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Biology

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

Published: July 28, 2021 doi: 10.3791/62515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

Summary

Nous décrivons ici la méthode d’imagerie des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle de l’os du crâne de souris vivantes en utilisant la microscopie à deux photons.

Abstract

Les plaquettes sont produites par des mégacaryocytes, des cellules spécialisées situées dans la moelle osseuse. La possibilité d’imager les mégacaryocytes en temps réel et leur environnement natif a été décrite il y a plus de 10 ans et jette un nouvel éclairage sur le processus de formation des plaquettes. Les mégacaryocytes étendent des protubérances allongées, appelées proplaquettaires, à travers la muqueuse endothéliale des vaisseaux sinusoïdaux. Cet article présente un protocole pour imager simultanément en temps réel des mégacaryocytes marqués par fluorescence dans la moelle osseuse du crâne et les vaisseaux sinusoïdaux. Cette technique repose sur une chirurgie mineure qui maintient le crâne intact pour limiter les réactions inflammatoires. La tête de la souris est immobilisée avec un anneau collé au crâne pour empêcher les mouvements de respirer.

En utilisant la microscopie à deux photons, les mégacaryocytes peuvent être visualisés jusqu’à quelques heures, ce qui permet d’observer les protubérances cellulaires et les proplaquettaires en cours d’allongement à l’intérieur des vaisseaux sinusoïdaux. Cela permet de quantifier plusieurs paramètres liés à la morphologie des saprotsions (largeur, longueur, présence de zones de constriction) et à leur comportement d’allongement (vitesse, régularité, ou présence de pauses ou de phases de rétraction). Cette technique permet également l’enregistrement simultané des plaquettes circulantes dans les vaisseaux sinusoïdaux pour déterminer la vitesse plaquettaire et la direction du flux sanguin. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle des gènes d’intérêt dans la formation des plaquettes à l’aide de souris génétiquement modifiées et se prête également à des tests pharmacologiques (étude des mécanismes, évaluation des médicaments dans le traitement des troubles de la production plaquettaire). Il est devenu un outil inestimable, en particulier pour compléter les études in vitro, car on sait maintenant que la formation de proplaquettaires in vivo et in vitro repose sur des mécanismes différents. Il a été démontré, par exemple, que les microtubules in vitro sont nécessaires pour l’allongement proplaquettaire en soi. Cependant, in vivo,ils servent plutôt d’échafaudage, l’allongement étant principalement favorisé par les forces de circulation sanguine.

Introduction

Les plaquettes sont produites par des cellules spécialisées dans les mégacaryocytes situées dans la moelle osseuse. La façon précise dont les mégacaryocytes libèrent des plaquettes dans la circulation est longtemps restée incertaine en raison du défi technique lié à l’observation d’événements en temps réel à travers l’os. La microscopie à deux photons a aidé à surmonter ce défi et a conduit à des progrès majeurs dans la compréhension du processus de formation des plaquettes. Les premières observations in vivo de mégacaryocytes ont été faites par von Andrian et ses collègues en 2007, avec la visualisation de mégacaryocytes fluorescents à travers le crâne1. Cela a été possible parce que la couche osseuse dans le crâne frontopoyériétal de jeunes souris adultes a une épaisseur de quelques dizaines de microns et est suffisamment transparente pour permettre la visualisation de cellules fluorescentes dans la moelle osseuse sous-jacente2.

Les études qui ont suivi ont appliqué cette procédure pour évaluer la formation de proplaquettaires dans diverses conditions et pour déchiffrer les mécanismes sous-jacents3,4,5,6. Ces études ont fourni des preuves définitives que les mégacaryocytes étendent dynamiquement les protubérances, appelées proplaquettaires, à travers la barrière endothéliale des vaisseaux sinusoïdaux (Figure 1). Ces proplaquettaires sont ensuite libérées sous forme de longs fragments qui représentent plusieurs centaines de plaquettes en volume. Les plaquettes se formeront après le remodelage des proplaquettaires dans la microcirculation des organes en aval, notamment dans les poumons7. À ce jour, cependant, le processus précis et les mécanismes moléculaires restent sujets à débat. Par exemple, le rôle proposé des protéines du cytosquelette dans l’allongement des proplaquettaires diffère entre les conditions in vitro et in vivo 3, et des différences dans la formation de proplaquettaires ont été démontrées dans des conditions inflammatoires6. Pour compliquer encore les choses, une étude récente a contesté le concept proplaquettaire et a proposé qu’in vivo,les plaquettes sont essentiellement formées par un mécanisme de bourgeonnement membranaire au niveau des mégacaryocytes8.

Cet article présente un protocole pour l’observation des mégacaryocytes et des proplaquettaires dans la moelle osseuse à partir de l’os du crâne chez des souris vivantes, en utilisant une procédure mini-invasive. Des approches similaires ont déjà été décrites pour visualiser d’autres cellules de la moelle, notamment les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitaires9. L’accent est mis ici sur l’observation des mégacaryocytes et des plaquettes pour détailler certains paramètres qui peuvent être mesurés, notamment les morphologies proplaquettaires et la vitesse plaquettaire. Ce protocole présente comment insérer un cathéter dans la veine jugulaire pour injecter des traceurs fluorescents et des médicaments et observer à travers l’os du crâne. L’os calvarial est exposé par chirurgie mineure afin qu’un anneau soit collé à l’os. Cet anneau sert à immobiliser la tête et à prévenir les mouvements dus à la respiration et à former une tasse remplie de solution saline comme milieu d’immersion de la lentille. Cette technique est bien adaptée pour i) observer en temps réel la géométrie sinusoïdale et les mégacaryocytes interagissant avec la paroi des vaisseaux; ii) suivre les mégacaryocytes dans le processus de formation, d’allongement et de libération des proplaquettaires; et iii) mesurer les mouvements plaquettaires pour surveiller le flux sanguin sinusoïdal complexe. Les données obtenues à l’aide de ce protocole ont été publiées récemment3.

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Protocol

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility agreement N°: G67-482-10, accord de projet N°: 2018061211274514).

1. Préparation des souris et insertion d’un cathéter dans la veine jugulaire

REMARQUE: Ici, des souris rapporteures mTmG mâles ou femelles âgées de 5 à 7 semaines ont été utilisées (B6.129(Cg) - Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo10) croisées avec des souris Pf4-cre11, permettant un marquage de fluorescence vert intense dans les mégacaryocytes et les plaquettes12. Avant de commencer l’expérience, préchauffez la chambre de chauffage du microscope pendant quelques heures.

