从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析

Summary

本研究描述了一种分离小鼠棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析的新方法。

Abstract

棕色脂肪组织（BAT）负责哺乳动物的非颤抖产热，棕色脂肪细胞（BA）是BAT的功能单位。BAs含有多房脂滴和丰富的线粒体，它们表达解偶联蛋白1（UCP1）。BA根据其起源分为两种亚型：胚胎衍生的经典BA（cBA）和白色脂肪细胞衍生的BA。由于其密度相对较低，传统的离心方法无法从BAT中分离出来。本研究开发了一种从小鼠中分离BA进行基因和蛋白质表达分析的新方法。在该协议中，用胶原酶和分散酶溶液消化成年小鼠的肩胛间BAT，并用6%碘沙醇溶液富集解离的BA。然后用Trizol试剂裂解分离的BA，以同时分离RNA、DNA和蛋白质。RNA分离后，裂解物的有机相用于蛋白质提取。我们的数据显示，6%碘沙醇溶液有效地富集了BAs，而不会干扰后续的基因和蛋白质表达研究。血小板衍生生长因子（PDGF）是一种调节间充质细胞生长和增殖的生长因子。与棕色脂肪组织相比，分离的BAs具有显着更高的 Pdgfa表达。总之，这种新方法为在单细胞类型水平上研究棕色脂肪细胞的生物学提供了一个平台。

Introduction

小鼠和人类都有两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）¹。WAT以甘油三酯的形式将能量储存在白色脂肪细胞中，BAT的棕色脂肪细胞（BAs）以热量的形式耗散化学能²。根据其发育起源，BA进一步分为胚胎发育过程中形成的经典BA（cBA）和白色脂肪细胞衍生的BA（米色/白细胞，在应激条件下从白色脂肪细胞转化而来）³。BA是多房的，表达产热蛋白解偶联蛋白1（UCP1）⁴。肩胛间蝙蝠（iBAT）储存库是小型哺乳动物⁵的主要cBAs储存库之一，而米色细胞分散在WAT⁶内。

由于其耗散能量的性质，BAs作为减少肥胖的治疗靶点而受到广泛^关注7。为了利用BA治疗肥胖症，必须了解控制BA功能，存活和募集的分子机制。脂肪组织包括BAT和WAT是异质的。除脂肪细胞外，脂肪组织还含有许多其他细胞类型，例如内皮细胞，间充质干细胞和巨噬细胞⁸。尽管存在特异性消耗小鼠BA候选基因的遗传工具，例如UCP1：：Cre系⁹，但从BAT或WAT纯化BA的技术有限，因此难以在单细胞类型水平上研究BA。此外，如果没有获得纯BA，BA和非BA之间的关系将无法明确界定。例如，血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）已被用作未分化间充质细胞的标志物，并在BAT的内皮和间质细胞中表达。在冷应激的BAT中，PDGFRα阳性祖细胞产生新的BAs¹⁰。PDGFRα被其配体PDGF激活，PDGF是一种调节间充质细胞生长和增殖的生长因子¹¹;然而，尚不清楚BAs是否通过分泌PDGF影响PDGFRα阳性祖细胞的行为。

最近，基于荧光激活细胞分选（FACS）的BAs分离方案已经发布¹²。在该方案中，使用3%牛血清白蛋白（BSA）溶液将BAs与非BAs分离，并通过FACS进一步纯化富集的BAs。该协议的应用受到FACS过程要求的限制，该过程依赖于设备和FACS操作经验。在这项研究中，开发了一种将BA与BAT分离的新协议。通过该方案分离的BA可以直接用于基因和蛋白质表达研究。此外，这项研究的数据表明，BA是PDGF的主要资源。

Protocol

所有小鼠均在无病原体条件下饲养，所有程序均由共济会医学研究机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。UCP1：：Cre⁹ 和Rosa 26^tdTomato 小鼠系¹³ 之前已报道。将所有小鼠保持在室温下，进行12小时的光照/黑暗循环。

