Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie
Summary
We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.
Abstract
Subconjunctivale injectie is een aantrekkelijke route om oculaire geneesmiddelen toe te dienen vanwege de gemakkelijke transsclerale toegang die anterieure oculaire barrières omzeilt, zoals het hoornvlies en het bindvlies. Hoewel therapeutische effecten en farmacokinetiek van de geneesmiddelen bij subconjunctivale injectie in sommige studies zijn beschreven, beoordelen zeer weinigen de oculaire distributie van geneesmiddelen of medicijnafgiftesystemen (DDS). Dit laatste is van cruciaal belang voor de optimalisatie van het intraoculaire DDS-ontwerp en de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen om de gewenste oculaire lokalisatie en werkingsduur te bereiken (bijv. Acuut versus langdurig). Deze studie stelt het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) vast om de oculaire verdeling van fluorescerende liposomen in realtime in levende muizen na sub-conjunctivale injectie kwalitatief te bestuderen. Omdat dit is ontworpen voor in vivo visuele inspectie van weefsels op microscopisch niveau, is dit ook de eerste volledige beschrijving van de CLM-beeldvormingsmethode om de spatio-temporele verdeling van injectables in het oog na subconjunctivale injectie te bestuderen.
Introduction
De bloedklaring, weefselverdeling en doelbezetting van geneesmiddelen in levende systemen zijn pijlers voor het begrijpen van in vivo medicijndispositie. In preklinische diermodellen worden deze parameters meestal beoordeeld door frequente bloed- en weefselbemonstering op bepaalde tijdstippen na toediening van het geneesmiddel. Deze procedures zijn echter over het algemeen invasief, omvatten vaak niet-overlevingsmetingen en vereisen grote diercohorten voor statistische macht. Er kunnen extra kosten en tijd worden gemaakt, samen met ethische zorgen voor overmatig gebruik van dieren. Als gevolg hiervan is niet-invasieve beeldvorming hard op weg een integrale stap te worden in biodistributiestudies. Confocale lasermicro-endoscopie (CLM1,2) is zeer geschikt voor oculaire toepassingen om de spatio-temporele verdeling van therapeutica in de ogen van levende dieren met een hoge gevoeligheid en hoge resolutie niet-invasief in beeld te brengen1,3,4.
CLM heeft het potentieel om robuuste screening van oculaire medicijnafgiftesystemen (DDS), zoals liposomen, te vergemakkelijken voorafgaand aan uitgebreide kwantificering van de DDS en de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen. Liposomen zijn aantrekkelijk vanwege hun flexibiliteit bij het afstemmen van hun fysisch-chemische en biofysische eigenschappen5,6,7,8,9,10,11 om een grote verscheidenheid aan therapeutische lading in te kapselen en de weefselplaats van medicijnafgifte en werkingsduur te beheersen. Liposomen zijn gebruikt in oculaire toepassingen voor de afgifte van grote moleculen, zoals het monoklonale antilichaam bevacizumab12, en kleine moleculen zoals ciclosporine13 en ganciclovir14. Geneesmiddel-geladen liposomen hebben langere biologische halfwaardetijden en langdurige therapeutische effecten in vergelijking met niet-liposomale “vrije drug” formuleringen. De distributie van geneesmiddelen in oogweefsel wordt echter meestal geëxtrapoleerd uit geneesmiddelconcentraties in vloeibare componenten van het oog (d.w.z. bloed, waterige humor en glasvochthumor15,16,17). Aangezien het initiële in vivo lot van de geladen medicijnlading wordt bepaald door de eigenschappen van de nanodrager zelf, kan CLM-beeldvorming van de fluorescerende liposomen dienen als een surrogaat voor het medicijn om weefseltargeting en in situ weefselresidentietijden te onthullen. Bovendien kan visueel bewijs van toediening met CLM het herontwerp van DDS sturen, de therapeutische voordelen van het medicijn evalueren en misschien zelfs nadelige biologische gebeurtenissen voorspellen (bijv. Weefseltoxiciteit als gevolg van ongewenste lokalisatie van DDS gedurende langere tijd).
Hierin wordt een stapsgewijze procedure beschreven over het bestuderen van de oculaire biodistributie van liposomen in levende muizen met een dual-band CLM-systeem. Dit specifieke CLM-systeem kan tweekleurenfluorescentie (met groene en rode excitatielasers bij 488 nm en 660 nm) in realtime detecteren, met een frequentie van 8 frames / s. Door de detectiesonde fysiek op het oog te plaatsen, demonstreert het protocol beeldacquisitie en analyse van groen-fluorescerende liposomen bij subconjunctivale toediening bij muizen die intraveneus (IV) worden geïnjecteerd met 2% Evans Blue (EB) kleurstof. EB-kleurstof helpt bij het visualiseren van de gevasculariseerde structuren in het rode fluorescentiekanaal. We tonen representatieve resultaten van een studie ter beoordeling van 100 nm neutrale liposomen bestaande uit het fosfolipide POPC (d.w.z. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine) en gedopeerd met fluoresceïne-gelabeld fosfolipide Fl-DHPE (d.w.z. N-(fluoresceïne-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-fosfoethanolamine) in een verhouding van 95% POPC: 5% Fl-DHPE (figuur 1B ). CLM is in staat om de groene fluoresceïne-gelabelde liposomen te vangen bij 15 μm axiale en 3,30 μm laterale resolutie door afbakening van EB-gekleurde oculaire weefselgrenzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals blijkt uit de resultaten, biedt CLM een eenvoudige en haalbare methode om de oculaire verdeling van liposomen in het oog in beeld te brengen. We hebben eerder het gebruik van CLM aangetoond om de lokalisatie van verschillende liposomale formuleringen in het muisoog in de loop van de tijd te karakteriseren1. Voor niet-invasieve toepassingen maakt CLM real-time beeldvorming van het voorste oculaire oppervlak mogelijk voor inzichten in hoe liposomen in het oog worden verdeeld van hetzelfde dier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) subsidie toegekend (aan SV) en gedeeltelijk door Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013/2 en Singapore’s Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) subsidie H18/01/a0/018 beheerd door het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (A * STAR) (aan AMC). Met dank aan leden van Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) voor het faciliteren van de logistiek en uitvoering van de studies en training op apparatuur. Speciale dank aan mevrouw Wisna Novera voor haar redactionele hulp.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
