Summary
Odling ctcs möjliggör en djupare funktionell karakterisering av cancer, genom att analysera specifika markör uttryck, och bedöma läkemedelsresistens och förmågan att kolonisera levern bland andra möjligheter. Sammantaget kan CTC-kulturen vara ett lovande kliniskt verktyg för personlig medicin för att förbättra patientens resultat.
Abstract
Metastasering är en ledande orsak till cancerdöd. Trots förbättringar i behandlingsstrategier har metastaserad cancer en dålig prognos. Vi står därför inför ett akut behov av att förstå mekanismerna bakom metastaseringsutveckling och därmed föreslå effektiva behandlingar för avancerad cancer. Metastaserande cancer är svåra att behandla, eftersom tarmbiopsier är invasiva och otillgängliga. Nyligen har det funnits ett stort intresse för flytande tarmbiopsier inklusive både cellfri cirkulerande deoxyribonukleinsyra (DNA) och cirkulerande tumörceller från perifert blod och vi har etablerat flera cirkulerande tumör cellinjer från metastaserade kolorektalcancerpatienter för att delta i deras karakterisering. För att funktionellt karakterisera dessa sällsynta och dåligt beskrivna celler är det avgörande steget att expandera dem. När det har etablerats kan cirkulerande tumörcelllinjer (CTC) sedan odlas i suspension eller vidhäftande förhållanden. På molekylär nivå kan CTC-linjer användas ytterligare för att bedöma uttryck av specifika markörer av intresse (såsom differentiering, epitelial eller cancerstamceller) genom immunofluorescens- eller cytometrianalys. Dessutom kan CTC-linjer användas för att bedöma läkemedelskänslighet mot guldstandard kemoterapier samt riktade terapier. Förmågan hos CTC linjer att initiera tumörer kan också testas genom subkutan injektion av CTC i immunodeficient möss.
Slutligen är det möjligt att testa rollen av specifika gener av intresse som kan vara involverade i cancerspridning genom att redigera CTC-gener, med kort hårnål ribonukleinsyra (shRNA) eller Crispr /Cas9. Modifierade CTC kan således injiceras i immunbristmus mjältar, för att experimentellt efterlikna en del av den metastaserande utvecklingsprocessen in vivo.
Sammanfattningsvis är CTC-linjer ett värdefullt verktyg för framtida forskning och för personlig medicin, där de kommer att möjliggöra förutsägelse av behandlingseffektivitet med hjälp av just de celler som ursprungligen är ansvariga för metastasering.
Introduction
Trots de senaste förbättringarna i tidig cancerdiagnos och i terapeutisk strategi beror mer än nittio procent av cancersjuklighet fortfarande på metastasering1. Den metastaserade processen är en flerstegskaskad som börjar med lokal frigörelse av celler från den primära tumören och deras ingång i blodomloppet där de blir cirkulerande tumörceller (CTC) för att slutligen kolonisera avlägsna platser som lever och lungor, vid kolorektal cancer (CRC)2. Nyligen har det varit växande uppmärksamhet på flytande tarmbiopsier, som är ett icke-invasivt verktyg för att särskilt upptäcka och räkna upp CTC från patientens blodprover. Intratumor genetisk heterogenitet är en viktig orsak till läkemedelsresistens; således utgör isolering av representativa celler från tumörmaterial ett lovande verktyg för personlig medicin3.
Trots låg frekvens av CTC i blodet (1 CTC per 106 - 107 leukocyter)4utvecklades flera detektions- och isoleringstekniker baserat på egenskapsskillnader mellan CTC och andra komponenter i blodet5. Antalet CTC i patientblodprover kan ensamt ge information om malignitetsstadiet, behandlingssvaret och sjukdomsprogression6,7. Således är CTC-isolering ett viktigt verktyg för translationella studier för att bedöma genetisk heterogenitet eller utföra läkemedelsscreening, liksom för grundläggande studier för att karakterisera dessa invasiva celler, eftersom de är nyckelaktörerna för metastaserad induktion8,9. Jämfört med kommersiellt etablerade cancer cellinjer som har ackumulerat tusentals mutationer över tiden, nya CTC delar huvuddragen i den ursprungliga primära tumören inklusive en potent kapacitet att metastasera, och de är en bättre återspegling av sjukdomen. Dessa funktioner gör dem till ett robust verktyg för grundläggande studier, särskilt i knockout experiment av förutsagda nyckelfaktorer som är involverade i metastasering. Resultatet av dessa experiment kan valideras in vivo, på möss, enligt beskrivningen nedan.
