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方法論記事

微小重力下での歯科および呼吸器細胞および臓器の増殖

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DOI:

10.3791/62690

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2021年5月25日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Craniofacial Research and Diagnosis, Texas A&M College of Dentistry, 2Department of Stomatology, The Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, 3Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Insititute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、微小重力下でのアメロブラスト様細胞の培養と3D増殖を行い、細長い偏光形状とエナメル質特異的タンパク質発現を維持する方法を提示します。微小重力下での歯周工学コンストラクトや肺器官の培養のための培養条件についても記載する。

要約

重力は、ヒトの細胞機能、増殖、細胞骨格構造および配向の重要な決定要因の1つです。ロータリーバイオリアクターシステム(RCCS)は、宇宙で発生する重力の損失を模倣し、代わりに培養細胞または組織の連続的な回転によって微小重力環境を提供します。これらのRCCSは、栄養素、成長および転写因子、および酸素の途切れのない供給を保証し、動かない2D(2次元)細胞または臓器培養皿における重力の欠点のいくつかに対処します。本研究では、RCCSを用いて頸部ループ細胞と歯髄細胞を共培養してアメロブラストにし、歯周前駆細胞と足場の相互作用を特徴づけ、肺胞に対する炎症の影響を決定しました。RCCS環境は、アメロブラスト様細胞の増殖を促進し、足場コーティングに応答して歯周前駆細胞の増殖を促進し、培養肺胞に対する炎症変化の影響の評価を可能にしました。この原稿は、環境条件、材料、および途中の手順を要約し、重要な側面と実験の詳細を強調しています。結論として、RCCSは、 in vitroでの 細胞の培養と3D(3次元)増殖を習得し、従来の2D培養環境には適さない細胞システムまたは相互作用の研究を可能にする革新的なツールです。

概要

重力は、個々の細胞の生物学や生物内でのそれらの機能など、地球上の生命のあらゆる側面に影響を与えます。細胞は機械受容器を通して重力を感知し、細胞骨格構造を再構成し、細胞分裂を変化させることによって重力の変化に応答します1,2,3。微小重力の他の影響には、流体で満たされた小胞の静水圧、細胞小器官の沈降、および浮力による流れと熱の対流が含まれます4。人間の細胞や臓器に対する重力の喪失の影響に関する研究は、もともと宇宙飛行ミッション中に宇宙飛行士の無重力環境をシミュレートするために行われました5。しかし、近年、微小重力をシミュレートするためにNASAによって最初に開発されたこれらの3Dバイオリアクター技術は、他の方法では2D培養システムには適さない細胞集団の培養のための新しいアプローチとしてますます関連性が高まっています。

3Dバイオリアクターは、浮遊状態で細胞を成長させることによって微小重力をシミュレートし、一定の「自由落下」効果を生み出します。回転バイオリアクターの他の利点には、臓器培養システムで遭遇する空気曝露の欠如、せん断応力と乱流の減少、および変化する栄養素の供給への継続的な曝露が含まれます。ロータリー細胞培養システム(RCCS)バイオリアクターによって提供されるこれらの動的条件は、単一細胞の凝集体への空間共局在および三次元アセンブリに有利に働く6,7。

これまでの研究では、骨再生8、歯胚培養9、およびヒト歯包細胞の培養10に対する回転式バイオリアクターの利点が実証されています。RCCSがEOE細胞の増殖とアメロブラストへの分化を促進することを示唆する報告もあります11。しかし、分化した細胞は、アメロブラスチン免疫蛍光および/またはアメロゲニン発現のみに基づいてアメロブラストと見なされました11 、その細長い形態や分極した細胞形状は考慮されていませんでした。

NASAが開発した回転壁船(RWV)バイオリアクターに加えて、細胞から3D凝集体を生成する他の技術には、磁気浮上、ランダム位置決め機(RPM)、およびクリノスタット12が含まれます。磁気浮上を達成するために、磁性ナノ粒子で標識された細胞は、外部磁力を用いて浮上され、その結果、脂肪細胞構造のバイオファブリケーションに使用されてきた足場のない3D構造が形成される13、14、15。微小重力をシミュレートする別のアプローチは、2つの軸を中心とした同時回転を制御することにより、多方向のG力を生成し、クリノスタット16と呼ばれる装置の中心での累積重力ベクトルをキャンセルすることです。骨髄幹細胞をクリノスタットで培養すると、骨芽細胞分化の抑制を通じて新たな骨形成が抑制され、微小重力の脱分化効果の1つが示されています16。