  1. Transportez la souris dans la salle d’imagerie et passez à l’anesthésie.
    1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution de kétamine (kétamine (100 μg/g) et de xylazine (10 μg/g) (5 μL/g).
      REMARQUE: L’administration répétée de kétamine / xylazine est utilisée ici et fonctionne bien, mais nécessite l’interruption de l’enregistrement pour une réinjection régulière. Alternativement, si un appareil d’anesthésie est disponible, l’induction de l’anesthésie peut être effectuée avec de la kétamine / xylazine et ensuite maintenue sous inhalation de gaz (mélange d’isoflurane, d’air et d’oxygène).
    2. Remplacez l’animal dans sa cage jusqu’à ce qu’il atteigne une anesthésie profonde. Placez la souris sur une plaque chauffante chauffée à 37 °C pour toutes les manipulations ultérieures.
      REMARQUE: Pendant que l’animal atteint une anesthésie profonde, allumez le microscope et tout l’équipement (voir rubrique 4.1) et configurez les différents paramètres nécessaires (voir section 4.2) pour commencer l’expérience une fois la chirurgie terminée. Ici, la procédure ne dure que 3 h et est terminale. La souris est euthanasiée après l’expérience sans se réveiller. Par conséquent, la désinfection à l’éthanol pour la peau et les instruments est suffisante. Cependant, selon les directives de l’établissement, ou si la procédure durerait plus longtemps, des méthodes de désinfection plus complètes devraient être utilisées, telles que trois gommages alternés avec de la bétadine / povidone et de l’alcool.
  2. Installez un cathéter dans la veine jugulaire.
    REMARQUE: Il est important d’éviter autant que possible la contamination microbienne pendant la chirurgie. Prenez soin de désinfecter soigneusement la peau avec de l’éthanol à 70% (EtOH) avant de procéder à la chirurgie. Utilisez toujours des ciseaux et des pinces à épiler stérilisés et rincez-les régulièrement dans 70% d’EtOH. Travaillez dans un endroit propre et portez un masque facial. Un cathéter de 22 G « over-the needle », constitué d’une aiguille à l’intérieur d’un tube en plastique, est utilisé pour l’injection intraveineuse (voir le tableau des matériaux).
    1. Placez la souris sur le dos et fixez les jambes antérieures avec du ruban chirurgical pour étirer la gorge (Figure 2A). Désinfectez la gorge avec de l’éthanol à 70%.
      REMARQUE: Pour plus de commodité, la gorge peut être rasée avant la chirurgie. Si la procédure dure plus longtemps, un rasage minutieux doit être effectué pour une technique aseptique appropriée.
    2. Faites une incision de 0,7 à 1 cm sur la veine jugulaire droite ou gauche à l’aide de ciseaux stériles. Étirez le tissu conjonctif adjacent pour exposer la veine jugulaire externe et le haut du muscle pectoral (Figure 2A).
    3. Remplissez le cathéter avec une solution saline physiologique chaude et stérile. Insérez le cathéter dans la veine après avoir pénétéré à travers le muscle pectoral (Figure 2B).
      REMARQUE: Prenez soin d’éviter les bulles d’air à l’intérieur du cathéter. Il est important d’insérer le cathéter à travers le muscle pour prévenir l’hémorragie car le muscle formera un point de compression. Même les souris présentant des défauts d’hémostase, telles que les souris Itgb3-/-, ne saignent pas lors de l’insertion du cathéter avec cette approche.
    4. Retirez doucement l’aiguille et, si nécessaire, déplacez soigneusement le cathéter plus profondément dans la veine. Connectez la seringue et stabilisez le cathéter en ajoutant une goutte de colle chirurgicale (Table des matériaux).
      REMARQUE: Il est possible d’insérer un cathéter à l’intérieur de la veine caudale, bien que cela nécessite une certaine pratique car la veine a un calibre plus petit. Ceci est particulièrement difficile lors de l’utilisation de souris aux cheveux foncés, dont la veine caudale est à peine visible. En raison de son calibre plus grand, le positionnement du cathéter à l’intérieur de la veine jugulaire peut permettre d’injecter de plus grands volumes ou des traitements répétés de manière plus fiable. Veuillez noter que la seringue est remplie pour la première fois d’une solution saline chaude et n’oubliez pas d’injecter le volume mort avant d’injecter la solution médicamenteuse.
    5. Ressernuez soigneusement la souris en position couchée (Figure 2C). Appliquer le gel (Table des matériaux) sur les yeux pour prévenir la sécheresse.

2. Chirurgie et installation de l’anneau crânien

REMARQUE: La prise en charge complète de l’installation de la souris comprend 4 pièces, un bloc et une plaque, l’anneau pour maintenir la tête de la souris et une vis pour fixer l’anneau au bloc (Figure 3A). Tous les éléments du support ont été obtenus à partir de i.materialise.com par impression 3D. La plaque est faite de polymère acrylonitrile butadiène styrène (ABS), le bloc et la vis en acier inoxydable et l’anneau en acier inoxydable de haute qualité (acier inoxydable très détaillé) (voir la figure supplémentaire S1 pour les dimensions et les matériaux supplémentaires pour les fichiers d’impression 3D). Le bloc est fixé en permanence au support, vissé ou collé. Une fois l’anneau fixé sur le crâne de la souris, il doit être vissé au porte-bloc (Figure 3A).

  1. Humidifiez les cheveux sur le cuir chevelu avec une serviette en papier humide avec 70% d’éthanol pour la désinfection. Enlevez tous les poils lâches avec une serviette en papier humide.
    REMARQUE: Pour plus de commodité, le cuir chevelu peut être rasé avant la chirurgie.
  2. Inciser le cuir chevelu en formant un T à la ligne médiane jusqu’à 1 cm et entre les oreilles pour exposer le calvarium à l’aide de ciseaux et de pinces à épiler fins stériles.
    REMARQUE : L’anneau sera positionné de manière à chevaucher les os frontal et pariétal(figure 3B).
  3. Utilisez une pince à épiler stérile pour exposer le crâne. Retirez soigneusement le périoste avec des ciseaux et une pince à épilation. Utilisez un coton-tige stérile imbibé d’une solution saline physiologique pour enlever tout le périoste et tous les débris ou cheveux, ce qui pourrait altérer l’imagerie.
    REMARQUE: Pour limiter les réactions inflammatoires, prenez grand soin de ne pas endommager l’os.
  4. Enlevez toute trace de sang en rinçant avec une solution saline et séchez rapidement l’os avec un coton-tige sec. Appliquez le gel de colle sur l’anneau, positionnez-le sur l’os exposé et maintenez-le pendant quelques secondes afin que l’anneau soit fermement attaché au crâne.
    REMARQUE: Aucune colle ne doit pénétrer dans le champ d’observation car elle peut entraîner une autofluorescence indésirable.
  5. Humidifiez légèrement le crâne avec un coton-tige immergé dans une solution saline physiologique.
  6. Préparez la pâte dentaire en silicium en mélangeant soigneusement les composants bleus et jaunes 1: 1. Appliquez de la pâte dentaire tout autour de l’anneau pour sceller afin d’éviter les fuites pendant l’imagerie. Retirez soigneusement toute pâte ou colle dentaire qui pourrait être entrée dans l’anneau.
  7. Remplissez l’anneau avec une solution saline et vérifiez les fuites.
    REMARQUE: La solution saline sert de milieu d’immersion pour l’objectif du microscope. Les saignements peuvent être plus critiques lors de l’utilisation de souris présentant des défauts liés à l’hémostase. Il est essentiel d’empêcher le sang de pénétrer dans l’anneau car il pourrait brouiller davantage l’imagerie.
  8. Placez la souris sur le support et vissez l’anneau sur le porte-bloc (Figure 3C). Placez des compresses pliées sous la tête de l’animal pour lever la tête et empêcher le détachement de l’anneau du crâne.
    REMARQUE: La tête est directement fixée de sorte qu’elle empêche les mouvements d’image dus à la respiration.
  9. Positionnez le support et l’assemblage de la souris dans la chambre de microscope chauffée (Figure 3D).
    REMARQUE: Veillez à ne pas déloger le cathéter inséré à tout moment.