När CTC har isolerats kan de utökas under icke-vidhäftande odlingsförhållanden och sedan kan de manipuleras precis som alla tillgängliga cancercelllinjer, dvs. de kan också odlas under vidhäftande förhållanden eller bäddas in i Matrigel, beroende på den vetenskapliga frågan10. Till exempel, för att testa uttrycket och lokaliseringen av ett protein av intresse, kan CTC-sfärer odlas i suspensionstillstånd och bäddas in i Histogel för att utföra immunofluorescens på sfärsektioner. Dessutom, om proteinet är membranous, kan dess uttryck på levande celler mätas med cytometri.
För funktionella studier, för att testa rollen av ett protein av intresse som kan spela en roll i lever kolonisering, CTC med gener redigeras, genom shRNA eller CRISPR/Cas9, kan injiceras i mjälten av immunodeficient möss. Detta senare experiment är en kraftfull modell för att efterlikna levermetastaskolonisering11.
CtCs förmåga att initiera tumörer kan bedömas genom att injicera ett mycket litet antal celler i immunbrist möss. Eftersom tumörinitiering är ett kännetecken för cancerstamceller (CSCs) kommer denna analys att indikera andelen CSCs inom CTC-linjer. Denna stamcellsfenotyp gör cirkulerande tumör cellinjer resistenta mot vissa guldstandard cancerbehandlingar. Utökade CTC kan därför användas för att screena läkemedel och fastställa den bästa möjliga effektiva behandlingen för patienten. CTC-svar på behandling kan testas in vitro med hjälp av en luminiscens lönsamhetsanalys, till exempel.
I ett långsiktigt perspektiv skulle läkemedelsscreening på nyisolerade och förstärkta CTC kunna användas som ett nytt verktyg för personlig medicin för att hjälpa till att välja den mest effektiva och anpassade behandlingen för patienter.
I det här dokumentet beskrivs protokoll för att odla CTC-linjer, för att färga specifika proteiner via immunstaining och cytometri, för att utföra cytotoxicitetsanalyser samt in vivo xenograft experiment med CTC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla in vivo-protokoll godkändes av de djuretiska organen.
1. CTC-förstärkning i 3D-odlingsförhållanden
- För att odla CTC i suspension, första frö CTC i brunnar av en Ultra-Low Attachment (ULA) 24-brunnsplatta vid maximal koncentration av 5 celler/μL och i 1 mL M12 medium (dvs avancerat DMEM-F12 kompletterat med 2 mM l-glutamin,100Unit/mL penicillin och streptomycin, N2 tillägg, 20 ng/mL epidermal tillväxtfaktor).
- För att tillåta sfärbildning och cellexpansion, inkubera cellerna under hypoxiska förhållanden (2% O2) mellan 6 och 10 dagar.
- När sfärerna är tillräckligt stora (100 μm), för att förhindra nekros, separera dem för förstärkning.
- Placera cellfjädringen i ett 2 ml-rör eller ett 15 ml-rör och centrifug vid 300 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 500 μL försiktigt dissociationsreagens (t.ex. Accumax) till pelleten.
- Virvel försiktigt och inkubera cell suspensionen med skonsam dissociation reagens i 20 till 30 minuter vid 37 °C.
OBS: Att överskrida inkubationstiden i det milda dissociationreagenset (Accumax) kan orsaka onormal ökad celldödlighet. - Tillsätt 1,5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugera röret i 5 minuter vid 300 x g.
