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方法論記事

マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作

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DOI:

10.3791/62438

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2022年2月12日

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Experimental Teratology, Ministry of Education, Institute of Molecular Medicine and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Stem Cell and Regenerative Medicine Research Center, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2The Research Center of Stem Cell and Regenerative Medicine, Shandong University Cheeloo Medical College, School of Basic Medical Sciences, Shandong University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

マウス肝細胞から長期 の外ビトロ 3Dオルガノイド培養システムが確立された。これらのオルガノイドは、shRNA/異所構造、siRNAトランスフェクションおよびCRISPR-Cas9エンジニアリングのレンチウイルス感染によって継代され、遺伝的に操作することができる。

要約

肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。これは、グルコース貯蔵、タンパク質分泌、代謝および解毒において重要な役割を果たしています。肝機能の大部分の実行者として、原発性肝細胞は増殖能力が限られている。そのためには、肝臓生理学的および病理学的研究のための ex vivo 肝細胞拡張モデルの確立が必要です。ここでは、コラゲナーゼ灌流の2段階でマウス肝細胞を単離し、細胞と細胞の相互作用と身体機能を再現する「ミニ肝臓」として3Dオルガノイド培養を確立した。オルガノイドは、前駆細胞および成熟した肝細胞を含む不均一な細胞集団で構成される。マウス肝細胞または胎児肝細胞を2~3週間以内に分離して培養し、オルガノイドを形成するプロセスを詳細に紹介し、機械的に上下にピペットを通過させる方法を示す。また、shRNA/異所構造のレンチウイルス感染、siRNAトランスフェクション、CRISPR-Cas9エンジニアリング用にオルガノイドを単一細胞に消化する方法についても紹介します。オルガノイドは、肝臓生物学と病態生物学をモデル化することにより、薬物スクリーン、疾患モデリング、および基礎的な肝臓研究に使用することができます。

概要

オルガノイドは、自己更新幹細胞および多系統分化細胞1,2を含む体外(3D)インビトロクラスターです。多くの器官のオルガノイドは、腸、脳、結腸、腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、胃、皮膚、および肺を含む明確に定義されたニッチ因子によって、多能性または成体幹細胞から確立されている3,4,5,6,7.オルガノイドは、発症(胚性または誘発多能性幹細胞、PSCに由来する)または恒常性/再生進行(成人幹細胞、ASCに由来する)のいずれかを模倣することによって、身体細胞機能を再現し、疾患研究と治療の新たな道を開く8,9。

哺乳類の最大の器官として、肝臓は主に貯蔵、代謝および解毒を担当する。肝細胞と胆管球の2種類の上皮細胞型は、肝臓小葉の基本単位を構築する。肝細胞は肝機能の70-80%を担う10。肝臓は顕著な再生能力を有するが、肝細胞特徴の急速な喪失は、調節不全細胞分極化および脱分化による伝統的な単層培養中に起こり、研究者や臨床医が皿の中に「ギャップブリッジング」肝臓モデルを構築する必要性を高める。しかし、最近まで、原発肝細胞からのエクスビボ拡張モデルは十分に確立されていなかった11,12,13,14,15。肝オルガノイドは、胚/誘導多能性幹細胞、肝細胞様細胞への線維芽細胞変換、および組織由来細胞から確立することができる。肝オルガノイドの開発は、薬物スクリーンおよび肝毒性アッセイのためのインビトロモデルの適用を後押しする16,17。

ここでは、マウス原発肝細胞から肝オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルを用いることで、2回のコラゲナーゼを用いた肝細胞オルガノイドの インビトロ 培養系を設定しました。これらのオルガノイドは、数ヶ月間の長期拡張のために継代することができる。彼らの生理機能は肝細胞と非常に一致している。さらに、レンチウイルス感染、siRNAの導入、有機体を用いたCRISPR-Cas9工学など、遺伝子操作の実施方法についても詳しく説明しています。肝細胞オルガノイドの伝播は、オルガノイドを使用して肝臓生物学を理解し、パーソナライズされた翻訳医療アプローチを開発する可能性に光を当てた。

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プロトコル

すべてのマウス実験は、山東大学基礎医学部動物管理・使用委員会によって承認され、内務省のガイドラインと規制に基づくライセンスに従って実施されました(No.ECSBMSSDU2019-2-079)。

