في البروتوكول الحالي ، نوضح كيفية تصور استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة S / G2 من دورة الخلية باستخدام طريقة قائمة على التألق المناعي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج العالمي باستخدام وسم الحمض النووي BrdU إلى جانب تصوير تمييز دورة الخلية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد دراسة الاستجابة لتلف الحمض النووي (DDR) مجالا معقدا وأساسيا ، والذي أصبح أكثر أهمية فقط بسبب استخدام الأدوية التي تستهدف DDR لعلاج السرطان. هذه الأهداف هي البوليميراز البولي (ADP-ribose) (PARPs) ، والتي تبدأ أشكالا مختلفة من إصلاح الحمض النووي. إن تثبيط هذه الإنزيمات باستخدام مثبطات PARP (PARPi) يحقق الفتك الاصطناعي من خلال منح ضعف علاجي في الخلايا التي تعاني من نقص في إعادة التركيب المتماثل (HR) بسبب الطفرات في سرطان الثدي من النوع 1 (BRCA1) أو BRCA2 أو شريك وتوطين BRCA2 (PALB2).
الخلايا المعالجة ب PARPi تتراكم فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيط (DSBs). تتم معالجة هذه الفواصل بواسطة آلية استئصال نهاية الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تكوين الحمض النووي الأحادي (SS) وإصلاح الحمض النووي اللاحق. في سياق BRCA1 الناقص ، يؤدي تنشيط استئصال الحمض النووي من خلال الطفرات في مثبطات استئصال الحمض النووي ، مثل 53BP1 و DYNLL1 ، إلى مقاومة PARPi. لذلك ، فإن القدرة على مراقبة استئصال الحمض النووي في السيلولو أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي وتطوير استراتيجيات جديدة للتغلب على مقاومة PARPi. تسمح التقنيات القائمة على التألق المناعي (IF) بمراقبة استئصال الحمض النووي العالمي بعد تلف الحمض النووي. تتطلب هذه الاستراتيجية وضع علامات الحمض النووي الجينومي طويل النبض باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU). بعد تلف الحمض النووي واستئصال نهاية الحمض النووي ، يتم الكشف عن الحمض النووي الناتج الذي تقطعت به السبل على وجه التحديد بواسطة جسم مضاد مضاد ل BrdU في ظل ظروف أصلية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا دراسة استئصال الحمض النووي باستخدام علامات دورة الخلية للتمييز بين المراحل المختلفة لدورة الخلية. تسمح الخلايا في مرحلة S / G2 بدراسة الاستئصال النهائي داخل HR ، في حين يمكن استخدام خلايا G1 لدراسة الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ). يتم وصف بروتوكول مفصل لطريقة IF هذه إلى جانب التمييز في دورة الخلية في هذه الورقة.
المقدمة
يعد تعديل عوامل إصلاح الحمض النووي طريقة دائمة التطور لعلاج السرطان ، خاصة في بيئات الأورام التي تعاني من نقص في إصلاح الحمض النووي. يعد تثبيط عوامل إصلاح محددة أحد الاستراتيجيات البارعة المستخدمة لتوعية الخلايا السرطانية بالعوامل الضارة بالحمض النووي. أدت عقود من الأبحاث إلى تحديد طفرات مختلفة من جينات إصلاح الحمض النووي كمؤشرات حيوية لخيارات الاستراتيجية العلاجية1. ونتيجة لذلك، أصبح مجال إصلاح الحمض النووي مركزا لتطوير الأدوية لضمان مجموعة واسعة من العلاجات، وتمكين مفهوم الطب الشخصي.
يتم إصلاح DSBs من خلال مسارين رئيسيين: NHEJ و HR2. مسار NHEJ عرضة للخطأ ، حيث يربط بسرعة نهايتين من الحمض ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. زراعة الخلايا والعلاجات وإعداد الغطاء
ملاحظة: يجب أن تتم جميع عمليات طلاء الخلايا وعمليات النقل والعلاجات، بصرف النظر عن التشعيع، تحت غطاء معقم لزراعة الخلايا.