アメロブラストの忠実な培養を促進するためのin vitroシステムは、歯のエナメル質組織工学17に向けて大きな前進をもたらすでしょう。残念ながら、今日まで、アメロブラストの文化は挑戦的な事業でした18,19。これまでに、マウスアメロブラスト系譜細胞株(ALC)、ラット歯科上皮細胞株(HAT-7)、マウスLS8細胞株20、ブタPABSo-E細胞株21およびラットSF2-24細胞株22を含む5つの異なるアメロブラスト様細胞株が報告されている。しかし、これらの細胞の大部分は、2D培養で独特の分極細胞形状を失っています。

本研究では、間葉系前駆細胞と共培養した子宮頸管ループ上皮からのアメロブラスト様細胞の増殖を促進し、栄養素の流れの減少や重力による細胞骨格の変化など、2D培養システムの課題を克服するために、回転細胞培養バイオリアクターシステム(RCCS)に目を向けました。さらに、RCCSは、歯周組織工学に関連する細胞/足場相互作用の研究、およびin vitroでの肺胞組織に対する炎症メディエーターの影響を調べるための新しい手段を提供しました。これらの研究の結果は、分化した上皮の増殖、および細胞/足場の相互作用や炎症状態に対する組織反応など、 in vitroで増殖した細胞に対する環境影響の評価に対する微小重力ベースの回転培養システムの利点を強調しています。

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プロトコル

研究がTAMU施設の動物管理ガイドラインに準拠していることを確認するために必要なすべての機関承認が得られました。

1.バイオリアクターの組み立てと滅菌

  1. バイオリアクター用の4つの高アスペクト比容器(HARV)を、メーカーの推奨に従って、プラスチック機器サイクルのオートクレーブで121°Cで20分間滅菌します。
  2. 滅菌後、バイオリアクターに付属のネジを締めて細胞培養フード内で容器を組み立て、容器を使用できるようになります。

2. バイオリアクター共培養実験に用いた足場

  1. 足場を細胞と一緒にインキュベートして、さらなる成長に必要な細胞接着をサポートします。
  2. 共培養研究用のPGAベースの足場、ハイドロキシアパタイト足場、グラフェンシート、ゼラチンディスク、コラーゲンベースの足場からお選びください。

3. 子宮頸管ループ(CL)解離とシングルセル調製

  1. CO2過剰摂取による呼吸停止後の断頭によってマウスを屠殺する。
    注:すべての動物実験は、TAMU施設の動物管理ガイドラインに準拠しています。
  2. 以前に公開されたプロトコル23の修正バージョンに従って、生後6日目(DPN)マウスから頸部ループを解剖します。
    注:私たちの研究では、以前に公開されたプロトコルには示されていない頸部ループの遠位部分が含まれています(図3)。
    1. 解剖した組織を冷滅菌PBSで洗浄してから、コラゲナーゼディスパーゼで37°Cで30分間消化します。
  3. 溶液を70 μmの滅菌セルストレーナーに通し、さらに800 x g で10分間遠心分離します。
  4. 上澄み液を捨てる。ペレットを遠心分離し、800 x gの冷たいPBSで2回洗浄します。上澄み液を捨てる。
  5. 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、血管あたり1 X 105 細胞を追加します。

4. 歯髄細胞培養と細胞株拡大

  1. 100mm組織培養プレート中の歯髄細胞を継代4で1×10の濃度で5で平板化する。
  2. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%抗生物質/抗真菌剤(P/S)を添加したDMEM高グルコース培地からなる培養用培地を調製します。
  3. 細胞が85〜90%のコンフルエントに達したら、培地を吸引し、予熱したPBSでプレートを2回洗浄します。
  4. PBS洗浄後、予め温めた0.25%トリプシン-EDTA溶液をプレートに加え、歯髄細胞含有プレートを37°Cで3分間インキュベートします。
  5. 顕微鏡による目視検査により細胞剥離を確認します。
  6. 培養プレートから細胞とともに培地を回収し、25 mLピペットを介して50 mL滅菌コニカルチューブに移します。
  7. 細胞を800 x g で8分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を新鮮な培地に再懸濁し、血球計算盤を使用してカウントします。
  8. 頸部ループ細胞との共培養では、歯髄細胞をバイオリアクターに1容器あたり1 x 104 の濃度で播種します。