注:このプロトコルは、主に孤立した原発肝細胞から3Dオルガノイドを培養するために使用されます。

1. ネズミ肝細胞オルガノイド文化の確立

注:MatrigelやBMEなどの細胞外マトリックスは、培養オルガノイドの地下マトリックスとして使用されます。細胞外マトリックスを-20°Cに保存し、4°Cまたは氷上で解凍します。実験中は、細胞外マトリックスを氷の上に置いてください。洗浄媒体は、グルタマックス、HEPESおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高度なDMEM/F12である。標準インキュベーター(37°C、加湿雰囲気、5%CO2)をオルガノイド培養に使用します。

  1. 材料の準備
    1. 実験に必要な器具を準備します:マウス枕、ピンセット、はさみ、チューブ、および2-10 mL /分の流量のポンプのような無菌の外科用器具。
    2. 灌流バッファー、消化バッファーを含む試薬を調製し、肝細胞の分離のためにそれらを無菌にします。新鮮なIV型コラゲレーターーゼ(0.10 mg/mL)とCaCl2 (0.50 M)を加え、37°Cのバッファーを水浴で事前に温めます。
    3. メーカーの指示に従ってR-spondin 1とすべての化学および成長因子の株式を生産するために条件付き媒体を準備します。
      注:条件付きメディアや株式を頻繁に凍結して解凍しないでください。培養液を新鮮に準備し、1ヶ月以内に使用してください。これはオルガノイド形成効率に重要です。
  2. 肝臓灌流と消化によるマウス肝細胞分離
    注:12週から6ヶ月の間の雄または雌のマウスは、オルガノイド培養に使用された。この範囲内のドナーマウスの年齢からオルガノイド形成効率に明らかな違いは見つからなかった。
    1. 倫理的に承認された方法でマウスを安楽死させる。
    2. マウスピローにマウスを固定し、70%アルコールで腹部の毛皮と皮膚をきれいにします。腹部を露出し、体の残りの部分の上に肝臓を持ち上げます.肝臓を露出させるために正中切開を行います.
    3. ポンプに取り付けられたチューブを灌流バッファーで満たします。門脈(静脈の直径の約1/3)を切開し、慎重にカテーテルを入れます。カニューレを挿入するために消化器官を持ち上げます。外科ラインとのネクタイは滑り出して破裂することを避けるために任意である。
    4. ポンプを開始し、灌流バッファーで5〜7 mL/minの流量で灌流を行います。肝臓が直ちに青白くなった場合は、下の静脈を切って、灌流バッファーが肝臓全体を流れ、血液を追い出すことができます。
    5. 流出がきれいになったら、カニューレを取り外します。所要時間は約5~10分です。
    6. 5 mL/minの速度で、あらかじめ温めた消化バッファーで灌流バッファーを変更します。肝臓が柔らかくなり、うねりになるまでポンプを止めないでください。肝臓が腫れを止めたらカテーテルを取り除く。
      注:過度の消化を避け、単一の肝細胞を取得するために適切な消化時間を維持することが非常に重要です。
    7. 肝臓を切り落とし、15mLの冷たい洗浄媒体で満たされた100mmのプレートに入れる。靭帯を小さいはさみで切ります。ピペットの先端または鉗子で肝臓を粉々に裂く。
    8. ピペットは、バッファーが細胞で飽和するまで細胞を放出するために穏やかに上下します(12〜15回)。70 μmフィルターを通して50 mLチューブにセル懸濁液を注ぎます。
    9. 50xgおよび4°Cで1〜3分間遠心分離機。 上清をデカントします。必要に応じて、洗浄培地で細胞を再懸濁するか、培養培地で細胞を直接再懸濁する。マカチ計で細胞を数えます。
    10. 生細胞染色染色後の細胞カウンターマシンにより、生細胞または死細胞を区別する。
      注:それは寒い40%パーコールを使用して肝細胞を浄化するのが最善です。このステップの後、実行可能な肝細胞は、チューブの底になります。
  3. オルガノイドの培養と通路
    1. 上清を取り除き、3:1の比率で細胞外マトリックスと培養培地の混合物で肝細胞を再懸濁する。
      注:24ウェルプレートのウェルあたり50〜60 μLの混合物に10,000-20,000個の細胞が推奨されます。迅速に作業し、プロセス全体を通して氷の上に混合物を保つことが重要です。200-500オルガノイドは、この濃度で形成することができる。
    2. 小さな液滴でプレート上の細胞/混合物のドロップを追加し、液滴が一緒に接続するのを防ぎます。プレートを37°Cで細胞インキュベーターにインキュベートし、5〜10分間5%CO2 でプレートを取り出し、細胞外マトリックスが固体になるまで20〜25分間プレートを取り出します。
    3. 培養培地(24ウェルプレートの場合はウェルあたり500μL)をウェルに加え、オルガノイド培養用インキュベーターにプレートを戻します。3~4日ごとに培地を変更します。オルガノイドが十分な大きさになるまで観察します。
      注:約400〜500 μmの直径は、肝細胞オルガノイドの通過に適しています。
    4. 以下の詳細なプロセスで細胞外マトリックスからオルガノイドを分離します。ガラスのパスツールピペットを炎に入れ、絞りを狭くします(〜1/2)。機械的にピペットを上下5〜10回、パセパジング中にオルガノイドを小さなオルガノイドに解体する。
      注:通過中に、チューブや先端に付着するオルガノイドの損失を避けるために、チップ洗浄バッファー付きのプリ洗浄マイクロピペットの先端とチューブを準備します。

