マウス肝細胞から長期 の外ビトロ 3Dオルガノイド培養システムが確立された。これらのオルガノイドは、shRNA/異所構造、siRNAトランスフェクションおよびCRISPR-Cas9エンジニアリングのレンチウイルス感染によって継代され、遺伝的に操作することができる。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。これは、グルコース貯蔵、タンパク質分泌、代謝および解毒において重要な役割を果たしています。肝機能の大部分の実行者として、原発性肝細胞は増殖能力が限られている。そのためには、肝臓生理学的および病理学的研究のための ex vivo 肝細胞拡張モデルの確立が必要です。ここでは、コラゲナーゼ灌流の2段階でマウス肝細胞を単離し、細胞と細胞の相互作用と身体機能を再現する「ミニ肝臓」として3Dオルガノイド培養を確立した。オルガノイドは、前駆細胞および成熟した肝細胞を含む不均一な細胞集団で構成される。マウス肝細胞または胎児肝細胞を2~3週間以内に分離して培養し、オルガノイドを形成するプロセスを詳細に紹介し、機械的に上下にピペットを通過させる方法を示す。また、shRNA/異所構造のレンチウイルス感染、siRNAトランスフェクション、CRISPR-Cas9エンジニアリング用にオルガノイドを単一細胞に消化する方法についても紹介します。オルガノイドは、肝臓生物学と病態生物学をモデル化することにより、薬物スクリーン、疾患モデリング、および基礎的な肝臓研究に使用することができます。
概要
オルガノイドは、自己更新幹細胞および多系統分化細胞1,2を含む体外(3D)インビトロクラスターです。多くの器官のオルガノイドは、腸、脳、結腸、腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、胃、皮膚、および肺を含む明確に定義されたニッチ因子によって、多能性または成体幹細胞から確立されている3,4,5,6,7.オルガノイドは、発症(胚性または誘発多能性幹細胞、PSCに由来する)または恒常性/再生進行(成人幹細胞、ASCに由来する)のいずれかを模倣することによって、身体細胞機能を再現し、疾患研究と治療の新たな道を開く8,9。
哺乳類の最大の器官として、肝臓は主に貯蔵、代謝および解毒を担当する。肝細胞と胆管球の2種類の上皮細胞型は、肝臓小葉の基本単位を構築する。肝細胞は肝機能の70-80%....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべてのマウス実験は、山東大学基礎医学部動物管理・使用委員会によって承認され、内務省のガイドラインと規制に基づくライセンスに従って実施されました(No.ECSBMSSDU2019-2-079)。
注:このプロトコルは、主に孤立した原発肝細胞から3Dオルガノイドを培養するために使用されます。
1. ネズミ肝細胞オルガノイド文化の確立
注:MatrigelやBMEなどの細胞外マトリックスは、培養オルガノイドの地下マトリックスとして使用されます。細胞外マトリックスを-20°Cに保存し、4°Cまたは氷上で解凍します。実験中は、細胞外マトリックスを氷の上に置いてください。洗浄媒体は、グルタマックス、HEPESおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高度なDMEM/F12である。標準インキュベーター(37°C、加湿雰囲気、5%CO2)をオルガノイド培養に使用します。
- 材料の準備
- 実験に必要な器具を準備します:マウス枕、ピンセット、はさみ、チューブ、および2-10 mL /分の流量のポンプのような無菌の外科用器具。
- 灌流バッファー、消化バッファーを含む試薬を調製し、肝細胞の分離のためにそれらを無菌にします。新鮮なIV型コラゲレーターーゼ(0.10 mg/mL)とCaCl2 ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
女性のアルブ・クレからの肝細胞オルガノイド;Rosa26-GFPマウス(8週間)は、播種の5日後に観察された(図1A)。このオルガノイドはKi67陽性染色で増殖している(図1B)。肝細胞オルガノイドにおける代表的な遺伝子の発現を、siRNAトランスフェクションまたはレンチウイルス感染のいずれかによる干渉発現をqRT-PCRおよびウェスタンブロットで調べた。結果は 図2A および 2Bに示されている。 図2C は、RSL-3およびCRISPR/Cas9ゲノムライブラリー画面による14日間の治療後の肝オルガノイドからの選択結果を示す。この結果は、これらのオルガノイドを体外に拡大し、遺伝的に操作できることを示唆している。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
成熟した肝細胞を長期間にわたって培養する能力は、肝臓の基礎科学、薬物毒物学、マラリアや肝炎ウイルスなどの肝刺激性宿主微生物感染症の研究の基本です。明確に定義されたニッチで、ここでのプロトコルは、肝細胞の培養システムを設定します。このプロトコルは、成熟した肝細胞を細胞と細胞の相互作用、ほとんどの肝細胞機能および遺伝子組換えを再現する異質性を持つ3D培養で拡大し、遺伝子機能研究の設計と再生治療への新しい治療手段を可能にする。
高品質の肝細胞は、肝細胞オルガノイドの確立および遺伝子操作のために非常に重要です。コラゲナーゼ治療の消化時間は非常に重要です。しかし、この方法にはいくつかの制限があります。まず、オルガノイドが長く拡大するのを助ける試験では、よりニッチな要因が示唆されている。第二に、オルガノイドは連続して頻繁に単一細胞になることを好まない。肝細胞由来オルガノイドは、部分的な肝切除術後の成人肝臓の再生反応を再現するように見えるが、静止期の成熟した肝細胞とはまだ異なる。
肝細胞を拡張するために肝細胞オルガノイドを使用すると、肝.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、競合を明らかにしていない。
謝辞
組み換えR-spondin1を生産するための細胞株を親切に提供してくれたハンス・クレバーズ教授に感謝します。この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFA0111400)、中国国立自然科学財団(31970779)からH.H.、山東大学青少年学際イノベーション研究グループ(2020QNQQT003)からH.H.への助成金によって支えられました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| グルコース | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | サンゴン ビテック | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | サンゴン ビテック | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | サンゴン ビテック | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | サンゴン ビテック | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| フェノールレッド | サンゴン ビテック | A100882-0025 | 0.06 g/ |
| L<ストロング>消化バッファー | |||