- Häll av supernatanten och återanvänd pelleten i färskt M12-medium för att nå densiteten hos 1-5 celler per μL.
- Så cellfjädringen i nya brunnar på en ultralåg fästplatta: 10 ml för T75-flaskor, 2 ml för 6 brunnsplattor och 100 μL för 96 brunnsplattor
2. Immunofluorescens (IF) Färgning på CTC-sfärsektioner
- Centrifugera CTC-sfärerna i ett 15 ml-rör vid 300 x g i 5 minuter, aspirera supernatanten och tvätta pelleten två gånger med PBS.
- Återanvänd pelleten med 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA) och inkubera i 20 minuter på is. Centrifugera suspensionen vid 300 x g och tvätta två gånger med 5 ml PBS.
- Resuspend pelleten med (dvs. 15 till 20 μL) varm och flytande Histogel. Med en pipett, ta all suspension och gör en droppe på en förkyld yta vid 4 °C och låt den polymerisera i 5 till 10 minuter.
OBS: Arbeta snabbt för att undvika polymerisation av suspensionen i spetsen. - Lossa den fasta droppen med bladet på en skalpell och sätt in den i en inbäddningskassett i facket.
- Utför följande steg: paraffininkludering, paraffinsektion, sektionsrehydrering, antigenhämtning och antikroppinkubation. Dessa steg är desamma som för alla tumörer eller organ som är inbäddade i paraffin och bearbetas för immunofluorescensfärgning12.
OBS: Kassetten kan förvaras i 70% etanol vid 4 °C tills paraffininbäddningen.
3. Cytometrianalys
- Centrifugera CTC-sfärer i ett 15 ml-rör vid 300 x g i 5 minuter och tvätta pelleten två gånger med PBS.
- Aspirera på supernatanten och tillsätt 500 μL av det milda dissociationsreagenset till pelleten.
- Virvel försiktigt och inkubera cellfjädringen med det milda dissociationsreagenset i 20 till 30 min vid 37 °C.
OBS: Mer än 40 minuters inkubation i det milda dissociationsreagenset (Accumax) kan leda till en onormal ökad celldödlighet. - Centrifugera cellfjädringen i 5 min vid 300 x g, eliminera supernatanten och återanvänd pelleten i 5 ml blockeringsbuffert (dvs. PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA)).
- Passera cellupphängningen genom en 40 μm cellsil för att eliminera de återstående sfärerna.
- Efter räkning, lägg 200 000 celler i tre fluorescensaktiverade cellsorteringsrör (FACS), centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och ta bort supernatanten. Använd ett av de tre FACS-rören som en kontroll som inte får några färgreagenser.
- Enligt databladet, tillsätt lämplig antikropp i de två återstående FACS-rören (dvs. en konjugerad antikropp mot proteinet av intresse, en konjugerad isotypkontroll).
- Efter rekommenderad inkubationstid tillsätt 300 μL av blockeringsbufferten för att tvätta cellerna, centrifugera de 3 rören vid 300 x g och aspirera på supernatanten. Upprepa det här steget två gånger. Återanvänd sedan pelleten med blockeringsbufferten med ett reagens för cellviabilitetsfärgning (med undantag för FACS-rörkontrollen utan färgning).
- Håll rören på is tills FACS-analysen. Använd först röret utan färgning för att identifiera porten för cellens livskraft och antikroppsfärgningen. Analysera sedan FACS-röret med den konjugerade antikroppen mot proteinet av intresse, för att kvantifiera andelen CTC som uttrycker proteinet av intresse. FACS-röret med den konjugerade isotypkontrollen bör inte indikera ett skifte. Detta bekräftar att skiftet är specifikt för det riktade proteinet av intresse.
OBS: Använd om möjligt en cellinje som uttrycker en hög nivå av protein av intresse som en positiv kontroll och en cellinje som inte uttrycker proteinet som en negativ kontroll.