2. マウス肝細胞オルガノイドの遺伝子操作

  1. 肝細胞オルガノイドからの単細胞
    1. 各ウェルに500 μLの冷たい洗浄媒体/細胞回収液を加えます。ピペットは、マイクロピペットで細胞/細胞外マトリックス混合物を破壊し、オルガノイド懸濁液を氷上の15 mL遠心分離管に移します。必要に応じて、チューブを時々上下に回して、混合物を完全に解凍します。
    2. 500-800 x g および4°Cで5分間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。ペレットに1mLのトリプシン溶液を加え、それを混合するピペットを加えます。37°Cで5〜10分間インキュベートし、2倍の量の洗浄媒体を加えて消化を止めます。
    3. 800xgと4°Cで5分間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。ペレットを培地で再懸濁し、マカチメーターを用いて細胞を数える。
  2. siRNA またはプラスミドトランスフェクション
    注:直径50μm未満の小さなオルガノイドまたは肝細胞オルガノイドからの単一細胞は、製造業者の指示に従ってトランスフェクション試薬を使用してリポフェクトアミンまたはプラスミドを使用してsiRNAにトランスフェクトをトランスフェクトします。
    1. siRNAまたはプラスミドをトランスフェクション試薬と混合します。オルガノイドおよびリポフェクタミンRNA/リポプラスミド混合物(RNAiMAXなど)から1-2ウェルに1-2ウェルに単一細胞を加え、遠心分離機を500 x gおよび32°Cで1時間追加します。 遠心分離後、37°Cで4〜5時間インキュベーターにプレートをインキュベートする。
    2. 細胞を収集し、ウェルあたり10,000細胞の濃度で培養培地で細胞外マトリックスに種子を採取します。トランスフェクションの2日後に培地を選択条件に変更します。10日後にオルガノイド形成効率を評価する。
  3. レンチウイルス感染
    注:直径50μm未満の小さなオルガノイドや肝細胞オルガノイドの単一細胞は、メーカーの指示に従って感染試薬媒体を使用してレンチウイルスに感染しています。
    1. オルガノイドからの単細胞懸濁液の250 μLと1.5 mLチューブ内のウイルス粒子の250 μLを混合します。
    2. 混合物と遠心分離機を500 x gおよび32°Cで1時間プレートします。 37°Cで4〜5時間インキュベートする。
    3. 培養培地で細胞および種子を細胞外マトリックスに集めます。トランスフェクションの2日後に培地を選択条件に変更します。10日後にオルガノイド形成効率を評価する。
  4. CRISPR/Cas9による遺伝子工学
    注:私たちは、補足資料でこのパフォーマンスのためのビデオを提供します。オルガノイドからの単一細胞はレンチウイルスに感染したか、sgRNAおよびCas9を運ぶプラスミドによってトランスフェクトされた。
    1. 上記の方法に従って培養した肝細胞オルガノイドから単一細胞を消化する。
    2. メーカーの指示に従ってOpti-MEM培地および感染試薬を使用して、単一細胞をsgRNAに感染させます。
    3. 1.5 mLチューブに150μLの単細胞懸濁液と250μLのウイルス粒子を混ぜ合わせます。
    4. 500 μLの混合物を500 x gおよび32°Cで1時間遠心分離し、37°Cで4〜5時間インキュベートする。
    5. 細胞外マトリックスに細胞懸濁液と種子を収集します。10日後にオルガノイド形成効率を評価する。