3. Suivi des souris anesthésiées jusqu’à la fin de l’expérience

NOTE: L’anesthésie est réinduite toutes les 35 minutes par alternance d’injections sous-cutanées (s.c.) de kétamine (25 μg / g) dans un volume de 5 μL / g de poids corporel et d’un mélange de kétamine (50 μg / g) et de xylazine (5 μg / g) (1,2 μL / g). Comme il n’est pas possible d’ouvrir la chambre de microscope chauffée pendant l’acquisition, une surveillance anesthésique est effectuée avant et après la réinser administration de l’anesthésique par pincement des orteils. De même, le pincement des orteils est effectué avant de commencer chaque nouvel enregistrement vidéo.

  1. Si nécessaire, arrêter l’acquisition et réinduire l’anesthésie par injection de s.c.
    1. En faisant attention à ne pas bouger la tête de la souris, pincez la peau du dos entre le pouce et l’index de la main gauche. Injecter l’anesthésique par voie sous-cutanée dans le pli de la peau du dos à l’aide de la main droite (ou vice versa pour les gauchers).
  2. Vérifiez la présence d’une solution saline dans l’anneau et, si nécessaire, remplissez-la de solution saline fraîche. Continuez à enregistrer pendant les 35 prochaines minutes et procédez de la même manière pendant la durée de l’enregistrement.
  3. À la fin de l’expérience, euthanasier la souris par luxation cervicale avant qu’elle ne se réveille.
    NOTE: La souris est maintenue anesthésique pendant une durée maximale de 3 h, en accord avec le comité local d’éthique et de bien-être animal.

4. Imagerie à deux photons

REMARQUE : Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails sur le microscope et l’équipement connexe. Les images ont été enregistrées avec un scanner résonant (12 ou 8 kHz). Le mode bidirectionnel a été mis en place pour augmenter la vitesse d’acquisition car les pixels sont enregistrés dans les deux sens; par conséquent, toute incompatibilité dans la phase doit être corrigée avec la « correction de phase » du panneau de commande. Enfin, une moyenne adaptée a été mise en place comme un compromis entre la vitesse d’acquisition et le rapport signal/bruit.