4. Luminiscens viabilitetsanalys (CellTiter-Glo)
- Återsuspend dissocierade CTC (enligt beskrivningen i avsnitt 1.4.5) i M12 medium. Räkna cellerna och anpassa cellkoncentrationen till 200 000 celler/ml.
- I en ULA 96-brunnsplatta, frö 10 000 dissocierade CTC per brunn, i 50 μL, och inkubera plattan i hypoxi (2% O2) i 24 timmar.
- Följande dag tillsätt 50 μL av det testade läkemedlet till CTC: erna. Det rekommenderas tidigare att utföra en titrering av läkemedelskoncentrationen, för att bestämma den halv maximala hämmande koncentrationen (IC50). Behandla vissa brunnar med fordon endast för att bestämma basalcellens livskraft.
OBS: Antalet celler som såds kan variera mellan CTC-linjer, beroende på deras fördubblingstid. Dessutom bör celler sås i tre exemplar för att minimera resultatvariationen. - Inkubera plattor i hypoxi i ytterligare 48 timmar.
- På dag 3 placerar du de odlade plattorna och luminiscenscellens livskraftsbuffert och substrat vid rumstemperatur och rekonstruerar substratet med en lämplig buffertvolym, enligt tillverkarens protokoll.
- Tillsätt 70 μL av luminiscensviabilitetsblandningen i varje odlad platta väl. Sätt plattor på en orbital shaker i 20 minuter för att inducera celllys och överför sedan 100 μL av blandningen till en ogenomskinlig murad flerbrunnplatta, kompatibel med luminometern.
- Låt plattan vila i rumstemperatur, täck den med aluminiumfolie för att stabilisera den självlysande signalen.
OBS: Luminescentsignalen är stabil i upp till 3 timmar. - Spela in luminiscens med en mikroplattaläsare (dvs. Tecan Infinite 200 Pro).
- För dataanalys beräknar du medelvärdet för den tredubbla relativa ljusenheten RLU per villkor. För att bedöma den procentandel av livskraften enligt varje läkemedelskoncentration som behövs: (RLU av behandlade celler/RLU för obehandlade celler) x 100.
5. Subkutana injektioner
- I ett mikrocentrifugerör, återanvänd celler i 100 μL steril PBS. Om antalet injicerade celler är lågt, återanvänd celler i 1:1 PBS/Matrigel, minskat i tillväxtfaktorer, för att koncentrera celler tillsammans och främja tumörinitiering.
OBS: Celltätheten kan vara från 10 celler (för att utmana tumörinitieringskapaciteten) till 1 miljon celler beroende på den vetenskapliga frågan och syftet med experimentet. - Dra upp hela volymen i en insulinspruta.
- På en immunbrist mus, nyp ihop flankens hud mellan pekpek och ringfingret och sätt försiktigt in nålen vid hudens botten.
OBS: Denna procedur är inte smärtsam och görs på medvetna möss. - Injicera långsamt volymen på samma plats för att förhindra att cellerna sprids. Detta kommer att skapa en liten bleb under huden.
- Tryck försiktigt på injektionsstället för att förhindra att volymen flödar tillbaka.
- Övervaka tumörtillväxten varannan dag med hjälp av ett bromsok.
- Offra djuret om tumören överstiger 1500 mm3. Beroende på materialtillgängligheten, avliva mössen genom koldioxid eller anestesigaser inandning eller genom livmoderhalscancer förskjutning.
6. Intrasplenic injektion
- Innan du startar, autoklavera de kirurgiska instrumenten (saxar och tångar) vid 124 °C i 15 minuter och rengör alla ytor i arbetsutrymmet med 70% etanol.
- I ett mikrocentrifugerör återanvänder du celler i 50 μL steril PBS och förvarar dem på is. Celldensiteten kan gå från 0,5 till 1 miljon celler. Ett större antal celler kan orsaka en blodproppsutveckling i blodcirkulationen.
- Innan cellerna injiceras, injicera 100 μL av 0, 015 mg/mL buprenorfin subkutant, för smärtlindring.