1. 制备溶液和棕色脂肪组织（BAT）

1. 在 15 mL 离心管中制备消解溶液和分离溶液。
2. 10 mL BAT 消化液：在 10 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中加入 3.5 mg/mL 分散酶 II、1 mg/mL 胶原酶 II 和 10 mM CaCl₂ 以制成 BAT 消化溶液。
3. 10 mL 12% 碘沙醇溶液（分离溶液）：混合 1 mL 10x PBS、2 mL 60% 碘沙醇、0.01 mL 1 M MgCl 2、0.025 mL 1 M KCl、0.1 mL 0.2 M 乙二胺四乙酸 （EDTA） 和 6.865 mL ddH₂ O 以获得 12% 碘沙醇。
4. 对一只 CO₂ 过量的成年小鼠实施安乐死。简而言之，以每分钟10-30%的笼体积的置换_{率填充小鼠} 笼子，5分钟后，通过检查是否没有明显呼吸来确认死亡。
5. 解剖动物并收集肩胛间BAT。在体视显微镜下去除WAT和肌肉层。
6. 为了获得足够的消解，将每个BAT波瓣切成~3mm³ 份，并将它们放入带有金属搅拌棒和5mL消解溶液的干净的50mL烧瓶中。在开始消化之前，让含有BAT和消化缓冲液的烧瓶在冰上放置1小时。
   注意：在以下步骤中，大约80mg BAT用于棕色脂肪细胞分离。

2. BA隔离程序

1. 将烧瓶放在封闭在培养箱中的磁力搅拌器上。将搅拌速度分别设置为60rpm，培养箱温度设置为35°C。消化将持续约30分钟。如果BAT切片在消化过程中在搅拌棒周围形成团块，请使用1 mL移液器吸头破坏聚集组织。
2. 将 70 μm 过滤器放在干净的 50 mL 离心管顶部。通过过滤器吸取约 4 mL 细胞悬液。用 4 mL 12% 碘沙醇溶液清洗过滤器。上下移液以混合细胞和碘沙醇溶液。将细胞混合物转移到两个透明的 5 mL 聚苯乙烯试管中。
   注意：在消化结束时，消化溶液应该是浑浊的，表明充分消化。每次都使用新鲜的消化液。制备后，消化溶液应在2小时内使用。
3. 如果消化不足，请再次重复步骤2.2和2.3。
4. 将含有分离溶液和BA的透明聚苯乙烯管在冰上放置1小时。BA 将在顶部形成一层。
5. 取出 20 μL 分离的 BA 进行显微镜检查。

3. 从BA中分离RNA和蛋白质

1. 将 BAs 层移液到两个 1.7 mL 微量离心管中，用于 RNA 和蛋白质分离。小心地去除过量的碘沙醇溶液，不要破坏BAs层。
2. 加入 1 mL Trizol 以同时将 RNA、DNA 和蛋白质分离到细胞溶液中。充分混合以裂解细胞。
3. 加入 200 μL 氯仿以分离相。
4. 将管在4°C下离心9，981× g10 分钟。
5. 离心后，使用水相进行RNA分离。本研究采用总RNA进行逆转录，采用实时荧光定量PCR进行定量RT-PCR。引物序列列在 材料表中。
6. 将 300 μL 有机相转移到 2 mL 微量离心管中。
7. 向有机相中加入2.5体积的100%乙醇并涡旋10秒。
8. 加入 200 μL 1-溴-3-氯丙烷并涡旋 10 秒。
9. 加入 600 μL 双蒸水并涡旋 10 秒。
10. 让混合溶液在室温下静置10分钟。
11. 在4°C下以9，981× g 离心10分钟。 在此步骤中，阶段将被分开。蛋白质相位于中间层。
12. 除去顶部水溶液。在剩余的溶液中加入 1 mL 100% 乙醇。
13. 离心10分钟，9，981× g，4°C。 离心后，将形成蛋白质沉淀。弃去上清液。
14. 用 1 mL 100% 乙醇洗涤沉淀。
15. 离心10分钟，9981× g，4°C。 保存沉淀并丢弃上清液。
16. 在室温下风干沉淀10分钟。
17. 测量湿颗粒的重量。以 20 μL/mg 沉淀的比例加入 1% SDS 溶液。
18. 通过将管放入加热的摇床中溶解沉淀。将温度设置为 55 °C，将速度设置为 11 x g。通常需要5-10分钟才能完全溶解蛋白质沉淀。
    注意：溶解蛋白质的浓度可以通过BCA测定¹⁴来测量。

