Summary
M2样肿瘤相关巨噬细胞(TAM)与肿瘤进展和癌症预后不佳有关。本协议作为在 14 天内可重复区分和分化 THP-1 单细胞状细胞成 M2 样巨噬细胞的详细指南。该模型是研究TAM在肿瘤微环境内的抗炎作用的基础。
Abstract
肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 可以根据外部刺激切换其表达和细胞因子特征。这种非凡的可塑性使 TAM 能够适应肿瘤微环境内的持续变化。巨噬细胞可以主要具有抗炎(M1样)或抗炎(M2样)属性,并且可以在这两个主要状态之间不断切换。肿瘤环境中的M2样巨噬细胞与多种癌症的癌症进展和预后不佳有关。诱导THP-1细胞分化和极化的许多不同方法用于研究细胞和细胞间机制以及TAM在肿瘤微环境下的影响。目前,没有使用THP-1细胞系的M2样巨噬细胞偏振的既定模型,由于某些体外刺激,巨噬细胞的表达和细胞因子特征的结果因研究而异。此协议作为详细的指导,将 THP-1 单细胞状细胞区分为 M0 巨噬细胞,并在 14 天内将细胞进一步分化为 M2 样表型。我们使用光显微镜演示了THP-1单细胞状细胞、分化巨噬细胞和偏振M2样巨噬细胞的形态变化。该模型是细胞系模型研究TAM的抗炎作用及其与肿瘤微环境其他细胞群相互作用的基础。
Introduction
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)及其在慢性炎症、癌症发病和肿瘤发育中的作用是最近研究1、2的重要目标。被招募到发育中的肿瘤组织微环境的外周血单核细胞分化成巨噬细胞,可分化成巨噬细胞3的两个主要亚型。经典激活的巨噬体主要代表亲炎M1样表型,而替代激活的M2样亚型主要表现出抗炎特性4。巨噬细胞可以根据细胞代谢在这两种主要表型之间动态切换,中间亚型具有炎症和抗炎特性5。TAM 代表两种表型的异质种群。然而,不同类型癌症的肿瘤促进功能和预后差,尤其与M2样巨噬细胞6、7、8有关。
巨噬细胞的功能特征及其与肿瘤微环境中其他细胞的相互作用,在肿瘤持续发展的不断变化的环境中具有复杂性和挑战性。细胞系可以提供同质细胞群,在培养中具有稳定的生存能力,从而促进演示定义的细胞和细胞间机制的过程。单核细胞样THP-1细胞系是原发性人类单核细胞9的合法模型系统。这种自发不朽的细胞系是从一名患有急性单细胞白血病的一岁婴儿的外周血液中获得的。THP-1细胞的分化和极化已经通过几项研究进行了报告,并以多种不同的方式进行了11、12、13、14。激活,因此,巨噬细胞的两极分化成M1样表型后,一个补偿性的抗炎反弹机制,促进M2样表型通过细胞因子产生的炎症性巨噬细胞,如间脂6(IL-6)或异位15,16。这可能作为一个断裂机制,以减轻细胞激活17后过度的炎症反应。将单核细胞和THP-1单核细胞分化成抗炎M2样表型的过程本身也伴随着必须克服的亲炎刺激。炎症细胞因子反应可由机械应激18引起,如改变介质以重新喂养细胞,或添加化合物来分化THP-1细胞,如磷12-肌酸13-醋酸酯(PMA),并诱导肿瘤坏死因子α(TNF+)、白细胞介质1+(IL-1+)或IL-6 19的产生。这种改变的细胞因子表达配置文件作为对PMA的反应可以影响和防止随后的巨噬细胞偏振20。充足的休息时间,如PMA治疗后报告,允许这些炎症反应减少和促进细胞偏振成一个独特的M2样表型21。
该协议演示了一种在 14 天内将 THP-1 单细胞状细胞分化和偏振成 M2 样巨噬细胞表型的方法。
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Protocol
注:此协议中描述的步骤概述见 图 1。购买了人类单细胞样白血病细胞系THP-1。进行了短串联重复分析,以验证 THP-1 细胞线。在无菌条件下执行所有步骤。THP-1单细胞系在悬浮中生长,不附着在细胞培养表面。通过机械应力或PMA的特定治疗,可以通过将单核细胞分化成大噬细胞来诱导粘性。
1. THP-1单细胞样细胞的培养和维护
- 设置 150s 的定时器。将含有THP-1细胞系(材料表)的冷冻小瓶从液氮中取出,并在清洁水浴(37 °C)中立即解冻。小瓶一放入水浴中,立即启动分时器。松开盖子以释放解冻过程中积聚的压力,但要确保管打开不接触水,以避免污染。解冻细胞的最佳时间段在120-150s之间。继续解冻细胞悬浮,直到小瓶内留下约4毫米大小的冰片:然后,立即进入下一步。
