Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı
Bu makalede
Özet
Özet
Model hücre zarları erken ilaç keşfinden toksisite çalışmalarına kadar birçok uygulama ile faydalı bir tarama aracıdır. Hücre zarı, tüm hücre tipleri için çok önemli bir koruyucu bariyerdir ve iç hücresel bileşenleri hücre dışı ortamdan ayırır. Bu membranlar büyük ölçüde çeşitli proteinler ve kolesterol ile birlikte dış hidrofilik kafa grupları ve iç hidrofobik kuyruk gruplarını içeren bir lipid bilayerden oluşur. Lipitlerin bileşimi ve yapısı, hücreler ve farmasötik, biyolojik toksinler ve çevresel toksik ediciler içerebilecek hücresel mikroçevrici arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere biyolojik işlevin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bu çalışmada lipid bilayerlerini taklit eden tek lipid ve multi-lipid destekli ve askıda hücre formüle etme yöntemleri açıklanmıştır. Daha önce, moleküler etkileşimleri anlamak için tek lipid fosfatidiylcholine (PC) lipid bilayerlerin yanı sıra multi-lipid plasental trophoblast esintili lipid bilayerler geliştirilmiştir. Burada her iki tip bilayer modeline ulaşma yöntemleri sunulacaktır. Hücre taklit eden multi-lipid bilayerler için, istenen lipid bileşimi ilk olarak birincil hücrelerden veya hücre çizgilerinden lipid ekstraksiyonu ve ardından sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ile belirlenir. Bu bileşim kullanılarak lipid vesikülleri ince film hidrasyon ve ekstrüzyon yöntemi kullanılarak imal edilir ve hidrodinamik çapı ve zeta potansiyeli karakterize edilir. Desteklenen ve askıya alınan lipid bilayerler daha sonra sırasıyla, dağılım izleme (QCM-D) ile kuvars kristal mikro denge kullanılarak ve paralel bir yapay membran geçirgenlik testinde (PAMPA) kullanılmak üzere gözenekli bir membran üzerinde oluşturulabilir. Temsili sonuçlar in vitro hücreli membran lipid bilayer modellerinin tekrarlanabilirliğini ve çok yönlülüğünü vurgulamaktadır. Sunulan yöntemler, çeşitli moleküllerin ve makromoleküllerin hücre zarı ile geçirgenliği, adsorpsiyonu ve gömmesi gibi etkileşim mekanizmalarının hızlı ve facile değerlendirilmesine yardımcı olabilir, ilaç adaylarının taranmasında ve potansiyel hücresel toksisitenin tahmin edilmesine yardımcı olabilir.
Giriş
Öncelikle fosfolipidler, kolesterol ve proteinlerden oluşan hücre zarı, tüm canlı hücrelerin önemli bir bileşenidir1. Lipid amfifililiği tarafından yönlendirilen organizasyon ile hücre zarı koruyucu bir bariyer görevi görerek hücrenin çevresindeki çevre ile nasıl etkileşime girdiğini düzenler2. Birkaç hücresel işlem, membranın lipid ve protein bileşimine bağlıdır1,2. Örneğin, hücre zarı etkileşimleri etkili ilaç dağıtımı için önemlidir3. farmasötikler, biyolojikler, nanomalzemeler, biyolojik toksinler ve çevresel toksikler bir hücre zarını....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Tek lipid veziklinlerin geliştirilmesi
- İnce film hidrasyon yöntemi
- Lipid stok çözeltilerinin hazırlanması ve depolanmasının
NOT: Kloroform kullanan tüm adımların kimyasal duman kaputunda gerçekleştirilmesi gerekir. Kloroform her zaman solvent güvenli karbon fiber pipet uçları kullanılarak pipetlenmelidir. Kloroform içeren çözeltiler her zaman cam şişelerde saklanmalıdır.- Lipit tozunu içeren şişeye uygun kloroform hacmini ekleyerek 10 mg/mL lipit stok çözeltisi hazırlayın ve iyice karıştırın. Örneğin, 200 mg L-α-fosfatidiylcholine (yumurta, tavuk) (yumurtaPC) için 20 mL kloroform ekleyin. Stok çözeltisi gerekirse farklı bir konsantrasyon....