  1. Allumez le microscope à deux photons, y compris le laser et le scanner résonant (puissance de sortie laser généralement ~ 1,8-2,5 W selon le laser).
  2. Réglez la longueur d’onde laser appropriée pour les fluorophores choisis. Réglez la longueur d’onde appropriée pour la récupération des lumières émises.
    REMARQUE: Ici, une longueur d’onde de 913 nm et des détecteurs hybrides (500-550 nm et 575-625 nm) ont été utilisés pour exciter et détecter simultanément AlexaFluor-488 et Qtracker-655, respectivement.
  3. À l’aide du cathéter intrajugular, injecter le traceur fluorescent pour étiqueter le système vasculaire (Qtracker-655; Tableau des matériaux). Injecter 50 μL/souris d’une solution à 0,2 μM, renouvelée une fois toutes les heures pour un maximum de 150 μL/expérience.
    REMARQUE: D’autres traceurs peuvent être utilisés tels que le dextran1de haut poids moléculaire. Dans ce cas, considérez que la viscosité du sang peut être altérée par le dextran et modifiez certains paramètres hémorhéologiques.
  4. Placez l’étage du microscope avec le support et la souris sous l’objectif du microscope. Vérifiez que l’anneau est toujours rempli de solution saline et immergez l’objectif. Utilisez l’épifluorescence pour localiser les vaisseaux de la moelle osseuse (rouge) et la présence de mégacaryocytes (verts) alignés le long des vaisseaux sinusoïdaux.
    REMARQUE: L’os du crâne a une épaisseur inférieure à 100 μm2. La moelle est située sous l’os et est facilement reconnaissable aux mégacaryocytes verts fluorescents et aux vaisseaux sinusoïdaux anastomosés rouges denses marqués par Qtracker-655.
  5. Acquisitions longues (mégacaryocytes, proplaquettaires)
    1. Recherchez la région d’intérêt. Appliquez les paramètres d’acquisition d’image mentionnés ci-dessus.
    2. Pour les acquisitions longues (par exemple, visualisation de la formation ou de l’allongement des proplaquettaires), acquérir des images z-stack avec des intervalles optimisés (généralement entre 0,85 et 1,34 μm) à l’aide d’un scanner résonant de 8 kHz.
      REMARQUE: Un scanner résonant de 12 kHz peut augmenter la vitesse d’acquisition.
    3. Acquérez des images de 384 x 384 pixels pour visualiser l’ensemble du mégacaryocyte et du vaisseau. Utilisez la moyenne des lignes, comme vous le souhaitez, pour une acquisition rapide avec une bonne résolution. Déterminez l’intervalle de temps d’acquisition de la pile d’images, généralement 10 s ou 30 s pour la visualisation des proplaquettaires.
      REMARQUE: Ici, une moyenne de ligne de 8 a été utilisée pour obtenir un rapport signal/bruit plus élevé, ce qui a permis l’acquisition de 1 image / 10 s avec un scanner résonant de 8 kHz. Assurez-vous que la moyenne des lignes lors de l’acquisition en direct est autorisée.
  6. Acquisition courte et rapide (plaquettes)
    REMARQUE: Pour une acquisition plus courte d’événements rapides, tels que la vitesse plaquettaire, il est essentiel de maximiser la fréquence d’acquisition d’images. La sélection du type d’acquisition approprié optimisera la fréquence d’acquisition de trame (c’est-à-dire un type d’acquisition s’il y a un espace-temps « xyt »).
    1. Réduisez (par exemple, 256 x 90 pixels) et ajustez la taille de l’image au récipient en faisant pivoter le champ d’imagerie, si nécessaire.
    2. Utilisez la vitesse d’analyse la plus élevée disponible.
    3. Utilisez la numérisation bidirectionnelle.
      REMARQUE: Pour la numérisation bidirectionnelle, assurez-vous que la phase est bien ajustée.
    4. Minimisez la moyenne des lignes pour trouver le compromis optimal entre la définition de l’image et la rapidité d’acquisition.
      REMARQUE: Pour les mesures de vitesse plaquettaire, une image pixelisée peut être suffisante si elle contribue à augmenter la rapidité d’acquisition.
    5. Minimisez la pile z pour augmenter la rapidité d’acquisition. L’acquisition de seulement 1 pile z est suffisante pour quantifier la vitesse plaquettaire. Acquérir pendant 10-20 s pour mesurer la vitesse plaquettaire.
      REMARQUE: Un maximum de 133 images / s peut être obtenu en utilisant ces conditions avec un scanner résonant de 12 kHz. Les paramètres doivent être adaptés aux conditions. Dans certains vaisseaux, la vitesse plaquettaire est néanmoins trop élevée pour quantifier de manière fiable la vitesse plaquettaire avec ces paramètres.
  7. Mesure de la largeur et de la longueur des proplaquettaires
    REMARQUE: Pour charger des fichiers LIF obtenus sur le logiciel Leica avec ImageJ, téléchargez et installez d’abord le plug-in LOCI sur ImageJ pour utiliser l’importateur de bio-formats.
    1. Largeur proplaquettaire
      1. Ouvrez le film avec ImageJ. Pour effectuer la mesure de la largeur, utilisez uniquement le film des proplaquettaires sans le vaisseau. Pour séparer les différents canaux, cliquez sur Image| Colorez et sélectionnez Fractionner les couches.
      2. Pour un film z-stack, faites une projection z moyenne pour chaque point temporel en cliquant sur Image| Empile et sélectionne Z Project. Pour Type de projection, entrez Intensité moyenne.
      3. Traitez l’image pour supprimer le bruit. Soustrayez l’arrière-plan en cliquant sur Processus| Soustrayez l’arrière-plan et appliquez le rayon de la boule de roulement: 50,0 pixels. Lissez l’image en cliquant sur Processus et Lisser.
      4. Tracez une ligne près de la base de la proplaquettaire (près du mégacaryocyte, en évitant tout autre objet).
        REMARQUE: N’oubliez pas de définir l’échelle de l’image pour obtenir la valeur dans l’unité souhaitée en cliquant sur Analyser et Définir l’échelle. Par défaut, l’unité de l’image est en pixels.
      5. Tracez le profil d’intensité, ajustez une courbe gaussienne et calculez la pleine largeur à la moitié maximale (FWHM). Pour cela, écrivez le script suivant dans une macro en cliquant sur Plugins| Nouveau et sélectionnez Macro et exécutez-le en cliquant sur Macro| Exécuter la macro: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit(« Gaussien »,x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) * sigma; print(FWHM).
        REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a qu’un seul pic dans le balayage linéaire, correspondant à l’intensité proplaquettaire.
      6. Effectuer les actions décrites à l’étape 4.7.5 sur 1 tranche ou répéter au fil du temps pour obtenir la largeur moyenne de la proplaquète
    2. Longueur proplaquettaire
      1. Tracez une ligne le long de la proplaquettaire, de la base près du mégacaryocyte jusqu’au sommet. Utilisez une ligne segmentée pour suivre la forme proplaquettaire. Répétez-le pour chaque point temporel.
      2. N’oubliez pas d’enregistrer chaque ligne à l’aide du gestionnaire de retour sur investissement : cliquez sur Analyser | Outils et sélectionnez Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Ajouter dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement pour ajouter chaque ligne au gestionnaire tel qu’il est sélectionné. Pour enregistrer toutes les lignes d’un dossier, cliquez dans le Gestionnaire de retour sur investissement sur Désélectionner | Plus et cliquez sur Enregistrer. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, extrayez la valeur de longueur de chaque ligne (Mesure) du tableau des résultats.
        REMARQUE: N’oubliez pas de définir l’échelle de l’image pour obtenir la valeur dans les unités souhaitées en cliquant sur Analyser et Définir l’échelle. Par défaut, l’unité de l’image est en pixels.
  8. Mesure de la vitesse des plaquettes
    REMARQUE: La vitesse plaquettaire est calculée à partir de l’enregistrement vidéo des plaquettes fluorescentes s’écoulant à l’intérieur du récipient sur 10-20 s. Un traitement de première image est effectué pour obtenir des données de balayage linéaire répétées de manière cyclique. Le mouvement conduit à des traînées dont l’angle dépend de la vitesse, permettant son calcul. Ici, la vitesse a été calculée avec une méthode qui utilise la transformée de Radon, qui est plus robuste que la méthode classique de décomposition de valeur singulière (SVD)15.
    1. Traitement d’image avec ImageJ
      1. Ouvrez le film avec ImageJ. Appliquez un filtre Flou gaussien en cliquant sur Traiter | Filtres, sélectionnez Flou gaussienet appliquez Sigma (rayon) : 2,00. Choisissez une petite région pour mesurer l’écoulement et tracez 3 lignes adjacentes en suivant la direction de l’écoulement.
        REMARQUE: N’oubliez pas d’enregistrer chaque ligne en utilisant le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Ajouter dans la fenêtre ROI Manager pour ajouter chaque ligne et les enregistrer; cliquez d’abord sur Désélectionner | Plus, puis cliquez sur Enregistrer.
      2. À l’aide du logiciel de balayage linéaire ImageJ, construisez un kymographe pour chaque ligne en cliquant sur Image | Piles; sélectionnez Retraner et appliquer les paramètres suivants: Espacement de sortie (microns): 1.000 / Nombre de tranches: 1 / Éviter l’interpolation. Enregistrez les images s’il en résulte.
        REMARQUE: L’image résultante montre des stries correspondant au mouvement linéaire des plaquettes dans le flux sanguin au fil du temps. L’angle d’une traînée est fonction de la vitesse.
    2. Mesure de vitesse à l’aide du logiciel Matlab ou GNU Octave
      NOTE: La vitesse des plaquettes dans le flux sanguin est estimée à partir des images s’il y aéro-temporelles à l’aide d’une méthode d’analyse computationnelle basée sur la transformée de Radon décrite par Drew et ses collaborateurs15. La description de cette méthode mathématique dépasse le cadre de cette revue, et le lecteur est renvoyé à la publication de Drew et al. pour plus de détails concernant le calcul15. Le code Matlab et plus d’informations sont disponibles sur leur site Web https://www.drew-lab.org/code.
      1. Ouvrez le code à l’aide du logiciel Matlab ou GNU Octave.
        REMARQUE: Le code peut nécessiter une adaptation en fonction de l’étude souhaitée.
      2. Extrayez la valeur des 3 images s’il vous pététrait, correspondant aux lignes adjacentes dessinées dans la même partie du vaisseau. Calculer la valeur moyenne de la vitesse d’écoulement plaquettaire pour cette partie du récipient.
        REMARQUE: N’oubliez pas de convertir le résultat dans l’unité de mesure correcte (par exemple, μm / s).