- 将细胞悬浮液的液相转移到含有 9 mL 暖 (37 °C) 生长介质的 15 mL 管(材料表)。然后,将 1 mL 的暖中细胞悬架转移到 THP-1 小瓶中,然后返回到 15 mL 管中,以融化剩余的冰片并冲洗小瓶,以确保不留下任何细胞。
- 通过上下管道与 1000 μL 移液器轻轻混合悬架。取出一个小样本(约 10 μL),以计算细胞的生存能力(使用尝试蓝排除),而它们旋转。在 37 °C 下以 200 x g 旋转热电池悬架 7 分钟。
- 完全取出超高密度,并重新使用一定体积的温暖生长介质,实现 5 x 105/mL的细胞密度。轻轻混合悬架,将22mL的体积转移到T-75细胞培养瓶(材料表)。将烧瓶直立存放在 37 °C 的孵化器中,二氧化碳 (CO2)浓度为 5%。每 3-4 天交换一次增长介质。
2. THP-1细胞的播种和M0巨噬细胞的分化
- 将含有生长介质的细胞以各自的细胞密度准备成3×105/mL/井的种子细胞,放入24井细胞培养板(材料表)。轻轻混合介质,准备26mL的铝块,每个放入一个50mL管。使用每个 26 mL 的 aliquot 将细胞播种到各自的板中。
- 将含细胞介质的 1 mL 转移到 24 井板的每个井中。通过在传输之间上下管道轻轻混合媒体。
- 准备 PMA 的库存溶液(在 100 μL 的二甲基硫化物 (DMSO) 中溶液溶液 1 毫克 = DMSO 中 PMA 的 ±16 mM 溶液),并在细胞处理前用冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 稀释到 10 ng/μL 的最终工作浓度(材料表)。将溶液放在冰上并立即使用。不要重新冻结。每口井加入100 ng的PMA。让每个细胞板坐在孵化器中,无需任何进一步治疗72小时。
- 72 小时后,取出生长介质,代之以 1 mL 的新鲜生长介质。不要用移液器提示触摸井底。让细胞在孵化器中再休息96小时。
- 96小时后,重复步骤 2.4(介质更改),让细胞再休息 24 小时。
注:M0巨噬细胞现已准备用于实验(图2)。在将细胞作为进一步实验的一部分之前,请考虑仅使用 RPMI (材料表) 进行介质更改,因为生长介质补充剂可能会对添加用于细胞治疗的试剂造成干扰。如果需要 M2 样巨噬细胞,则继续执行第 3 节。
3. M0 巨噬细胞极化成 M2 样巨噬细胞
- 准备 IL-4 和 IL-13 的库存溶液(在 200 μl 无核酸水中溶解 20 μg 的 IL-4 或 IL-13),并在细胞治疗前立即将其稀释至 PBS 的 2 ng/μL 最终工作浓度。将溶液放在冰上并立即使用。不要重新冻结。
- 取出生长介质,代之以 1 mL 的新鲜生长介质。每口井加入20 ng的间柳金4(IL-4)和20 ng的间柳金13(IL-13)。让细胞在孵化器中休息48小时。
- 48 小时后,重复步骤 3.2。让细胞在孵化器中再休息48小时。
- 取出生长介质,代之以 1 mL 的新鲜生长介质。让细胞在孵化器中休息48小时。
注:M2型巨噬细胞现已准备用于实验(图2)。在将细胞作为进一步实验的一部分之前,考虑仅使用RPMI(材料表)进行介质变化,因为生长介质补充剂可能会引起干扰。
4. 用于流细胞学的分离和收获巨噬细胞
注:使用结合冷冲击和细胞刮的机械方法,从板中分离和收获极化巨噬细胞,用于流细胞学。
- 取出温暖的细胞介质,代之以冰冷的PBS(不含钙和镁)和5%的胎儿牛血清(FBS),每口井1ml。紧接着,将细胞板放在冰上45分钟。在去除温暖的细胞介质之前,不要将细胞板放在冰上,因为这将显著降低细胞的生存能力。只有在用冰冷的PBS/5%FBS混合物诱导冷冲击后,才将细胞留在冰上。
- 冰上45分钟后,用迷你细胞刮刀刮掉细胞(材料表)。轻轻地将冷 PBS/5% FBS 中的分离巨噬细胞转移到 15 mL 管中。将管子随时放在冰上,直到细胞被弄脏。
注:池中八口细胞,以达到足够的细胞计数进行染色。
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Representative Results