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結果

女性のアルブ・クレからの肝細胞オルガノイド;Rosa26-GFPマウス(8週間)は、播種の5日後に観察された(図1A)。このオルガノイドはKi67陽性染色で増殖している(図1B)。肝細胞オルガノイドにおける代表的な遺伝子の発現を、siRNAトランスフェクションまたはレンチウイルス感染のいずれかによる干渉発現をqRT-PCRおよびウェスタンブロットで調べた。結果は 図2A および 2Bに示されている。 図2C は、RSL-3およびCRISPR/Cas9ゲノムライブラリー画面による14日間の治療後の肝オルガノイドからの選択結果を示す。この結果は、これらのオルガノイドを体外に拡大し、遺伝的に操作できることを示唆している。

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ディスカッション

成熟した肝細胞を長期間にわたって培養する能力は、肝臓の基礎科学、薬物毒物学、マラリアや肝炎ウイルスなどの肝刺激性宿主微生物感染症の研究の基本です。明確に定義されたニッチで、ここでのプロトコルは、肝細胞の培養システムを設定します。このプロトコルは、成熟した肝細胞を細胞と細胞の相互作用、ほとんどの肝細胞機能および遺伝子組換えを再現する異質性を持つ3D培養で拡大し、遺伝子機能研究の設計と再生治療への新しい治療手段を可能にする。

高品質の肝細胞は、肝細胞オルガノイドの確立および遺伝子操作のために非常に重要です。コラゲナーゼ治療の消化時間は非常に重要です。しかし、この方法にはいくつかの制限があります。まず、オルガノイドが長く拡大するのを助ける試験では、よりニッチな要因が示唆されている。第二に、オルガノイドは連続して頻繁に単一細胞になることを好まない。肝細胞由来オルガノイドは、部分的な肝切除術後の成人肝臓の再生反応を再現するように見えるが、静止期の成熟した肝細胞とはまだ異なる。

肝細胞を拡張するために肝細胞オルガノイドを使用すると、肝...