Representative Results

肩胛间BAT用于褐色脂肪细胞分离的制备
棕色脂肪细胞（BA）分离过程如图 1A所示。从制备BAT和消化/分离溶液到获得分离的BA的整个过程大约需要4小时。

在成年小鼠中，丰富的BAT存在于肩胛间区域。这种肩胛间蝙蝠（iBAT）被肌肉层和WAT覆盖（图1B）。在开始消化程序之前，需要去除肌肉层和WAT以产生干净的iBAT（图1C）。在已发布的BA隔离协议中，切碎的BAT用于BA分离¹²。在这项研究中，消化 3 mm³ 尺寸的 BAT（图 1D）比切碎的 BAT 产生更多的 BA。

使用 3% BSA 解决方案将 BA 与非 BA 分离
iBAT消化后，解离的BA与消化产物中的非BA混合。由于BA含有脂滴，因此其密度低于非BA;然而，BA的密度不够低，无法让它们有效地漂浮到常规PBS解决方案的顶部。含有 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 PBS 已被用于分离 BA 和非 BAs¹²，这在本研究中成功重复（图 2A）。

Rosa 26 tdTomato 是一种报告小鼠系，在 Cre 介导的重组¹³ 后表达强^{tdTomato （tdTom}） 荧光蛋白。Ucp1：：Cre转基因小鼠在BAs^中表达Cre重组酶9。Ucp1：：Cre小鼠系与Rosa 26^tdTomato小鼠杂交，用tdTom对BA进行遗传标记（图2B）。为了验证BAs分离程序，将来自Ucp1：：Cre;tdTom / +小鼠的iBAT解离。富含BSA溶液顶层的大多数细胞为覆盆子形，含有多房脂滴。此外，这些覆盆子形状的细胞中的大多数是tdTom阳性（图2C），证实它们是棕色脂肪细胞。

用6%碘沙醇溶液分离BA和非BAs的
3%BSA分离溶液富集BA。目前尚不清楚这些分离的BA是否可用于基因和蛋白质表达分析。然后从富集的BA中提取RNA和蛋白质。根据标准RNA分离程序成功进行RNA提取。然而，标准的Trizol蛋白分离方案，也称为硫氰酸胍-苯酚-氯仿法（GTPC法），效果不佳，繁琐且蛋白质产率非常低。因此，采用改进的蛋白质分离方法从Trizol裂解的BAs中提取蛋白质。

在该改进的GTPC方案中，乙醇，溴氯丙烷和水用于从有机相¹⁵中提取蛋白质。将乙醇，溴氯丙烷和水加入有机相后，离心后，在水相和有机相之间形成蛋白质沉淀（图3A）。然后用100%乙醇洗涤蛋白质沉淀并溶解在1%SDS中。这种改进的GTPC方法用于从iBAT和BSA溶液富集的BA中提取蛋白质。虽然BAT蛋白沉淀很容易溶解在1%SDS中，但分离的BAs蛋白沉淀的主要部分是不溶的。然后用SDS-PAGE凝胶检查溶解的蛋白质。如考马斯蓝色染色SDS-PAGE凝胶（图3B）所示，分离的BA中存在约60 kDa的大质量蛋白质条带，但不存在于BAT样品中。由于BSA的分子量为66 kDa，且BAs分离液中存在丰富的BSA，因此该优势蛋白条带应为BSA。这些数据表明，BAs分离溶液中的BSA会干扰蛋白质提取。

碘沙醇是一种非离子和等渗透梯度培养基¹⁶，已广泛用于细胞17和腺相关病毒（AAV）纯化¹⁸。为了避免蛋白质表达研究中的BSA干扰，碘二沙醇用于替代新的BAs分离溶液中的BSA。3%BSA溶液的密度为1.03，与6%碘沙醇相似。在6%碘沙醇溶液中，BAs在30-60分钟内漂浮到顶部（图3C）。用该溶液分离的BA显示出典型的覆盆子形状，并含有多房脂滴（图3D）。从这些分离的BA中提取的蛋白质在SDS-PAGE凝胶中很好地分离（图3E）。