| CaCl<サブ>2 | サンゴン ビテック | A501330-0005 | 0.50 M |
| コラゲナーゼ IV | Σ | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | サンゴン ビテック | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | サンゴン ビテック | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | サンゴン ビテック | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | サンゴン ビテック | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g |
| /LTip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | °C;C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | 4 °C で保存されます。C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | 4 °C;C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | ストック濃度 500 & マイクロ;M、最終 濃度2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | 4°C;C |
| B-27 サプリメント 50x、マイナス ビタミン A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | ストック濃度 30 mM、最終 濃度 3 & マイクロ;M |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | 4 °C で保存されます。C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | ストック濃度 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | -20 °C で保存されています。C |
| N-アセチルシステイン | Sigma Aldrich | A9165 | ストック濃度 500 mM、最終 濃度 1 mM |
| ニクチンアミド | Sigma Aldrich | N0636 | ストック濃度 1 M、最終濃度 3 mM |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | サンゴン ビテック | A600135-0025 | 100 X |
| 組換えヒト EGF | Peprotech | AF-100-15 | ストック濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 50 ng/ml |
| 組換えヒト FGF10 | Peprotech | 100-26 | ストック濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 100 ng/ml |
| 組換えヒト HGF | Peprotech | 100-39 | ストック濃度 100 & マイクロ;g / ml、最終濃度25 ng / ml |
| 組換えヒトTGF-&α; | Peprotech | 100-16A | ストック濃度 100 & マイクロ;g / ml、最終濃度100 ng / ml |
| 組換えヒトTNF-&α; | Origene | TP750007-1000 | 原液濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 100 ng/ml |
| Rho キナーゼ阻害剤 Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 二塩酸塩 | ストック濃度 10 mM、最終濃度 10 & マイクロ;M |
| Rspondin-1錯覚培地 | Hu Labで作製した安定細胞株 最終濃度 15%。 | ||
| その他 | |||
| 0.22 µm | フィルターMillipore | SCGPT01RE | |
| 16 #シリコーンチューブ | LangerPump | ||
| 24井戸、サスペンション | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °Cウォーターバス | |||
| 70µm | |||
| キュターゼ | 幹細胞 | AT-104 | 4°Cで保存されています。C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological Safety Cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored4°Cで。C |
| 遠心分離機 5430 | エッペンドルフ | 542700097 | |
| CO2 インキュベーター | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555-20°Cで保存されます。C | |
| Hdac7レンチウイルス | ShanghaiGenePharmaCo.、Ltd | LV2020-2364 | -80°Cで保存されています。C |
| Hitrans G A | 上海Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | ウイルス感染効率の向上 |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | ウイルス感染効率の向上 |
| 生細胞色素 | Luna | F23001 | を 4 °C で保存。C |
| 低速卓上遠心分離機 | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | 4 °C で保存されています。C |
| パスツールピペット | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| 蠕動ポンプ | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF 膜 | ミリポア | IPVH00010 | |
| PX458 | Addgene | 48138 | します。C |
| 冷蔵遠心分離機 | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | ストック濃度 10 mM、最終濃度 4 & マイクロ;M |
| トリプシン/EDTA | Gibico | 25200072 | 4 °C で保存されます。C |
| Wee1 siRNA | 広州リボバイオ株式会社 | siG2003180909205971-20°Cで保存されます。ハ |
参考文献
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D cultur....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