以M2样巨噬细胞为特征,使用分化标记簇(CD)CD14、CD11b、CD80(M1样标记)和CD206(M2样标记)的流细胞学验证M2极化。流细胞测量染色是根据制造商的说明进行的。巨噬细胞用PBS/5%FBS清洗,并孵育与Fcé受体块,以避免未特定的结合。然后,细胞被HITCH结合的小鼠抗人类CD14和CD80抗体染色,与PE结合的小鼠抗人类CD11b抗体,并与PE-串联结合小鼠抗人类CD206抗体和同型匹配IgG(材料表)在4°C下30分钟。 进行了四色流细胞分析和荧光定量。对细胞进行盖条,根据前向散射和侧散射排除细胞碎片。
单细胞和巨噬细胞标记CD14和CD11b分别表示在70.9%和74.7%的细胞中(图3)。在62.6%的细胞中,M1样标记CD80(0.2%)和M2样标记CD206的高表面水平几乎没有表现出积极性(图4)。
本协议中描述的极化方法产生的巨噬细胞显示了 CD14 和 CD11b 标记的表达。这两个标记都可以,但不必用巨噬细胞来表示。CD206 作为 M2 样宏量标记的明显积极性是预料之中的,而 CD80 表示为 M1 样标记的水平应该较低。Raggi等人使用外周血单核细胞(PBMC)证明了类似的结果,这些细胞被分化成M2样巨噬细胞22。CD206的平均表达在50%-60%之间,而CD80的平均表达在20%-25%之间。
使用定量实时 PCR (qRT-PCR) 对本协议创建的 M2 样巨噬细胞进行进一步定性。与THP-1单细胞状细胞相比,M2样巨噬细胞显示IL-6和C-X-C莫蒂夫化学液化物10(CXCL10)的调节, 以及抗炎标记CD206,白细胞间10(IL-10)和C-C莫蒂夫切莫金利甘德18(CCL18)(未显示的结果,待公布)的调高。
图1:M2样巨噬细胞系模型概述。 第 0 天,细胞被播种到具有生长介质的板中,并用 PMA 孵育 72 小时。在第 3 天和第 7 天改变细胞介质,使细胞在没有 PMA 的情况下休息,总共 120 小时。第8天,生长介质再次改变,细胞与IL-4和IL-13一起孵育,诱导M2样极化。此步骤在 2 天后,即第 10 天重复。在第12天,进行最后的介质变化,M2样细胞在生长介质中再休息48小时,然后用于实验(PMA = 磷栓12-肌酸酯-13-醋酸盐;伊尔 = 间柳金) 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:使用光显微镜的THP-1细胞、分化(M0)巨噬细胞和M2样巨噬细胞的细胞形态。 细胞在24井板中以每口井3×105 的种子。(A,B)THP-1细胞显示在基线上。(C,D)差异化的M0巨噬细胞接受PMA治疗72小时,生长介质变化和96小时休息期。(E,F)M2样巨噬细胞在完成IL-4和Il-13的极化处理后,在细胞模型的第14天(20倍和40倍放大倍率;比例 =100μm)显示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:CD14(FITC、FL1-H)和CD11b(PE,FL2-H)的流细胞学荧光分析。(A)密度散射图,每个象限中显示细胞百分比。(B,C)与负染色控制相比,M2 类巨噬细胞中的 CD14 和 CD11b 的直方图。请单击此处查看此图的较大版本。
图4:CD80(FITC,FL1-H)和CD206(PE-串联,FL3-H)的流细胞学荧光分析。(A)密度散射图,每个象限中显示细胞百分比。(B,C)与负染色控制相比,M2 类巨噬细胞中 CD80 和 CD206 的直方图。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此关于在 14 天内区分和偏振 THP-1 单细胞状细胞的协议提供了一种方法,通过在步骤之间有足够休息时间的细胞进行长期治疗孵化,获得具有不同 M2 样表型的巨噬细胞。
某些步骤对此协议至关重要。THP-1单核细胞的加倍时间约为26小时。细胞可以以 9 x 105/mL的细胞密度进行分裂,每次分裂时应以 3 x 105/mL 的密度播种。分裂可以在不去除所有使用过的(旧)细胞介质的情况下进行-仅用50%的新鲜介质重新喂养细胞确实可以加快细胞生长,因为受条件的细胞介质中的生长因子可以促进细胞增殖。然而,不交换所有的细胞介质会增加培养污染的风险,因此只能在新鲜培养细胞的第一段过程中进行。计算细胞很重要,能够以正确的密度培养细胞,并在解冻后确定细胞的生存能力。细胞正常解冻后死细胞的比例不应超过15%。