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Representative Results

À l’aide de ce protocole, le traceur fluorescent Qtracker-655 a été administré par voie intraveineuse pour imager les vaisseaux sinusoïdaux de la moelle osseuse anastomosée dans la moelle osseuse du crâne et la direction de l’écoulement représentée par les flèches(Figure 4A,à gauche). En utilisant des souris mTmG, des plaquettes fluorescentes eGFP ont été enregistrées sur 20 s dans chaque branche du vaisseau, et leur vitesse a été mesurée à l’aide d’ImageJ et du logiciel GNU Octave(Figure 4A,à droite). Notez l’hétérogénéité de la vitesse et de la direction de l’écoulement. Les vaisseaux sinusoïdaux présentent des écoulements complexes dus aux anastomoses, avec la présence de flux-refusion et même de stase, comme le montre la bifurcation enregistrée dans la vidéo 1. La même bifurcation est représentée à la figure 4B (à gauche), avec les flèches rouge et bleue mettant en évidence les écoulements opposés. La vitesse plaquettaire dans cette bifurcation a été mesurée et rapportée dans le graphique(Figure 4B,à droite). Le tracé rouge correspond à la vitesse dans la branche gauche du navire et le tracé bleu à celui de la branche droite du navire. Cela montre une irrégularité dans le temps dans chaque branche du navire, avec des phases d’accélération, de stase et de décélération. Il est important de noter que dans certains vaisseaux, le flux sanguin était trop rapide pour une analyse fiable dans les conditions d’acquisition actuelles.

L’enregistrement de l’allongement proplaquettaire permet de visualiser leurs différentes morphologies dans le temps(Figure 5). Certaines proplaquettaires s’allongent avec des morphologies irrégulières(Figure 5Ai et Vidéo 2). D’autres, généralement plus minces, peuvent s’étendre sur de longues distances nécessitant le mouvement de la fenêtre d’acquisition pour suivre leur extension(Figure 5Aii et Vidéo supplémentaire 1). D’autres sont plus courts et plus épais et s’allongent généralement lentement(Figure 5Aiii et Vidéo supplémentaire 2). Lorsque les mégacaryocytes étendent les proplaquettaires dans des zones d’écoulements complexes, comme la bifurcation illustrée à la figure 4B,les proplaquettaires sont projetées d’une branche de vaisseau à l’autre en fonction de la direction de l’écoulement(Figure 5B et Vidéo 3). L’importance des forces hémodynamiques pour l’allongement proplaquettaire dans le sens de l’écoulement a été mise en évidence lorsque la souris a subi un arrêt cardiaque inattendu. L’arrêt du flux sanguin a détendu les proplaquettaires étendues par le mégacaryocyte(Figure 5C et Vidéo 4).

Lorsque la qualité/résolution de l’acquisition est appropriée, des paramètres morphologiques peuvent être mesurés, tels que la longueur des proplaquettaires jusqu’au détachement, leur largeur à la base de la proplaquettaire ou de tout autre emplacement défini, ou la taille des bourgeons(figure 6A). Une longueur proplaquettaire maximale moyenne d’environ 185 μm (plage 41,5-518,5 μm) et une largeur proplaquettaire moyenne de 5,2 μm (plage 2,8-8 μm) ont été calculées(figure 6A). Tracer la longueur des proplaquettaires en fonction du temps permet de visualiser le comportement des proplaquettaires pendant les phases d’allongement, de stase, voire de rétraction(Figure 6B). La mesure de la vitesse d’allongement des proplaquettaires est un paramètre important, qui reflète directement le comportement d’allongement, de stase ou de rétraction des proplaquettaires3.

La vitesse d’allongement des proplaquettaires peut être mesurée si la proplaquettaire reste attachée à sa cellule mère; une fois détaché, il sera immédiatement emporté par le flux et disparaîtra de la fenêtre de visualisation. Chez les souris de type sauvage (WT), la vitesse moyenne d’allongement des proplaquettaires était d’environ 10 μm/min(Figure 6C),en accord avec les publications précédentes1. Enfin, il est possible de s’injecter des drogues à travers le cathéter inséré dans la veine jugulaire. Par exemple, il a été observé que l’administration intraveineuse de vincristine, un médicament qui dépolymérise les microtubules, a conduit à la rétraction des proplaquettaires de souris WT mais n’a eu aucun effet sur les proplaquettaires de souris déficientes en myosine IIA(Myh9-/-) (Vidéo 5 et Vidéo 6)3.

