Gene Knock-in di CRISPR/Cas9 e smistamento cellulare in macrofagi e linee cellulari T

Lichen Zhang; Rong Huang; Liaoxun Lu; Rui Fu; Guo Guo; Yanrong Gu; Zhuangzhuang Liu; Le He; Marie Malissen; Yinming Liang

doi:10.3791/62328

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Gene Knock-in di CRISPR/Cas9 e smistamento cellulare in macrofagi e linee cellulari T

11K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/62328

⸱

13 novembre 2021

Lichen Zhang¹ , Rong Huang¹ , Liaoxun Lu¹ , Rui Fu¹ , Guo Guo¹ , Yanrong Gu¹ , Zhuangzhuang Liu¹ , Le He¹ , Marie Malissen² , Yinming Liang¹

¹The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, ²Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo utilizza reporter fluorescenti e ordinamento cellulare per semplificare gli esperimenti knock-in in macrofagi e linee cellulari T. Per questi esperimenti di knock-in semplificati vengono utilizzati due plasmidi, vale a dire un plasmide che esprime CRISPR / Cas9 e DsRed2 e un plasmide donatore di ricombinazione omologa che esprime EBFP2, che è permanentemente integrato nel locus Rosa26 nelle cellule immunitarie.

Abstract

Gli studi di genomica funzionale del sistema immunitario richiedono manipolazioni genetiche che comportano sia la delezione di geni bersaglio che l'aggiunta di elementi alle proteine di interesse. L'identificazione delle funzioni geniche in modelli di linee cellulari è importante per la scoperta e l'esplorazione dei meccanismi intrinseci delle cellule. Tuttavia, le manipolazioni genetiche delle cellule immunitarie come le cellule T e le linee cellulari dei macrofagi utilizzando il knock-in mediato da CRISPR / Cas9 sono difficili a causa della bassa efficienza di trasfezione di queste cellule, specialmente in uno stato quiescente. Per modificare i geni nelle cellule immunitarie, la selezione della resistenza ai farmaci e i vettori virali sono tipicamente utilizzati per arricchire le cellule che esprimono il sistema CRIPSR / Cas9, il che si traduce inevitabilmente in un intervento indesiderato delle cellule. In uno studio precedente, abbiamo progettato due reporter fluorescenti accoppiati a CRISPR / Cas9 che sono stati espressi transitoriamente dopo l'elettroporazione. Questa soluzione tecnica porta a una rapida delezione genica nelle cellule immunitarie; tuttavia, il knock-in genico nelle cellule immunitarie come le cellule T e i macrofagi senza l'uso della selezione della resistenza ai farmaci o dei vettori virali è ancora più impegnativo. In questo articolo, mostriamo che utilizzando lo smistamento cellulare per aiutare la selezione di cellule che esprimono transitoriamente costrutti CRISPR / Cas9 che prendono di mira il locus Rosa26 in combinazione con un plasmide donatore, il knock-in genico può essere ottenuto sia nelle cellule T che nei macrofagi senza arricchimento della resistenza ai farmaci. Ad esempio, mostriamo come esprimere ACE2 umano, un recettore di SARS-Cov-2, responsabile dell'attuale pandemia di Covid-19, nei macrofagi RAW264.7 eseguendo esperimenti knock-in. Tali cellule knock-in geni possono essere ampiamente utilizzate per studi meccanicistici.

Introduzione

Le cellule immunitarie sono fondamentali per la difesa contro gli agenti patogeni. Sia l'immunità innata che quella adattativa sono necessarie per la clearance degli infettanti e il mantenimento dell'omeostasi tissutale¹^,². I modelli di linee cellulari sono strumenti essenziali per comprendere i fondamenti molecolari del sistema immunitario dei mammiferi; sono utilizzati in saggi funzionali in vitro, come quelli che modellano l'attivazione delle cellule T umane, e nel determinare la funzione dei fattori genetici nell'attivare o smorzare le risposte immunitarie^3,