为了验证6%碘沙醇溶液是否有效地将BAs与非BAs分开，我们用tdTom对BAs进行了遗传标记，并检查了驻留在透明的6%碘沙醇溶液中的细胞。将BAs与非BAs分离后（步骤2.4），将BAs层下方的6%碘沙醇溶液用PBS稀释6次，然后以600× g 离心5分钟。离心后，底部形成一个小的红细胞沉淀，可能是基质血管部分细胞。 如图3所示，来自BAs层的细胞是tdTom阳性细胞（图3F）;然而，从沉淀中回收的细胞是tdTom阴性的（图3G）。此外，在tdTom阴性细胞中没有明显的脂滴可见。这些数据表明，我们的新方案可以有效地将BA与非脂肪细胞分离。

总之，这些数据表明，用3%BSA溶液分离BA会干扰后续的生物化学研究，并表明6%碘沙醇溶液优于3%BSA溶液分离BA。

使用分离的BA进行基因和蛋白质表达分析。
为了在分子水平上验证这种新的BAs分离程序，比较了BAT和分离BAs之间三个基因的表达： Ucp1， Pdgfa和Pdgfra。 在BAT中， Pdgfra 在内皮细胞和间质细胞中表达，PDGFRα阳性细胞是推定的祖细胞¹⁰。分离的BA中 Ucp1和Pdgfa 的mRNA水平均明显高于BAT中（图4A，B）。相反， Pdgfra 的mRNA仅在BAT中检测到（图4B）。

PPARγ是控制脂肪组织发育的转录因子，UCP1是线粒体蛋白，PDGFRα是膜受体蛋白。这三种蛋白质代表分布在不同细胞区室中的蛋白质。进行蛋白质印迹以测试从Trizol裂解的BA和BAT中提取的蛋白质是否适合蛋白质表达分析。在BA和BAT中均检测到UCP1和PPARγ（图4C，D），证实从Trizol裂解的BA或BAT中分离的总蛋白适用于蛋白质免疫印迹。此外，与qRT-PCR结果一致，UCP1蛋白在BA中富集（图4C）;而PDGFRα仅在BAT中检测到，而在纯BA中未检测到（图4D）。综上所述，这些数据表明我们新的BAs分离方法是有效的，并表明该方法富集的BAs可以直接用于基因和蛋白质表达研究。

图1：用于棕色脂肪细胞分离的iBAT制备 。 （A）棕色脂肪细胞分离程序的工作流程。（B）包含BAT，WAT和肌肉层的肩胛间组织的腹侧视图。（C） 肩胛间蝙蝠（iBAT）。与iBAT相邻的肌肉层和WAT被移除。（D）用于棕色脂肪细胞分离的iBAT片段的代表性图像。B-D，比例尺= 5 mm。 请点击此处查看此图的大图。

图2：从消化溶液中分离棕色脂肪细胞 。 （A）分离前后分离的棕色脂肪细胞的图像。3%BSA溶液用于分离棕色脂肪细胞和非棕色脂肪细胞。比例尺 = 1 厘米。 （B）带有tdTomato荧光蛋白的遗传标记棕色脂肪细胞的示意图。（C）分离的棕色脂肪细胞的图像。DIC，微分干涉对比。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图3：从裂解的棕色脂肪细胞中提取总蛋白 。 （A）蛋白质相与有机相的分离。（B）SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。从BAT或3%BSA溶液中提取总蛋白纯化棕色脂肪细胞。BSA蛋白条带用箭头表示。（C）在6%碘沙醇溶液顶部形成的棕色脂肪细胞层。比例尺 = 1 厘米。 （D）用6%碘沙醇溶液分离的棕色脂肪细胞。棕色脂肪细胞用黄色箭头表示。比例尺 = 50 μm。 （E） SDS-PAGE 凝胶的考马斯染色。从BAT或6%碘沙醇溶液富集BAs中提取总蛋白。（F）tdTom标记的棕色脂肪细胞的图像。（G）从BAs层下方的碘沙醇溶液中回收的细胞的图像。F 和 G，比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：分离的棕色脂肪细胞的基因和蛋白质表达分析。 用碘沙醇方法分离的棕色脂肪细胞用于这些基因和蛋白质表达研究。（A，B）基因表达的qRT-PCR测量。mRNA水平标准化为36B4。N=3。学生t检验，*，P<0.01;**，第 <0.01 页。（C）PPARγ和UCP1的蛋白质印迹。（四）PDGFRα的蛋白质印迹。C和D，丽春红S染色膜作为加载对照。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