- Lipid stok çözeltilerinin hazırlanması ve depolanmasının
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde desteklenen ve askıya alınmış lipid bilayerleri oluşturma yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır (Şekil 1). Desteklenen bir lipid bilayer oluşturmanın ilk adımı lipid veziklin geliştirmektir. Mini ekstrüder, küçük hacimlerde lipid veziklin hazırlanmasına (1 mL veya daha az) izin verirken, büyük ekstrüder 5-50 mL lipid veziklin tek bir parti halinde hazırlanmasını sağlar. Mini veya büyük ekstrüder tarafından oluşturulan tek lipid veziklinlerin boyut dağılımları
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol lipid veziklinlerin, desteklenen lipid bilayerlerin ve askıya alınmış lipid bilayerlerinin oluşumuna izin verir. Burada, bu yapıların her birini oluşturmak için kritik adımlar sunulmaktadır. Lipid veziklin oluştururken, lipit geçiş sıcaklığının üzerinde ekstrüzyonyapmak önemlidir 39. Geçiş sıcaklığının altında olduğunda, lipit fiziksel olarak sipariş edilen jel faz39'dabulunur. Bu sıralı fazda hidrokarbon lipid kuyrukları tamamen uzatılır ve yakın paketlemeye iz.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, çıkar çatışması veya rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu materyal, A.S.'ye verilen 1942418 No.'luk Hibe kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışmalara ve C.M.B.H.'ye verilen Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu'na, 1644760 No. Hibesi kapsamında dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Yazarlar, lipid vesicle karakterizasyon veri toplama için Dr. Noel Vera-González'e teşekkür ediyor. Yazarlar, Zetasizer'ını kullandığı için Profesör Robert Hurt'a (Brown Üniversitesi) teşekkür eder. Yazarlar, Brown Üniversitesi Kütle Spektrometresi Tesisi'ne, özellikle de Lipid b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC, 16:0-18:1 PC) | Avanti Polar Lipidler | 850457 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (sodyum tuzu) (POPS, 16:0-18:1 PS) | Avanti Polar Lipidler | 840034 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (16:0-18:1 PE) | Avanti Polar Lipidler | 850757 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glisero-2-fosfo-L-serin (DOPS, 18:1 PS) | Avanti Polar Lipidler | 840035 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC, 18: 1 (Δ 9-Cis) PC) | Avanti Polar Lipidler | 850375 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE, 18: 1 (Δ 9-Cis) PE) | Avanti Polar Lipidler | 850725 | |
| 1,2-distearoil-sn-glisero-3-etilfosfokolin (klorür tuzu) (18:0 EPC (Cl Tuzu)) | Avanti Polar Lipidler | 890703 | |
| 3 mL Luer-Loc şırınga | BD | 309657 | |
| 40 mL numune şişesi, politetrafloroetilen (PTFE)/kauçuk astarlı kehribar | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
| Asetonitril | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
| Amonyum format | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
| C18, 3,5 um x 50 mm sütun, SunFire | Waters | ||
| Kloroform | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
| Küvet UV Mikro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
| Di (2-etilheksil) ftalat (DEHP) | Millipore Sigma | 36735 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Filtre destekleri, 10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | Mini ekstruder için boyut |
| Katlanmış kılcal zeta hücresi | Malvern Panalitik | DTS1070 | |
| İzopropanol | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34256 | |
| L-&alfa;-fosfatidilinositol (soya) (Soya PI) | Avanti Polar Lipids | ||
| L-&alfa;-fosfitidilkolin (Yumurta, Tavuk) | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
| Metanol | Sigma-Aldrich | 179337 - Tutucu | |
| mini ekstruder seti | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MultiScreen-IP Filtre Plakası, 0,45 inç/sn; &mikro; m, berrak, steril | PAMPA çalışmaları için | Millipore Sigma | MAIPS4510 |
| Azot gazı, ultra saf | TechAir | NI T5.0 | |
| Nüklepor hidrofilik membranlar, polikarbonat, 19 mm, 0,1 um | Whatman | 800309 | Mini ekstrüder için boyut |
| Çekirdek gözenekli hidrofilik membranlar, polikarbonat, 25 mm, 0,1 um | Whatman | 110605 | Büyük ekstruder |
| Parafilm için boyut | Bemis | PM999 | |
| Fosfat tampon salin (PBS), 10x | Genesee Scienfitic | 25-507X | 1x |
| Qsoft 401 yazılımına | Biolin Scientific | ||
| Kuvars Kristal Mikro Terazi Dağıtımlı Q-Sense | Analizörü Biolin Scientific | ||
| Sintilasyon şişeleri, borosilikat cam şişeler, 20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
| Silikon Dioksit, ince QSensors | Biolin Scientific | QSX 303 | |
| Sodyum klorür (NaCl) | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Solvent Güvenli pipet uçları | Sigma-Aldrich | S8064 | |
| Sfingomyelin (Yumurta, Tavuk) | Avanti Polar Lipidler | ||
| 860061 Trizma tabanı | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
| Tripsin-etilendiamintretaasetik asit | Keson Laboratuvarları | TRL01-6X100ML | |
| Whatman tahliye diski, 25 mm | Whatman | 230600 | Büyük ekstruder için boyut |
| Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
| Zetasizer 7.01 yazılımı | Malvern Panalytical |
Kaynaklar
- Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
- Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
