يصف البروتوكول المعروض هنا خط أنابيب كامل لتحليل بيانات النسخ التسلسلية من قراءات الخام إلى التحليل الوظيفي ، بما في ذلك مراقبة الجودة وخطوات المعالجة المسبقة للنهج التحليلية الإحصائية المتقدمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل النسخ عالي الإنتاجية للتحقيق في التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مسببات الأمراض يمكن أن تسبب مجموعة واسعة من الأمراض المعدية. العمليات البيولوجية التي يسببها المضيف استجابة للعدوى تحدد شدة المرض. لدراسة مثل هذه العمليات، يمكن للباحثين استخدام تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية (RNA-seq) التي تقيس التغيرات الديناميكية للنسخ المضيف في مراحل مختلفة من العدوى، والنتائج السريرية، أو شدة المرض. يمكن أن يؤدي هذا التحقيق إلى فهم أفضل للأمراض ، فضلا عن الكشف عن أهداف الأدوية المحتملة والعلاجات. يصف البروتوكول المعروض هنا خط أنابيب كامل لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من القراءات الخام إلى التحليل الوظيفي. وينقسم خط الأنابيب إلى خمس خطوات: (1) مراقبة جودة البيانات؛ (2) نوعية البيانات؛ (2) نوعية البيانات؛ (2) نوعية البيانات؛ (2) نوعية البيانات؛ (2) نوعية (2) رسم خرائط الجينات والتعليق على هذه الجينات؛ (3) التحليل الإحصائي لتحديد الجينات المعرب عنها بشكل متمايز والجينات المعرب عنها؛ (4) تحديد الدرجة الجزيئية لازدراق العينات؛ و (5) التحليل الوظيفي. الخطوة 1 يزيل القطع الفنية التي قد تؤثر على جودة التحليلات المصب. في الخطوة 2، يتم تعيين الجينات وشرحها وفقا لبروتوكولات المكتبة القياسية. ويحدد التحليل الإحصائي في الخطوة 3 الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي أو التعبير عنها في العينات المصابة، بالمقارنة مع تلك غير المصابة. يتم التحقق من تقلب العينة ووجود القيم المتطرفة البيولوجية المحتملة باستخدام الدرجة الجزيئية لنهج الاضطراب في الخطوة 4. وأخيرا، يكشف التحليل الوظيفي في الخطوة 5 عن المسارات المرتبطة بالنمط الظاهري للمرض. يهدف خط الأنابيب المعروض إلى دعم الباحثين من خلال تحليل بيانات الحمض النووي الريبي-seq من دراسات التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض ودفع المستقبل في المختبر أو في تجارب الجسم الحي ، التي تعتبر ضرورية لفهم الآلية الجزيئية للعدوى.
المقدمة
وقد ارتبطت فيروسات الأربو، مثل حمى الضنك والحمى الصفراء وشيكونغونيا وزيكا، على نطاق واسع بعدة فاشيات متوطنة وبرزت كواحدة من مسببات الأمراض الرئيسية المسؤولة عن إصابة البشر في العقود الأخيرة1،2. غالبا ما يعاني الأفراد المصابون بفيروس شيكونغونيا (CHIKV) من الحمى والصداع والطفح الجلدي والتهاب المفاصل والتهاب المفاصل3,4,5. يمكن للفيروسات تخريب التعبير الجيني للخلية والتأثير على مسارات الإشارات المضيفة المختلفة. في الآونة الأخيرة، استخدمت دراسات نسخ الدم الحمض النووي الريبي-seq لتحديد الجينات المعرب عنها بشكل متفاوت (DEGs)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت لجان الأخلاقيات في كل من قسم علم الأحياء المجهرية التابع لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو والجامعة الاتحادية لسيرغيبي على العينات المستخدمة في هذا البروتوكول (البروتوكولان: 54937216.5.0000.5467 و54835916.2.0000.5546 على التوالي).
1. دوكر تثبيت سطح المكتب
ملاحظة: تختلف الخطوات لإعداد بيئة Docker بين أنظمة التشغيل (OSs). لذلك، يجب على مستخدمي Mac اتباع الخطوات المسرودة ك 1.1، ويجب على مستخدمي Linux اتباع الخطوات المدرجة ك 1.2، ويجب على مستخدمي Windows اتباع الخطوات المذكورة في القائمة 1.3.
- تثبيت على ماك.
