kan forberede prøver i forkant av stråletid på VMXm.
Disclosures
Ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton og Dave Stuart, STRUBI University of Oxford og Rachel Bolton, University of Southampton for vennlig å gi mikrokrystallprøver for utvikling og demonstrasjon av prøveforberedelsesmetoder for VMXm-strålelinjen i tillegg til å muliggjøre igangkjøring av strålelinjen. Forfatterne vil også takke iNEXT-Discovery (prosjektnummer 871037) for muligheten og støtten til å publisere dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
| Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
| Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
| CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
| CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
| ddH2O | n/a | n/a | |
| Ethane gas supply | n/a | n/a | |
| Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
| Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
| Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
| Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
| Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
| Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
| Pipette tips | Various | Various | |
| Pipetting devices | Various | Various | |
| Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
| Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
| Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
| Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |
References
- Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
- McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
- Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, Pt 4 393-408 (2010).
- Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
- Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 10 2652-2666 (2014).
- Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
- Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
- Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
- Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 5 1435-1441 (2014).
- Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
- Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 4 261-270 (2011).
- MiTeGen. MiTeGen. , Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020).
- Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
- Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, Pt 4 366-373 (2010).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, Pt 9 991-995 (2006).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 10 902-906 (2011).
- Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
- Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
- Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
- Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
- Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).