5. RCCSバイオリアクター内の足場上での頸部ループ/歯髄細胞の共培養

  1. 細胞型、頸部ループ、歯髄の両方を、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質、足場を補充したケラチノサイトSFM培地を含む培養培地に追加します。
    注:成長因子は、0.03 μg/mLの骨形成タンパク質2(BMP 2)、0.03 μg/mLの骨形成タンパク質4(BMP-4)、10 ng/mLのヒト組換え線維芽細胞増殖因子(hFGF)および15 ng/mLの上皮成長因子(hEGF)の濃度で添加され、ECM成分には200 μg/mLのマトリゲル、5 μg/mLのラミニン、5 μg/mLのフィブロネクチンが含まれていました。
  2. 1 mgのLLAP(ロイシンリッチアメロゲニンペプチド)ペプチド、ブタの歯24から調製した1 mgの凍結乾燥初期段階エナメルマトリックス、5 μg/mLのラミニン、および5 μg/mLのフィブロネクチンで強化された500 μLのコラーゲンゲルの混合物で足場をコーティングします。
    注:これは私たちの実験に最適でした。
  3. 足場コーティングに続いて、細胞と足場の両方をバイオリアクターに追加し、バイオリアクターに容器あたり10 mLの培地を充填します。
  4. 培地、細胞、および足場を追加した後、バイオリアクター容器の充填ポートキャップを閉じます。
  5. 実験の開始時に滅菌バルブをシリンジポートに取り付け、実験が終了するまでカバーで所定の位置に保ちます。
  6. 容器が90%いっぱいになり、充填ポートキャップを閉じて締めたら、滅菌バルブを開きます。
  7. 培地交換が必要になるたびに、2本の滅菌シリンジ(3 mL)を使用してください。一方のシリンジに新しい培地を入れ、もう一方のシリンジを空のままにします。
  8. 両方のシリンジバルブを開き、空のシリンジポートに向かって泡をそっと操作します。
  9. フルシリンジからの新鮮な培地が容器に注意深く注入されたら、空のシリンジポートから気泡を取り除きます。
    注意: この手順は、すべてのマイクロバブルが血管から除去されるまで実行されます。
  10. シリンジポートをキャップで閉じ、シリンジを鋭利な廃棄物容器に廃棄します。
  11. 各容器を回転子ベースに取り付け、回転子ベースを5%CO2 および37°Cの温度のインキュベーターに入れます。
  12. 電源を入れ、回転数を10.1rpmに設定します。
    注意: 速度を調整して、足場が容器の壁に触れずに吊り下げられるようにします。
  13. 培地を交換するには、血管を直立位置に置き、細胞が底部に定着するようにします。シリンジポートを開き、滅菌シリンジをポートに接続します。
  14. 同じ手順に従って、栄養が枯渇した培地の75%を吸引し、もう一方のポートから新しい培地を注入します。

6.肺臓器調製およびバイオリアクターベースの培養

注:E15野生型マウスの子犬は、肺器官の準備に使用されました。

  1. 妊娠中の雌マウスをCO2 窒息で安楽死させた後、肺組織を解剖する。
    1. 頸部脱臼による窒息後に死亡が確認されたら、メスを使用して胸腔を露出させます。その後、子犬を子宮から取り出し、斬首して安楽死させます。
  2. 安楽死させた後、胸腔を開いて肺の位置を特定します。肺組織の小さな部分を滅菌PBSで洗浄し、5%CO2 および37°Cの温度を含むインキュベーター内の臓器培養培地で2時間滅菌済みメンブレンに置きます。
  3. 肺組織が2D臓器培養プレートの膜に付着したら、サンプルをバイオリアクター容器に移します。
  4. 培養用の培地を準備します。
    注:コントロールDMEM高グルコース培地には、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%抗生物質溶液(P / S)(ペニシリン、100 U / mL、ストレプトマイシン、50 μg / mL)および100 μg / mLアスコルビン酸(AA)が含まれており、炎症状態の誘発のために、コントロール培地には5 ng / mLのIL-6タンパク質が補充されています。
  5. 上記のようにバイオリアクターで48時間毎に培地交換を行い10日間の肺培養実験を実施する。

7.ヒト歯周靭帯(hPDL)細胞培養によるコーティングされた足場

  1. ヒト歯周靭帯細胞を培養する。
    注:細胞は、以前に公開されたプロトコルに従って、ラボで単離および培養されます25。
  2. コラーゲン足場ディスクを対照群用の30 μLのPBSと神経ペプチドガラニン(GAL)で10〜8 の濃度で一晩コーティングします。
  3. コントロールおよびGALコーティングされた足場材上にヒトPDL細胞を培養プレートに播種し、細胞播種した足場を上記のようにバイオリアクター容器に移した。
  4. 細胞播種したスキャフォールドをバイオリアクターで14日間培養してから、分析のためにスキャフォールドを回収します。