- الوصول إلى موقع الحصول على دوكر (جدول المواد<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إنشاء بيئة الحوسبة لتحليلات النسخ وتكوينها على منصة Docker. هذا النهج يسمح للمستخدمين المبتدئين لينكس لاستخدام أنظمة المحطة الطرفية لينكس دون معرفة الإدارة المسبقة. يستخدم النظام الأساسي Docker موارد نظام التشغيل المضيف لإنشاء حاوية خدمة تتضمن أدوات مستخدمين محددة (الشكل 1B). تم إنشاء حاوية على أساس توزيع Linux OS Ubuntu 20.04 وتم تكوينها بالكامل للتحليلات النسخية ، والتي يمكن الوصول إليها عبر محطة سطر الأوامر. في هذه الحاوية، يوجد بنية مجلد معرفة مسبقا لمجموعات البيانات والبرامج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد إعداد مكتبات التسلسل خطوة حاسمة نحو الإجابة على الأسئلة البيولوجية بأفضل طريقة ممكنة. وسيسترشد بنوع المحاضر التي تهم الدراسة نوع مكتبة التسلسل التي سيتم اختيارها وتدفع التحليلات المعلوماتية الحيوية. على سبيل المثال ، من تسلسل تفاعل الممرض والمضيف ، وفقا لنوع التسلسل ، من الممكن تحديد التسلسلات من كلا أو فقط من نصوص المضيف.
ويقيس الجيل التالي من معدات التسلسل، مثل منصة إيلومينا، درجات جودة التسلسل، التي ترمز إلى احتمال تسمية قاعدة بشكل غير صحيح. التحليلات المصب حساسة جدا لتسلسل منخفض الجودة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
يتم تمويل HN من قبل FAPESP (أرقام المنح: #2017/50137-3، 2012/19278-6، 2018/14933-2، 2018/21934-5، و2013/08216-2) والمجلس الوطني لنواب الشعب (313662/2017-7).
نحن ممتنون بشكل خاص للمنح التالية للزملاء: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5)، VEM (FAPESP Process 2019/16418 -0)، IMSC (FAPESP عملية 2020/05284-0)، APV (FAPESP عملية 2019/27146-1) و، RLTO (عملية CNPq 134204/2019-0).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مختبر بيولوجيا الأنظمة الحاسوبية | CEMiTool | 1.12.2 | اكتشاف وتحليل وحدات الجينات ذات التعبير المشترك بطريقة تلقائية بالكامل ، مع توفير تقرير HTML سهل الاستخدام مع رسوم بيانية عالية الجودة. |
| EdgeR | Bioconductor (المشرف: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au]) | 3.30.3 | تحليل التعبير التفاضلي لملامح تعبير الحمض النووي الريبي مع النسخ المتماثل البيولوجي |
| المحسن الموصل الحيوي البركان | (المشرف: كيفن بليغي [كيفن في clinicalbioinformatics.co.uk]) | 1.6.0 | مخططات البراكين الجاهزة للنشر مع تلوين ووضع العلامات |
| المحسنة FastQC | Babraham Bioinformatics | 0.11.9 | يهدف إلى توفير طريقة بسيطة لإجراء بعض فحوصات مراقبة الجودة على بيانات التسلسل الخام القادمة من تسلسل الإنتاجية العالية |
| المعلوماتية الحيوية FeatureCounts ، معهد والتر وإليزا هول للبحوث الطبية | 2.0.0 | تعيين قراءات التسلسل المعينة للميزات الجينومية المحددة | |
| MDP | مختبر بيولوجيا الأنظمة الحاسوبية | 1.8.0 | تحسب الدرجة الجزيئية للاضطراب درجات عينات بيانات النسخ بناء على اضطرابها من عناصر التحكم |
| R | R Core Group | 4.0.3 | لغة البرمجة وبيئة البرمجيات المجانية للحوسبة الإحصائية والرسومات |
| قسم المعلوماتية الحيوية STAR ، معهد والتر وإليزا هول للبحوث الطبية | 2.7.6a | تم تصميم Aligner لمعالجة العديد من تحديات رسم خرائط بيانات RNA-seq على وجه التحديد باستخدام استراتيجية لحساب المحاذاة المقسمة | |
| Bowtie2 | جامعة جونز هوبكنز | 2.4.2 | أداة فائقة السرعة وفعالة للذاكرة لمحاذاة قراءات التسلسل مع التسلسلات المرجعية الطويلة |
| Trimmomatic | THE USADEL LAB | 0.39 | مهام تسلسل محول التشذيب لبيانات Illumina المقترنة والأحادية |
| احصل على Docker | Docker | 20.10.2 | إنشاء بيئة معلوماتية حيوية قابلة للتكرار والتنبؤ بها (https://docs.docker.com/get-docker/) |
| WSL2-Kernel | Windows | NA | https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel |
| الحصول على Docker Linux | Docker | NA | https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/ |
| مستودع Docker Linux | Docker | NA | موقع https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository |
| MDP | مختبر الأحياء الأنظمة الحاسوبية | NA | https://mdp.sysbio.tools |
| Enrichr الموقع الإلكتروني | MaayanLab | NA | https://maayanlab.cloud/Enrichr/ |
| webCEMiTool | مختبر الأحياء للأنظمة الحاسوبية | NA | https://cemitool.sysbio.tools/ |
| gProfiler | المعلوماتية الحيوية والخوارزميات واستخراج البيانات مجموعة | NA | https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost |
| goseq | Bioconductor (المشرف: ماثيو يونغ [my4 في sanger.ac.uk]) NA | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html | |
| SRA دراسة NCBI | NA | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/ |
المراجع
- Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases. Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).
- Burt, F. J., et al. Chikungunya virus: an update o....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