- Placera musen i en induktionskammare, där isofluran hålls vid 3%, i 2-3 min. När djuret inte längre reagerar på rörelse, lägg det på höger sida på en värmeplatta och behåll anestesin med hjälp av en andningskrets ansiktsmask som levererar en gasblandning av O2 och isofluran.
- Applicera ögonsmörjmedel över varje öga för att undvika ögontorkning under operationen. Desinficera bröstområdet med Povidone-jodlösning (dvs. betadin).
- På dorsoventralsidan, gör ett litet snitt på 0,5 cm med sax under det 10: e falska revbenet.
- Lyft försiktigt ut mjälten och lägg den på steril gasväv. Injicera 50 μL CTC i spetsen av mjälten med hjälp av en insulinspruta. Se till att hålla sprutan upprätt och vänta 3-5 min för att undvika återflöde och ta sedan bort nålen.
- Liga de mjältekärlen från de två sidorna (artärer och vener) och ta bort mjälten genom att skära direkt ovanför de två ligaturerna. Mjälten avlägsnas för att förhindra oönskad tumörbildning i detta organ.
- Sy bukhinnan och sedan huden med 5,0 nedbrytbara sterila suturer.
- Håll musen varm tills den är full återhämtning från anestesi.
- Övervaka musen 3 dagar i veckan för onormal kroppsfunktion, onormal rörelse och hållning och för viktminskning.
- Offra djuret när humana slutpunkter når (cirka 6 veckor efter operationen) för att analysera levermetastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både EpCAM- och CD26-uttryck som observerats av IF(figur 1A höger panel) respektive FACS ( figur1B) anger att CTC-linjen är epiteliell och visar ett av CSC-kännetecknen10. Detta epitelial drag kan ytterligare karakteriseras av färgning med antikroppar riktade mot andra epitelial och mesenchymal markörer. Därmed kan det vara möjligt att ungefär veta var CTC-linjen är längs epitelial-mesenkymalaxeln. Uttryck av andra CSC markörer kan också testas av både immunostaining och cytometry. Annars kan funktionella tester som läkemedelsresistens och tumörinitieringsanalys in vivo validera denna CSC-fenotyp10. Här visar till exempel luminiscensviabilitetsanalys att CTC IC50 endast uppnås vid hög läkemedelskoncentration som belyser den höga resistensen hos dessa celler(figur 2). Dessutom visar subkutan CTC-injektion att denna CTC-linje har tumörogen förmåga (figur 3A). Dessa senare resultat bekräftar CSC fenotyp av denna CTC linje. Att utmana tumörinitieringskapaciteten genom att injicera från 10 till 10 000 celler kan förfina uppskattningen av den tumörogena förmågan. Slutligen visar levermetastasbildning genom att efterlikna spridning genom intrasplenic injektion att denna CTC-linje kan överleva i ett avlägset organ och har en metastaserad potential (figur 3B). Denna metastaserande potential kan jämföras med andra cellinjer eller utmanas genom att hämma specifika genuttryck eller vid kemoterapi administrering hos möss efter intrasplenic injektion.