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開示事項

著者らは、競合を明らかにしていない。

謝辞

組み換えR-spondin1を生産するための細胞株を親切に提供してくれたハンス・クレバーズ教授に感謝します。この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFA0111400)、中国国立自然科学財団(31970779)からH.H.、山東大学青少年学際イノベーション研究グループ(2020QNQQT003)からH.H.への助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Perfusion Buffer
EGTASangon BitechA600077-01003.50 g/L
グルコースSangon BitechA100188-05009.00 g/L
KClSangon BitechA100395-05004.00 g/L
Na2HPO4·12H2Oサンゴン ビテックA501727-05001.51 g/L
NaClサンゴン ビテックA501218-000180.0 g/L
NaH2PO4·2H2Oサンゴン ビテックA610404-05000.78 g/L
NaHCO3サンゴン ビテックA500873-05003.50 g/L
フェノールレッドサンゴン ビテックA100882-00250.06 g/
L<ストロング>消化バッファー
CaCl<サブ>2サンゴン ビテックA501330-00050.50 M
コラゲナーゼ IVΣC16390.10 mg/mL
HEPESサンゴン ビテックC621110-001023.80 g/L
KClサンゴン ビテックA100395-05004.00 g/L
Na2HPO4·12H2Oサンゴン ビテックA501727-05001.51 g/L
NaClサンゴン ビテックA501218-000180.0 g/L
NaH2PO4·2H2OSangon BitechA610404-05000.78 g/L
NaHCO3Sangon BitechA500873-05003.50 g
/LTip-wash Buffer
Fetal Bovine SerumGibco10091148°C;C
DPBSGibcoC14190500BT04 °C で保存されます。C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-0104 °C;C
GlutaMAXGibco35050-061100 X
HEPESGibco15630-080100 X
ペニシリン/ストレプトマイシンSangon Bitech A600135-0025100 X
Culture Medium
A83-01Tocris2939ストック濃度 500 & マイクロ;M、最終
濃度2 µM
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-0104°C;C
B-27 サプリメント 50x、マイナス ビタミン AGibco1704-04450 X
Chir 99021Tocris4423ストック濃度 30 mM、最終
濃度 3 & マイクロ;M
DMEM/F12Gibco113300324 °C で保存されます。C
Gastrin ITocris3006ストック濃度 100 mM, final
concentration 10 nM
GlutaMAXGibco35050-061100 X
HEPESGibco15630-080100 X
Matrigel martixBD356231-20 °C で保存されています。C
N-アセチルシステインSigma AldrichA9165ストック濃度 500 mM、最終
濃度 1 mM
ニクチンアミドSigma AldrichN0636ストック濃度 1 M、最終濃度 3 mM
ペニシリン/ストレプトマイシンサンゴン ビテック A600135-0025100 X
組換えヒト EGFPeprotechAF-100-15ストック濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 50 ng/ml
組換えヒト FGF10Peprotech100-26ストック濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 100 ng/ml
組換えヒト HGFPeprotech100-39ストック濃度 100 & マイクロ;g / ml、最終濃度25 ng / ml
組換えヒトTGF-&α;Peprotech100-16Aストック濃度 100 & マイクロ;g / ml、最終濃度100 ng / ml
組換えヒトTNF-&α;OrigeneTP750007-1000原液濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 100 ng/ml
Rho キナーゼ阻害剤 Y-27632Abmole BioscienceY-27632 二塩酸塩ストック濃度 10 mM、最終濃度 10 & マイクロ;M
Rspondin-1錯覚培地Hu Labで作製した安定細胞株 最終濃度 15%。
その他
0.22 µmフィルターMilliporeSCGPT01RE
16 #シリコーンチューブLangerPump
24井戸、サスペンションGreiner bio-oneGN662102-100EA
37 °Cウォーターバス
70µm
キュターゼ幹細胞AT-1044°Cで保存されています。C
Anti-CTNNB1BD610154Mouse
Anti-GAPDHCST5174SRabbit
Anti-HDAC7Abcamab50212Mouse
Anti-KI67Abcamab15580Rabbit
Biological Safety CabinetESCOCCL-170B-8
Cell Recovery SolutionCorning354253stored4°Cで。C
遠心分離機 5430エッペンドルフ542700097
CO2 インキュベーターESCOAC2-4S1
DMSOSangon Bitech A100231RT
EVOS FL Color Imaging SystemsInvitrogenAME4300
Hdac3 siRNAGuangzhou RiboBio Co., Ltd.siG2003180909192555-20°Cで保存されます。C
Hdac7レンチウイルスShanghaiGenePharmaCo.、LtdLV2020-2364-80°Cで保存されています。C
Hitrans G A上海Genechem Co.,Ltd.REVG004ウイルス感染効率の向上
Image Pro Plus softwareMedia Cybernetics, Bethesda, MD, USAversion 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection ReagentInvitrogen13778150ウイルス感染効率の向上
生細胞色素LunaF23001を 4 °C で保存。C
低速卓上遠心分離機cenceTD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b DeviceLonza
Opti-MEMGibco319850704 °C で保存されています。C
パスツールピペットSangon BitechF621006-0001
蠕動ポンプLangerPumpBT100-2J
PVDF 膜ミリポアIPVH00010
PX458Addgene48138します。C
冷蔵遠心分離機Thermo Scientific HeraeusLabofuge 400
RSL3MCEHY-100218Aストック濃度 10 mM、最終濃度 4 & マイクロ;M
トリプシン/EDTAGibico252000724 °C で保存されます。C
Wee1 siRNA広州リボバイオ株式会社siG2003180909205971-20°Cで保存されます。ハ
4 フィルターBD352350アは で保存されています。は-80 °Cで保存されたメタノール で活性化

参考文献

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