8.バイオリアクターの洗浄とメンテナンス

  1. バイオリアクターから足場/細胞を回収した後、シリンジポートを容器から取り外します。
    注意: 容器の周りのネジを外し、容器を石鹸水でやさしく洗います。
  2. 容器をきれいな水ですすぎ、もう一度ネジを締めます。
  3. オートクレーブ処理後、次の使用まで容器を保管してください。

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結果

バイオリアクターの内部チャンバーは、細胞が増殖および分化したり、足場に付着したり、集まって組織のような集合体を形成するための環境を提供します。各HARV容器は最大10 mLの培地を保持し、栄養素の一定の循環を促進するため、各細胞は生き残る絶好の機会を得ることができます。図1Aは、滅菌ワンストップバルブが取り付けられている容器の前面プレートへのシリンジポートの取り付けを示しています。これらのバルブは、培養室へのドアキーパーとして機能します。培地交換では、新鮮な培地を含む滅菌シリンジの取り付けを容易にするために、ストップコックバルブを開く必要があります。バイオリアクター内の微小重力環境により、細胞は足場への事前の播種を必要とせずに容器内の足場に付着することができます。バイオリアクターに配置された足場(図1Bおよび1C)は連続的に回転し、細胞が足場表面に付着して細胞骨格ネットワークを形成することを可能にします。容器プレートの底部にある酸素発生器膜(図...

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ディスカッション

微小重力下での細胞の増殖のためのプロトコルの重要なステップには、バイオリアクター、足場、3D培養に使用される細胞、および細胞分化を誘導する手段としての足場コーティングが含まれます。私たちの研究で使用されるバイオリアクターのタイプは、シミュレートされた微小重力で細胞を成長させるためにNASAによって開発された元の回転細胞培養システム(RCCS)回転円筒組織培養装置の最近の変更であるRCCS-4バイオリアクターで構成されています。このRCCS-4環境は、非常に低いせん断応力を提供し、物質移動を促進し、培養性能を向上させます。このバージョンのバイオリアクターは、同時に4つの異なる実験のために4つの容器を同時に使用することを可能にした。RCCS-4バイオリアクターには高アスペクト比(HARV)容器が装備されており、研究に十分な数の細胞でシンプルで簡単な培養条件が保証されました。

私たちのアプローチの2番目の重要な要素は、フローティングセルがアセンブリをアタッチして形成するためのテンプレートを提供するための足場です。2D培養における足場の使用は壊死コアの形成のために制限されているが、回転バイ...

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開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

研究は、国立歯科頭蓋顔面研究所(UG3-DE028869およびR01-DE027930)からの助成金によって寛大に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗生物質-抗真菌剤サーモフィッシャー サイエントフィック15240096
アスコルビン酸シグマ アルドリッチA4544
BGJb フィットン・ジャクソン モディフィケーションメディアサーモフィッシャー サイエントフィック12591
BIOST PGA 足場シンセコンカスタムカスタムオーダーで会社から入手可能
BMP-2R&Dシステムズ355-BMBM-4
R&D Systems314-BP
DMEM MediaSigma AldrichD6429-500mL
FBSThermoFisher Scientfic16140071
FibricolAdvanced Biomatrix5133-20mL
FibronectinCorning 354008
GalaninSigmaAldrich G-0278
ゼラチンディスクAdvancedBiomatrixCytoForm 500
グラフェンシートAdvanced BiomatrixCytoForm 300
hEGFPeprotechAF-100-15
hFGFThermoFisher ScientficAA1-155
Hydroxyapatite discAdvanced BiomatrixCytoForm 200
Il-6 proteinPeproTech200-06
ケラチノサイト SFM 培地 (1X)ThermoFisher Scientfic17005042
LamininCorning354259
LRAP ペプチドペプチド 2.0カスタムメイド配列: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT
PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL
PLEAWPATDKTKREEVD
マトリゲルコーニング354234
ミリポア ニトロセルロース メンブレンメルク ミリポア
AABP04700 RCCS バイオリアクターSyntheconRCCS 4HD
SpongeColAdvanced Biomatrix5135-25EA
シリングバルブ 一方向ストップコック スイベルオス ルアーロック付きスミスメディカルMX5-61L
注射器 針付き 3ccMcKESSON16-SN3C211
トリプシン EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientfic
25200056

参考文献

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