Figure 1
Figure 1: Représentation schématique de la formation de proplaquettaires dans la moelle osseuse. Après différenciation des cellules souches hématopoïétiques, les grands mégacaryocytes s’alignent le long des vaisseaux sinusoïdaux et étendent les projections cytoplasmiques, appelées proplaquettaires, à travers la barrière endothéliale. Les proplaquettaires s’allongent et se détachent sous l’influence des forces hémodynamiques pour se remodeler en plaquettes dans la microcirculation en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Insertion du cathéter. (A) Une incision est pratiquée pour exposer la veine jugulaire et le haut du muscle pectoral. (B) Le cathéter rempli de solution saline est inséré dans la veine jugulaire en passant à travers le muscle, créant un point de compression. (C) La souris est soigneusement tournée de sorte qu’elle repose sur la surface ventrale vers le bas avec le cathéter bien positionné. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Configuration expérimentale utilisée pour l’imagerie à deux photons à travers l’os du crâne. (A) Le bloc en acier inoxydable imprimé en 3D est fixé sur le support en polymère ABS (voir la figure supplémentaire S1 et les matériaux supplémentaires pour les conceptions 3D). Le bloc et l’anneau du crâne sont conçus de manière à ce que l’anneau puisse être vissé au bloc. Notez que, pour faciliter l’utilisation, la tête de vis a été intégrée dans Epon. (B) Schéma montrant le positionnement de l’anneau sur l’os du crâne exposé. (C) Photographies illustrant la souris avec l’anneau collé au crâne, la tête sur un tampon de tissu, et (D) le positionnement sous l’objectif du microscope. Abréviations: 3D = tridimensionnel; ABS = acrylonitrile butadiène styrène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Mesure de la vitesse plaquettaire dans les vaisseaux sinusoïdaux anastomosés de la moelle osseuse du crâne. (A) Image à gauche, à deux photons, des vaisseaux sinusoïdaux marqués par injection de Q-Dot. projection z montrant l’anastomose des vaisseaux sinusoïdaux dans la moelle osseuse du crâne. Les flèches indiquent la direction de l’écoulement, illustrant la complexité des écoulements dans les sinusoïdes. À droite, vitesse d’écoulement moyenne estimée par la mesure de la vitesse plaquettaire dans chaque branche du vaisseau. Les nombres sur l’axe des x correspondent aux numéros de flèche dans l’image de gauche. (B) Bifurcation sinusoïdale gauche délimitée par des lignes pointillées, montrant des plaquettes s’écoulant dans des directions opposées (flèches rouges et bleues) (correspondant à la vidéo 1). Image à deux photons à un seul plan. À droite, un graphique montrant la vitesse d’écoulement dans chaque partie du navire en fonction du temps (ligne rouge, côté gauche; ligne bleue, côté droit), montrant les phases de stase, d’accélération et de décélération. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Diverses morphologies proplaquettaires observées dans la moelle crânienne par microscopie à deux photons. (A) Trois proplaquettaires in vivo représentatives : des images de projection z issues d’expériences en accéléré (montrées dans la vidéo 2,la vidéo supplémentaire 1et la vidéo supplémentaire 2)montrant les différentes morphologies des proplaquettaires (flèches) s’étendant dans les sinusoïdes de la moelle osseuse. Les proplaquettaires et les mégacaryocytes sont en vert; les vaisseaux sinusoïdaux sont en rouge. (B) Images time-lapse d’une proplaquète dans la même bifurcation que sur la figure 4B, oscillant selon le sens de l’écoulement (également montré dans la vidéo 3). (C) images time-lapse de projection z montrant la relaxation de 3 proplaquettaires après l’arrêt du flux sanguin en raison d’un arrêt cardiaque de la souris (montrées dans la vidéo 4),précédemment alignées dans la même ligne de flux (indiquée par les flèches blanches, jaunes et bleues). Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Analyses morphologiques des proplaquettaires. (A) Image supérieure, projection z représentant le site où la largeur proplaquettaire a été mesurée ainsi que la longueur maximale; Vous trouverez ci-dessous des graphiques représentant la longueur maximale de 25 proplaquettaires individuelles et la largeur moyenne des proplaquettaires des mêmes proplaquettaires (même code gris) tout au long de l’allongement. i) La largeur du proplaquettaire a été mesurée en dessinant une ligne perpendiculaire à une position fixe près de la base du proplaquettaire, et l’intensité du profil a été enregistrée à cette position toutes les minutes. Une courbe gaussienne a été ajustée à ce profil, et le FWHM a été considéré comme représentant la largeur de la proplaquettaire. La largeur moyenne a ensuite été calculée en faisant la moyenne des largeurs de la proplaquettaire mesurées à chaque point temporel à la position fixe. Les barres sont moyennes ± sem de la largeur mesurée chaque minute lors de l’acquisition; ii) la longueur maximale des proplaquettaires a également été déterminée, de la base de la proplaquettaire à son extrémité. (B) Tracés individuels montrant le comportement d’allongement des proplaquettaires WT, certains d’entre eux présentant des phases de pause et de rétraction. Pour mieux mettre en évidence les pauses et les rétractions lors du processus de croissance des proplaquettaires, la longueur mesurée toutes les 10 s était représentée en pourcentage de la longueur maximale de chaque proplaquettaire. ( C )Nuagede points représentant la vitesse d’allongement des proplaquettaires. La vitesse moyenne nette d’allongement des proplaquettaires (y compris les pauses et les rétractions) a été calculée comme la variation de la longueur des proplaquettaires à des intervalles de 1 minute, calculée en moyenne sur l’ensemble de la séquence temporelle. Valeurs individuelles et moyenne ± sem. Abréviations: FWHM = pleine largeur à la moitié maximale; sem = erreur-type de la moyenne; WT = type sauvage.

Vidéo 1 : Flux inverse dans les vaisseaux sinusoïdaux. Plaquettes circulantes (vert) dans les vaisseaux sinusoïdaux (rouge, Qtracker) (plan z confocal unique). Un vaisseau sinusoïdal anastomosé est montré présentant des bifurcations où l’écoulement est instable et affiche des phases de stase, d’accélération et de décélération. Acquis avec un microscope Leica SP5 équipé d’un scanner résonant 12 kHz et d’un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica), un plan, 256 x 90 pixels, acquisition bidirectionnelle, ligne moyenne 2, 133 images/s. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Les proplaquettaires allongées présentent différentes morphologies. Enregistrement vidéo time-lapse représentatif (projection z) chez une souris WT avec des mégacaryocytes prolongeant des proplaquettaires de différentes morphologies (vert) dans les sinusoïdes de la moelle osseuse (rouge, Qtracker). Acquis avec un microscope Leica SP5 équipé d’un scanner résonant de 12 kHz et d’un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica), acquisition z-stack à des intervalles de 10 s, profondeur z de 4 μm, résolution x-y 384 x 384 pixels, moyenne de ligne 8. Chaque fois que nécessaire, les profils étaient alignés à l’aide du plug-in de correspondance de modèle ImageJ pour obtenir une projection z moyenne. En fonction de la qualité de l’image, l’arrière-plan a été soustrait, l’image a été lissée et la luminosité et le contraste ajustés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3: Les proplaquettaires sont projetées par des changements dans la direction de l’écoulement. Vidéo en accéléré montrant un mégacaryocyte de type sauvage dans la bifurcation sinusoïdale montrée dans la vidéo 1, en train d’étendre une proplaquettaire qui oscille dans une branche de vaisseau en fonction de la direction de l’écoulement (projection z). Acquis avec un microscope Leica SP5 équipé d’un scanner résonant de 12 kHz et d’un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica), acquisition z-stack à des intervalles de 10 s, profondeur z de 4 μm, résolution x-y 384 x 384 pixels, moyenne de ligne 8. Les profils ont été alignés à l’aide du plug-in de correspondance de modèle ImageJ et une projection z moyenne a été obtenue. L’arrière-plan a été soustrait, l’image a été lissée et la luminosité et le contraste ajustés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4 : Impact de l’écoulement sur l’alignement et la tension des proplaquettaires. Enregistrement vidéo en accéléré d’une proplaquettaire avant et après un arrêt cardiaque. La vidéo montre trois proplaquettaires (vertes, étiquetées avec un dérivé d’anticorps anti-GPIX AF-488) dans la même ligne de flux avant l’arrêt cardiaque, donc mal individualisées à la résolution de la microscopie à deux photons. Après un arrêt cardiaque, les trois proplaquettaires se séparent et se détendent en l’absence de flux sanguin. Vidéo acquise avec un microscope confocal Leica SP8 équipé d’un scanner résonant 8 kHz, image avec un objectif eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica). Les profils ont été alignés à l’aide du plug-in de correspondance de modèle ImageJ et une projection z moyenne a été obtenue. L’arrière-plan a été soustrait, l’image a été lissée et la luminosité et le contraste ajustés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 5: Impact de l’injection de vincristine sur le comportement proplaquettaire des souris WT. Enregistrement vidéo en accéléré d’une proplaquettaire avant et après l’administration de vincristine (1 mg/kg) (projection z). La proplaquettaire allongée (verte) dans les vaisseaux sinusoïdaux (rouge) commence à se rétracter après l’administration intraveineuse de vincristine. La vidéo a été acquise avec un microscope confocal Leica SP8 équipé d’un scanner résonant de 8 kHz, image avec un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica). Le profil a été aligné à l’aide du plug-in de correspondance de modèle ImageJ et une projection z moyenne a été obtenue. L’arrière-plan a été soustrait, l’image a été lissée et la luminosité et le contraste ajustés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 6: Impact de l’injection de vincristine sur le comportement proplaquettaire des souris déficientes en myosine. Enregistrement vidéo en accéléré d’une proplaquettaire avant et après l’administration de vincristine (1 mg/kg) (projection z). La proplaquettaire allongée (verte) dans les vaisseaux sinusoïdaux (rouge) continue de s’allonger chez les souris Myh9-/-. La vidéo a été acquise avec un microscope confocal Leica SP8 équipé d’un scanner résonant de 8 kHz, image avec un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica). Le profil a été aligné à l’aide du plug-in de correspondance de modèle ImageJ et une projection z moyenne a été obtenue. L’arrière-plan a été soustrait, l’image a été lissée et la luminosité et le contraste ajustés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Figure supplémentaire S1 : Conception pour l’impression 3D de l’anneau et du support du crâne. Cette conception a été utilisée pour imprimer en 3D (A) l’anneau du crâne en acier inoxydable de haute qualité, (B) la vis, (C) le bloc en acier inoxydable et (D) le support en polymère ABS. Abréviations: 3D = tridimensionnel; ABS = ABS = acrylonitrile butadiène styrène. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Vidéos supplémentaires :