将细胞播种到板中需要温和但彻底地混合细胞悬浮,以便在每口井中获得一致的细胞密度。在将细胞播种到培养板之前,要准备好这些细胞,以确保含有细胞的介质的体积正确混合。由于介质中的 THP-1 单核细胞倾向于沉入小瓶底部,转移体积的连续温和混合对于实现细胞的一致密度至关重要。
细胞介质应随时加热至37°C,以避免冷冲击和亲炎细胞应激反应23。因此,对于介质变化和细胞治疗,板不应被排除在孵化器之外超过15分钟。此外,用于细胞治疗的各自化合物,如PMA、白细胞间和用于在治疗细胞之前稀释库存溶液的PBS,应始终保存在冰上,以避免降解。
通过 PMA 处理区分单核细胞的活体巨噬细胞粘附在井面上。在介质变化和其他进一步处理步骤中,移液器提示不应触摸板内井底,以防止细胞损伤。
对于具有分化或极化巨噬细胞的流细胞学,必须收获附着在板块上的细胞。有酶或机械技术分离细胞,包括尝试镇定,治疗酶混合物与蛋白解和拼贴解活性,或乙酰胺三氯乙酸(EDTA),冷冲击,细胞刮伤,甚至分离通过声压24,25。巨噬细胞的酶分离可导致细胞表面标记表达的改变,因此不是表型或功能分析的首选。与其他报告相比,这里进行的实验表明,冷冲击和刮掉巨噬细胞的组合显示了良好的细胞生存能力(>90%)使用Trypan蓝色染料排除。因此,建议使用这种技术分离细胞,并注释一旦诱发冷休克,细胞必须始终在冰上保持冷。
此协议的一个限制是使用单细胞状细胞系作为模拟体内巨噬细胞机制的基础。然而,使用原发性巨噬细胞的细胞培养研究可以显示可变细胞反应,并且由于细胞异质性26,机制可以被掩盖。THP-1细胞系是原人类单核细胞9的既定模型系统。由于在受控培养环境中的同质 THP-1 细胞群,细胞反应可能更精确地可重复。此外,某些技术优化了 THP-1 细胞作为模型,类似于原体单核细胞。一个重要的步骤是PMA治疗后5天的休息期,这增加了细胞质体积和细胞表面依从性,类似于差异化单细胞衍生细胞21。
另一个限制是创建某种M2样巨噬细胞表型,该表型具有其他特征,而不是以前研究中使用的M2样巨噬细胞。据报道,许多不同的技术来区分和偏振THP-1细胞,缺乏基线特征使研究间可重复性复杂化11,12,13,14。因此,根据所调查的机制,对基线研究中使用的巨噬细胞进行特征化非常重要。之后,应证明各自治疗后的细胞反应。
遵循本协议产生的M2样巨噬细胞是研究不同类型癌症、伤口愈合或纤维化中肿瘤发病和进展的细胞反应的坚实基础。有了这个协议,M0巨噬细胞或M2巨噬细胞都可以 在体外使用,并且细胞适合用于共同培养模型。这提供了一个独特的M2样巨噬体表型的广泛应用,随着时间的推移 ,在体外 得到严格控制。
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Disclosures
作者声明没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
路易斯维尔大学价格外科研究所得到约翰·普莱斯和芭芭拉·普劳顿·阿特伍德价格信托基金的财政支持。资金来源在研究的设计和进行以及数据的收集、管理、分析和解释方面没有作用。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
Ethyl alcohol (70%) | - | - | |
FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | - | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | - | |
L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | - | |
Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
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