Figur 1: Analys av mikroskopi och flödescytometri av CTC-sfärer visar att de uttryckte både epitel- och CSC-markörer. (A) Vänster panel: CTC-sfärer odlade i 6 dagar före inbäddning. Höger panel: epifluorescensmikroskopianalys av inbäddade CTC-sfärer i Histogel. 5 μm sektioner av inbäddade CTC sfärer färgades av en antikropp mot epitelialmarkör epitelial cell vidhäftningsmolekylen (EPCAM) (i rött) och kärnan är märkt med DAPI (i blått). Skalstången är 20 μm. (B) Flödescytometrianalys av levande enstaka CTC. Övre högra FACS-diagrammet visar CTC med en bärkraftsmarkör för att endast gate levande celler. Nedre vänstra FACS-området visar CTC märkta med APC-konjugerad isotypkontroll för att gate positivt märkta celler. Nedre högra FACS-området visar CTC märkta av APC-konjugerad CD26-antikropp för att bedöma andelen celler som uttrycker denna CSC-markör (67%). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativt resultat av celltillväxtanalysen med hjälp av en luminiscensviabilitetsanalys. IC50 nås på x μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CTC har en tumörogen och metastaserad potential. (A) Subkutan injektion av 200 000 CTC på höger flank av nakna möss. Bilder togs 1 månad efter injektionen och tumör storlek mättes 3 gånger per vecka. (B) Intrasplenic injektion av CTC för att efterlikna lever metastaserad kolonisering. Höger panel: representativt foto av muslever dissekeras 4 veckor efter intrasplenic injektion av 300,000 CTC. Vänster panel: mus lever dissekeras 4 veckor efter intrasplenic injektion av PBS. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs ovan användes ursprungligen för kolorektal CTC funktionell karakterisering, men det kan användas för andra typer av cancer såsom bröstcancer och kan anpassas för musmodeller.
Den verkliga begränsande faktorn är antalet CTC som finns i blodprovet och effektiviteten hos den teknik som används för att isolera och expandera dem. Flera CTC-isoleringsteknik har beskrivits baserat på specifika CTC-egenskaper som Parsortix, en mikrofluidisk enhet, som möjliggör isolering av CTC baserat på cellstorleken och dess komprimerbarhet13. Dessutom finns CellSearch, en immunobeadbaserad analys som är den enda FDA-godkända metoden för att räkna upp CTC i blodprover baserat på en negativ CD45-märkning för att eliminera kontaminerande lymfocyter i kombination med positiv epitelmarkörmärkning som EpCAM och cytokeratin 8/18/1914. iChip är en annan storleksbaserad teknik men kombinerar också CTC-anrikningen med antingen ett EpCAM-baserat positivt urval eller CD45 negativ utarmning15,16. Slutligen har vi nyligen använt den snabba och enkla immunodensityproceduren, Rosette sep kit, för att isolera och förstärka CTC från kolorektal cancerpatient blodprov10.
Om du arbetar med en musmodell är det också möjligt att slå samman musblodprover från samma kohort för att öka antalet CTC och chansen att förstärka dem i kulturen. När det gäller murin CTC, Det är inte obligatoriskt att använda immunodeficient möss för att testa levern kolonisering genom intrasplenic injektion. Kontrollmöss med samma genetiska bakgrund kan användas som mottagarmöss utan någon påverkan av immunsvaret.
När CTC förstärks i suspension kan de jämföras med andra cancer cellinjer från samma typ av cancer med hjälp av varje teknik som beskrivs här. I detta fall måste olika cancer cellinjer odlas under samma förhållanden. Särskild uppmärksamhet måste ägnas medfödd autofluorescens, för immunofluorescensfärgning och cytometrianalys. CTC och varje cancercelllinje som används måste testas utan färgning i de olika fluorescerande kanalerna.
Om de CTC som studeras kan följa och föröka sig under vidhäftande förhållanden som någon klassisk cellinje, kan de tekniker som beskrivs ovan anpassas för celler som expanderas under dessa förhållanden. De resulterande avläsningarna kommer sannolikt därmed att vara mer relevanta där cellerna kommer från mer differentierade cancercellpopulationer eftersom celler tenderar att vara mindre differentierade i suspension.
Sammanfattningsvis är CTC-linjer mycket värdefulla verktyg för att djupt karakterisera mekanismer som är involverade i metastaserande processer som leder cancerdödlighet, och i framtiden när kulturens framgångsgrad förbättras kan CTC användas för att föreslå den bästa terapeutiska strategin anpassad till varje patient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Detta forskningsprojekt i Pannequin-labbet stöddes av forskningsanslag från SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Doktorsavhandlingarna av Guillaume Belthier och Zeinab Homayed stöddes av anti-cancerligan/Ligue contre le Cancer. Céline Boucliers lön finansierades av "region Occitanie". Tack till Julian Venables för engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