Vidéo supplémentaire 1 : Enregistrement vidéo time-lapse représentatif (projection z) chez une souris de type sauvage avec des mégacaryocytes étendant la proplaquète (vert) dans les sinusoïdes de la moelle osseuse (rouge, Qtracker). Acquis avec un microscope Leica SP5 équipé d’un scanner résonant de 12 kHz et d’un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica), acquisition z-stack à des intervalles de 10 s, profondeur z de 1,34 μm, résolution x-y 384 x 384 pixels, ligne moyenne 8. Chaque fois que nécessaire, le profil était aligné à l’aide du plug-in de correspondance de modèle ImageJ pour obtenir une projection z moyenne. En fonction de la qualité de l’image, l’arrière-plan a été soustrait, l’image a été lissée et la luminosité et le contraste ajustés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 2 : Enregistrement vidéo time-lapse représentatif (projection z) chez une souris de type sauvage avec des mégacaryocytes étendant la proplaquète (vert) dans les sinusoïdes de la moelle osseuse (rouge, Qtracker). Acquis avec un microscope Leica SP5 équipé d’un scanner résonant de 12 kHz et d’un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95 (Leica), acquisition z-stack à des intervalles de 10 s, profondeur z de 1,34 μm, résolution x-y 384 x 384 pixels, ligne moyenne 8. Chaque fois que nécessaire, le profil était aligné à l’aide du plug-in de correspondance de modèle ImageJ pour obtenir une projection z moyenne. En fonction de la qualité de l’image, l’arrière-plan a été soustrait, l’image a été lissée et la luminosité et le contraste ajustés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Matériel supplémentaire :

Fichier de codage 1: Bloc d’impression 3D. Fichier objet 3D pour l’impression du bloc. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier de codage.

Fichier de codage 2: Impression 3D-Anneau de crâne. Fichier objet 3D pour l’impression de l’anneau du crâne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier de codage.

Fichier de codage 3: Prise en charge de l’impression 3D. Fichier objet 3D pour l’impression du support. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier de codage.

Fichier de codage 4: Impression 3D-Anneau à vis. Fichier objet 3D pour l’impression de la vis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier de codage.

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Discussion

Les mécanismes de formation des plaquettes dépendent fortement de l’environnement de la moelle osseuse. Par conséquent, la microscopie intravitale est devenue un outil important sur le terrain pour visualiser le processus en temps réel. Les souris avec des mégacaryocytes fluorescents peuvent être obtenues en croisant des souris exprimant la Cre recombinase dans des mégacaryocytes avec n’importe quelle souris rapporteur floxée contenant une cassette d’expression génique fluorescente conditionnelle. Ici, des souris rapporteures mTmG ont été utilisées (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) croisées avec des souris Pf4-cre11,permettant un marquage de fluorescence vert intense dans les mégacaryocytes et les plaquettes12. Il est important de noter que certaines fuites ont été rapportées avec des souris Pf4-cre dans les leucocytes, y compris les monocytes / macrophages et les fibroblastes12,13.

Cependant, les mégacaryocytes sont facilement reconnaissables à leur grande taille et à leur noyau. Les expérimentateurs nouveaux sur le terrain pourraient comparer les observations dans [mTmG; Pf4-cre] souris avec celles obtenues après un étiquetage spécifique aux mégacaryocytes. Ceci est possible grâce à l’administration intraveineuse d’un anticorps marqué Alexa-fluor dirigé contre la protéine spécifique aux plaquettes, GPIX (CD42a)3,14. Cette dernière approche est également bénéfique pour l’imagerie de mégacaryocytes fluorescents à partir de n’importe quelle souris génétiquement modifiée sans effectuer de croisements de souris fastidieux et longs avec des souris rapporteures fluorescentes. Ici, des souris âgées de 5 à 7 semaines ont été utilisées comme souris plus jeunes présentes avec un os plus mince qui est plus translucide et facilite l’imagerie par rapport aux souris plus âgées. Cependant, les souris trop jeunes peuvent présenter des difficultés dans l’installation de l’anneau crânien sans fuite.

Dans cette étude, l’imagerie intravitale a été réalisée à l’aide d’un microscope Leica équipé d’un objectif d’eau 25x avec une ouverture numérique de 0,95(Table des matériaux). L’objectif doit être conique afin qu’il puisse entrer dans la coupe formée par l’anneau crânien avec une distance de travail optimale. Les images ont été enregistrées avec un scanner résonant (12 ou 8 kHz). Les paramètres globaux dépendront du type de question scientifique à laquelle il faut répondre et doivent être optimisés en fonction du grossissement, de la résolution et de la vitesse d’acquisition nécessaires. Par exemple, avec un scanner résonant de 12 kHz, un objectif 25x serait mieux adapté pour mesurer la vitesse plaquettaire, alors qu’un scanner de 8 kHz et un grossissement plus faible pourraient être suffisants pour enregistrer l’allongement des proplaquettaires.