- اليوم 1
- في طبق مكون من 6 آبار ، ضع غطاء واحد في كل بئر لأكبر عدد ممكن من الظروف حسب الحاجة. لوحة ~ 150،000 خلايا HeLa لنقل الحمل أو العلاج من تعاطي المخدرات ، حسب الرغبة.
ملاحظة: في حالة النقل ، يوصى بإجراء نقل عكسي في وقت الطلاء ، أو من الممكن إجراء نقل أمامي بعد عدة ساعات من الطلاء للسماح بالالتصاق. يتم إجراء النقل العكسي عن طريق إضافة مزيج النقل إلى الغطاء قبل إضافة الخلايا ؛ وبالتالي ، يبدأ النقل قبل أن تبدأ الخلايا في الالتصاق. وعلى النقيض من ذلك، فإن الن....
- في طبق مكون من 6 آبار ، ضع غطاء واحد في كل بئر لأكبر عدد ممكن من الظروف حسب الحاجة. لوحة ~ 150،000 خلايا HeLa لنقل الحمل أو العلاج من تعاطي المخدرات ، حسب الرغبة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا البروتوكول ، تم استخدام الفحص القائم على بروموديوكسي يوريدين (BrdU) لقياس استجابة استئصال خلايا HeLa للضرر الناجم عن الإشعاع كميا. يتم تصور مسارات ssDNA المتولدة كبؤر متميزة بعد تلطيخ التألق المناعي (الشكل 1A). ثم تم تحديد البؤر المحددة كميا والتعبير عنها على أنها الكثافة المتكاملة الكلية لتلطيخ BrdU في النوى (الشكل 1B ، الشكل التكميلي S1 ، الشكل التكميلي S2 ، والشكل التكميلي S3). من الممكن قياس عدد البؤر أو متوسط كثافة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصف هذه الورقة طريقة تستخدم تلطيخ IF لقياس الاختلافات في استئصال الحمض النووي في السليلولو. المعيار الحالي لمراقبة تأثير على استئصال الحمض النووي هو من خلال تلطيخ RPA. ومع ذلك ، هذه طريقة غير مباشرة قد تتأثر بتكرار الحمض النووي. في السابق ، تم وصف تقنية أخرى لاستئصال الحمض النووي القائم على دمج BrdU IF لتصنيف الشدة الناتجة في الخلايا الإيجابية BrdU و BrdU السلبية. سمحت هذه الطريقة للخلايا التي لا تخضع للموارد البشرية أن تحسب على أنها إيجابية بسبب الخلفية أو تلطيخ الميتوكوندريا مما يؤدي إلى كثافة BrdU
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر ماري كريستين كارون على المشورة الفنية المتميزة. يتم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. يحمل كرسي أبحاث كندا من المستوى 1 في إصلاح الحمض النووي وعلاجات السرطان. J.O'S هو زميل طالب دكتوراه FRQS ، و S.Y.M هو زميل ما بعد الدكتوراه FRQS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alexa 568 الماعز المضادة للأرانب | المجسات الجزيئية | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 الماعز المضادة للفأر | المجسات الجزيئية | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | محلية الصنع | 1: 2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) Novus | NBP2-67390 | 1:500 | |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) Abcam | Ab7291 | 1: 100000 | |
| مضاد ل BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1: 1000 |
| منضدة الأشعة السينية | خلية الإشعاع Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell | Profiler Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| تغليف مختبر Curwood Parafilm M 4 بوصة / 250 قدم | فيشر علمي | 13-374-12 | |
| DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز | فيشر 10063542 | ||
| EGTA | سيجما-ألدريتش | E3889 | |
| الجنين مصل البقر | Gibco | 12483-020 | |
| غطاء فيشربراند: مربعات 22 × 22 | فيشر العلمي | 12 541B | |
| مجهر فلوري | لايكا | DMI6000B | 63x هدف الغمر |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2< / sub> حاضنة CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37٪ CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16٪ | Cedarlane Labs | 15710-S (EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUCACACGUCAA | |
| الصوديوم Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| السكروز | بيو شوب كندا | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
المراجع
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-path....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