本研究开发了一种分离BAs用于基因和蛋白质表达分析的新方法。

在已发布的BAs分离方案中，使用3%BSA溶液来富集^BAs12。然而，通过该已发表的方案获得的富集BA不能直接用于蛋白质表达分析。这是因为BAs溶液中存在的浓缩BSA会干扰后续蛋白质提取。当富集在3%BSA溶液中的BA用Trizol试剂处理时，会形成粘性蛋白质聚集体，其中大部分不溶于GTPC蛋白质提取过程。此外，在GTPC蛋白质提取产物中，大部分蛋白质是BSA（图3B）。在这个新方案中，用6%碘沙醇代替3%BSA分离溶液以纯化BA。6%碘沙醇溶液有效地将BAs与非BAs分离出来，分离出的BAs保留了形态（图3D）。优于3%BSA溶液，6%碘沙醇溶液不干扰蛋白质提取，提取的蛋白质适用于蛋白质印迹分析（图4C，D）。

脂肪组织中含有大量的脂质，提取的蛋白质样品中的脂质污染阻碍了蛋白质浓度的测量。最近，已经公布了一项从蛋白质提取中去除脂质的方案。在该协议中，需要一系列低温离心，这是繁琐的，需要大量的起始材料¹⁹。在目前的研究中，采用了改进的GTPC方法¹⁵ 从BAT中分离蛋白质。与传统的GTPC方案不同，这种改进的GTPC方案使用乙醇，溴氯丙烷和水从有机相中提取蛋白质。我们的数据显示，使用这种改进的GTPC方法分离的蛋白质与基于二辛可宁酸测定（BCA）的蛋白质浓度测量兼容。

在当前的BAs分离方案中，在酶解离过程开始之前，将BAT和消化溶液混合物置于冰上一小时。该程序的目的是降低细胞代谢和基因表达率²⁰，以及让消化酶有效地灌注到棕色脂肪组织中。

目前的研究旨在开发一种从肩胛间BAT中分离棕色偶奥细胞的张力方法，用于基因表达研究;然而，分离的BA中可能存在白色脂肪细胞污染。这是因为肩胛间BAT有时由白色脂肪组织附着，在BAT制备步骤中无法完全去除。当前协议无法根据单元密度将BA与WA分开。因此，如果需要非常高的纯度，则需要在分析之前通过FACS对分离的BA进行分类。

肩胛间蝙蝠（iBAT）含有丰富的经典BA，这些BA来源于胚胎发育过程中的 Myf5 细胞谱系²¹。这里使用iBAT作为隔离BA的示例。与已发布的方案¹²类似，我们的方法也可用于从WAT中分离米色细胞。然而，为了从WAT获得纯米色细胞，需要用荧光蛋白标记米色细胞并通过FACS富集。按照我们目前的方案，富含FACS的米色细胞可用于基因和蛋白质表达分析，这将大大提高生物材料的利用效率。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Antigen	Company	Catalog
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R&D system	IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II	Thermo Fisher Scientific	17101015
1-Bromo-3-chloropropane	Sigma-Aldrich	B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)	Goldbio	A-421-10
Calcium chloride	Bio Basic	CT1330
Chloroform	IBI Scientific	IB05040
Dispase II, protease	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Ethanol	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (Iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Potassium Chloride	Boston BioProducts	P-1435
SimplyBlue safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Trizol reagent	Life technoologies	15596018
Primers
Gene name (Species)	Forward	Reverse
Pdgfra (Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name	Company	Application
Keyence BZ-X700	Keyence	Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Applied Biosystem	Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system	LI-COR	Western blot immaging