L’étape la plus critique du protocole est la fixation correcte de l’anneau à l’os du crâne afin qu’aucune fuite ne se produise et qu’il ne se détache pas pendant l’enregistrement. Pour cela, il est essentiel que l’os du crâne soit sec juste avant d’appliquer l’anneau. Une fois l’anneau collé, réhumidifiez rapidement l’os. De plus, en raison de la force exercée par le poids de la tête sur l’anneau, l’anneau est soumis à une tension qui peut le faire se détacher partiellement pendant l’enregistrement. Cela peut provoquer des fuites et donc une sécheresse de l’os, entraînant à la fois des images de mauvaise qualité et des réactions inflammatoires indésirables. Ce problème peut être facilement évité en ajoutant une compresse pliée sous le nez de la souris pour soutenir la tête (Figure 3C). Un autre point critique est de minimiser les saignements et la présence de sang à l’intérieur de l’anneau, car cela peut entraîner des images floues. Cela doit être gardé à l’esprit lors de l’étude de souris qui présentent une hémostase défectueuse et sont sujettes aux saignements. Certains traceurs, tels que le dextran, peuvent présenter des fuites dans la cavité de la moelle osseuse s’ils sont injectés sous une forme concentrée, ce qui aggrave l’imagerie des vaisseaux, mais pas la fluorescence verte des mégacaryocytes. Qtracker-655 ne fuit pas beaucoup mais est dégagé de la circulation dans les 30 minutes, de sorte que de nouvelles injections du traceur sont nécessaires pour visualiser les vaisseaux sur de plus longues périodes.

Une limitation de cette méthode décrite ici est la nécessité d’arrêter l’acquisition toutes les 35 minutes pour réinjecter des anesthésiques. Cette limitation peut être surmontée si un appareil d’anesthésie est disponible. Dans ce cas, l’anesthésie peut être induite de la même manière par injection par voie intra-opératoire d’un mélange de kétamine et de xylazine, ce qui est le moyen le plus simple d’effectuer l’insertion du cathéter et la chirurgie mineure. Une fois positionnée sous l’objectif du microscope, l’anesthésie est ensuite maintenue par inhalation de gaz (mélange d’oxygène, d’anesthésiques tels que l’isoflurane et l’air ambiant). De cette façon, les observations peuvent être faites sur plusieurs heures sans interruption. Cependant, pour des raisons éthiques, les observations ont été limitées à 3 h dans cette étude. Une autre limitation dans l’utilisation du mélange kétamine/xylazine pourrait être son impact délétère potentiel sur les fonctions plaquettaires16 qui pourrait nécessiter d’autres schémas d’anesthésie.

Dans l’ensemble, le principal mérite de ce protocole bien établi est son aspect non invasif avec une chirurgie minimale. D’autres protocoles ont été développés pour effectuer une imagerie intravitale time-lapse dans les os longs. Ceux-ci reposent soit sur une chirurgie invasive qui nécessite l’ablation du tissu musculaire et l’abrasion osseuse17,18, des sondes endoscopiques implantées près de la tête du fémur19,20, soit l’installation d’une chambre de fenêtre dans le fémur21. Toutes ces procédures entraînent un traumatisme majeur et divers degrés d’inflammation. L’inflammation est non seulement préjudiciable à la souris, mais il a également été rapporté qu’elle modifiait le processus de formation des plaquettes6 de sorte que des conditions inflammatoires incontrôlées pourraient entraîner des divergences et une mauvaise interprétation des données. C’est pourquoi cette procédure a été choisie pour éviter les réactions inflammatoires. Cependant, selon la question scientifique, les expérimentateurs peuvent préférer avoir un champ d’observation plus profond et une résolution plus élevée (moins de diffusion), ce qui est possible en utilisant une approche basée sur l’amincissement du crâne au détriment d’un faible degré de réaction inflammatoire.

En raison de sa nature non invasive, la principale limite de cette méthode est la profondeur maximale qui peut être atteinte. En raison de la densité de l’os et de ses propriétés de diffusion, il est possible d’imager des régions à une profondeur de quelques centaines de micromètres seulement, empêchant ainsi l’observation de l’ensemble de la moelle calvaire. Le développement de la microscopie à trois photons, qui repose sur des longueurs d’onde d’excitation infrarouge encore plus élevées, semble être une approche prometteuse avec une résolution supérieure des tissus profonds. Il a déjà été utilisé avec succès pour imager profondément dans le cerveau même à travers l’os22,23, ouvrant la possibilité excitante d’imager la moelle osseuse dans les os longs sans avoir à amincir l’os ou à implanter une fenêtre chirurgicale.

En résumé, cette méthode est de plus en plus utilisée pour étudier le comportement des mégacaryocytes dans la moelle osseuse et visualiser l’extension des proplaquettaires. De plus, en permettant la visualisation de l’os compact calvariaire externe ainsi que d’une partie de la moelle sous-jacente, cette méthode a déjà été utilisée dans de nombreuses applications en dehors du champ plaquettaire. Il a été utilisé pour l’étude de la dynamique des cellules osseuses et médullaires dans leur environnement, y compris les ostéoblastes et les ostéoclastes, le trafic de leucocytes et la sortie de la moelle, les cellules endothéliales et l’architecture microvasculariste, la dynamique du flux sanguin dans les microvassaux de la moelle osseuse ou le homing cellulaire24.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Florian Gaertner (Institut des sciences et de la technologie d’Autriche, Klosterneuburg, Autriche) pour ses conseils d’expert sur les expériences de microscopie à deux photons au moment où nous avons établi la technique en laboratoire, et Yves Lutz du Centre d’imagerie IGBMC / CBI (Illkirch, France) pour son expertise et son aide avec le microscope à deux photons. Nous remercions également Jean-Yves Rinkel pour son aide technique et Ines Guinard pour le dessin du schéma de la figure 1. Nous remercions l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) pour son accompagnement dans l’acquisition du microscope à deux photons. AB a été soutenu par des bourses postdoctorales de l’Etablissement Français du Sang (APR2016) et de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GNU Octave software GNU Project https://www.gnu.org/software/octave/
 Histoacryl 5 x 0, 5 mL Braun 1050052 injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes Leica Microsystems
ImageJ GNU project Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL Boehring 03661103003199 eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 Leica Microsystems simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab MathWorks https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g Laboratoires T.V.M. 03700454505621 Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed Rotec 13001002
Qtracker 655 vascular label Invitrogen Q21021MP injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL Bayer 04007221032311
Superglue gel to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G Terumo SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) Coherent

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References

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Biologie Numéro 173 Microscopie à deux photons Observation intravitale Moelle osseuse du crâne Mégacaryocytes Proplaquettaires
<em>In Vivo</em> Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris
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Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F.,… More

Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F., Gachet, C., Léon, C. In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow. J. Vis. Exp. (173), e62515, doi:10.3791/62515 (2021).

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