Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) zijn alomtegenwoordig in levende organismen en spelen een cruciale rol in een verscheidenheid aan fundamentele biologische structuren en processen. Als polymeren bestaan GAG's als een polydisperse mengsel met polysaccharideketens die kunnen variëren van 4000 Da tot ruim 40.000 Da. Binnen deze ketens bestaan domeinen van sulfatie, die een patroon van negatieve lading verlenen dat interactie met positief geladen residuen van verwante eiwitliganden vergemakkelijkt. Gesulfateerde domeinen van GAG's moeten voldoende lang zijn om deze elektrostatische interacties mogelijk te maken. Om de functie van GAG's in biologische weefsels te begrijpen, moet de onderzoeker in staat zijn om de grootte van GAG's te isoleren, te zuiveren en te meten. Dit rapport beschrijft een praktische en veelzijdige polyacrylamide gel elektroforese-gebaseerde techniek die kan worden gebruikt om relatief kleine verschillen in grootte tussen GAG's geïsoleerd uit een verscheidenheid aan biologische weefseltypen op te lossen.
Inleiding
Glycosaminoglycanen (GAG's) zijn een diverse familie van lineaire polysacchariden die een alomtegenwoordig element zijn in levende organismen en bijdragen aan vele fundamentele fysiologische processen1. GAG's zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) kunnen op verschillende posities langs de polysaccharideketen worden gesulfateerd, waardoor geografische domeinen van negatieve lading worden overgedragen. Deze GAG's, wanneer ze worden vastgebonden aan celoppervlakeiwitten die bekend staan als proteoglycanen, projecteren in de extracellulaire ruimte en binden aan verwante liganden, waardoor de regulatie van zowel cis- (ligand gehecht a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle biologische monsters die in dit protocol werden geanalyseerd, werden verkregen van muizen, volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparansulfaat isolatie
- Delipidatie van weefselmonsters
OPMERKING: Delipidatie is een optionele stap voor vetrijke weefsels.- Maak een 1:1 mengsel van methanol en dichloormethaan. Bereid ongeveer 500 μL per monster; grotere stukken weefsel kunnen tot 1 ml nodig hebben.
- Plaats elk weefselmonster in een kleine glazen container met een deksel voor delipidatie.
OPMERKING: De massa v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alcian blauw wordt gebruikt om gesulfateerd GAGs 10te kleuren; dit signaal wordt versterkt door het gebruik van een volgende zilvervlek 11. Figuur 1 geeft een visuele demonstratie van het ontwikkelingsproces van zilverkleuring. Zoals aangetoond, wordt het Alcian blauwe signaal dat GAG's vertegenwoordigt, gescheiden door elektroforese, versterkt naarmate het zich ontwikkelende middel de polyacrylamide-gel binnendringt. Typisch, het ontwikkelings.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
GAG's spelen een centrale rol in veel verschillende biologische processen. Een van de belangrijkste functies van gesulfateerd GAG's (zoals HS en CS) is om te interageren met en te binden aan liganden, die stroomafwaartse signaleringsfuncties kunnen veranderen. Een belangrijke determinant van GAG-bindingsaffiniteit aan verwante liganden is de lengte van de GAG-polymeerketen 8,9,14. Om deze reden is het belangrijk voor onderzoeker.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL en EPS)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Elke combinatie van benchtop microcentrifuge/rotor die 14000 xG kan is geschikt |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electroforesekwaliteit |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Proteasemix van S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | gecertificeerd ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | elektroforesekwaliteit |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Elk waterde-ionisatie-/zuiveringssysteem is een acceptabel alternatief |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Elk 1.0mm dik PAGE-gietkastsysteem volstaat |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | elk vergelijkbaar verticaal gel PAGE-systeem zal werken) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | gecertificeerd ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Gecertificeerd ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electroforesekwaliteit |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | Van Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Elke lyofilisaat die -40C en 0.135 Torr kan bereiken, zal werken; kan ook worden vervangen door een rotatievacuüm concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Gecertificeerd ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Elk vergelijkbaar gelbeeldsysteem is een acceptabel alternatief |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electroforesekwaliteit |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Vrije zuur |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ionenuitwisselingskolom moet een minimaal laadvolume van 0.4mL, werk-pH van 2-12 en selectiviteit voor ionische groepen met pKa van 11 hebben |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | gecertificeerd ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electroforesekwaliteit |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Moleculaire biologiekwaliteit |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecuulgewicht afsnijding | Amicon | UFC500324 | Grotere volumefiltereenheden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de steekproefomvang. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Elke rotatievacuüm concentrator zal werken; kan worden vervangen door lyofilisaat |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternatieve volumes en filtermaterialen acceptabel |
Referenties
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
