Summary
该协议介绍了简化全身体积描记仪的构建和使用，以非侵入性地监测细菌性呼吸道疾病的进展。
Abstract
疾病的替代动物模型受负责任研究的3R约束。人们经常重新审视对动物模型的改进，以确保动物福利和科学见解随着新技术的可用性而进步。本文演示了使用简化全身体积描记术（sWBP）在致命性呼吸类鼻疽模型中非侵入性研究呼吸衰竭。sWBP具有在整个疾病过程中检测小鼠呼吸的灵敏度，允许测量垂死的相关症状（呼吸过缓和低通气），并可能用于制定人道终点标准。
sWBP在呼吸系统疾病背景下的一些好处是，在评估原发性感染组织（即肺）的功能障碍方面，宿主呼吸监测是最接近任何生理测量的。除了生物学意义外，sWBP的使用是快速和非侵入性的，最大限度地减少研究动物的压力。这项工作证明了使用内部sWBP设备在呼吸类鼻疽小鼠模型中的整个呼吸衰竭过程中监测疾病。
Introduction
呼吸道细菌病原体通常与肺部炎症反应有关，导致肺部病理学1，2。在临床情况下，肺炎的诊断通常包括痰培养技术、血氧饱和度分析和胸部 X 线检查。这些技术可以转化为小动物感染模型，但只有氧饱和度分析才能代表小鼠疾病严重程度的快速、实时分析。血氧饱和度（SpO2）先前在呼吸系统疾病研究中被研究为跟踪疾病进展的方法;然而，垂死小鼠在 铜绿假单胞 菌模型3中都具有出乎意料的高SpO2读数，这不是预测或垂死的疾病，可能是因为小鼠可以调节其生理活动。为此，到目前为止，在小鼠中没有发现细菌性呼吸道疾病的SpO2诊断水平。
因此，这项工作调查了使用其他临床相关方法来检测肺部疾病对肺功能的影响作为快速生理测量。简化的全身体积描记术（sWBP）提供了研究呼吸频率和深度的机会，作为一种快速、非侵入性的生物特征分析。以前的研究已经证明了如何在实验室中组装WBP设备4;然而，这些研究中显示的一些成分目前尚未商业化。此外，传统的WBP需要复杂的数据收集和基于湿度和温度的数据处理5，6。因此，决定开发一种简化的WBP设备，每天校准到室温/湿度，并评估受试者本身的温度/湿度贡献是否对测量的呼吸量有任何影响。因此，已经创建了一个改进的sWBP设备，该设备可以获取当前可用的材料。此外，已经研究了这种实验室来源的装置是否可以检测在小鼠致命呼吸类鼻疽模型期间与疾病进展相关的呼吸变化。
为这项工作构建的sWBP设备使用市售设备和软件将模拟压力传感器数据处理成数字读数。压力传感器安装在带有隔板连接器的密封玻璃罐上。玻璃罐的好处是材料的结构刚度，它将抵抗罐子内部压力的变化，影响呼吸监测期间体积变化的测量。取样室设计为在方形罐子的两个平面上有两个端口，一个通过鲁尔连接器进入腔室进行校准，另一个用于容纳压力传感器。所选压力传感器具有高度灵敏的表压传感器，其范围为压力的微小变化（25 mbar范围）。
使用呼吸道类鼻疽的小鼠模型演示该协议。 伯克霍尔德氏菌 （Bp）是类鼻疽的细菌病原体 - 一种与世界热带地区相关的疾病7。Bp存在于环境中，特别是在积水和潮湿土壤的潮湿环境中，它通常会导致易感宿主割伤/划伤的皮下感染。然而，Bp在吸入时也具有传染性，并且是通过气溶胶传播用于生物恐怖主义的潜在威胁。虽然完全毒力的 Bp 需要在 BSL-3 实验室进行处理，但之前设计了一种无肩突变菌株，可以在 BSL-2 中安全处理，并排除在选择药物标准8 之外。此外，已经开发了插管介导的呼吸道类鼻疽气管内（IMIT）感染模型，以研究Bp5，9的呼吸系统疾病进展。我们已经使用这种感染模型来表征疾病进展过程中通过垂死终点发生的呼吸变化。
Protocol
此处描述的程序由路易斯维尔大学机构生物安全委员会（协议#14-038）和机构动物护理和使用委员会（协议#19567）审查和批准。
1. 取样室的组装
- 在 600 mL 方形玻璃宽口梅森罐的平坦表面上使用 3/4“ 金刚石钻头在 600 mL 方形玻璃宽口梅森罐头的平坦表面上创建两个孔，该罐带有 95 mm 垫圈和气密盖，带有扣环和扳机夹盖（图 1）。
注意：取样室不是市售的，必须建造。 - 在隔板和玻璃接触的两面上使用橡胶垫圈（3/4“ 内径，1” 外径）将黄铜隔板（1/4“ NPT 内螺纹，3/4-16 UNF 外螺纹）通过梅森罐的两个孔组装，以确保气密密封。
- 使用一个隔板组件作为压力传感器，同时通过鲁尔连接的注射器连接另一个隔板以进行校准。
- 对于压力传感器，用特氟龙胶带包裹高性能表压传感器的 1/4“ NPT 螺纹，并将它们拧入隔板。使用烙铁将压力传感器接线连接到 8 针公头 DIN 连接器，使用制造商接线说明与市售的高质量数据采集设备接口（参见 材料表）。
注意： 这需要在 DIN 连接器接线中使用 150 K 欧姆 1/8 瓦 1% 金属膜电阻器。 - 对于校准端口，请使用 1/4“ NPT 外螺纹至 1/8” NPT 母头适配器将 1/8“ 外螺纹 NPT 连接到母头鲁尔锁镀镍连接器，以特氟龙胶带包裹螺纹连接。不使用时，使用聚丙烯螺纹公鲁尔帽密封鲁尔连接器。
注意：请勿将隔板连接器过度拧到玻璃罐上，因为这会产生裂缝。如果需要，可以将硅胶添加到橡胶垫圈中，以确保隔板与玻璃罐的气密密封。
- 对于压力传感器，用特氟龙胶带包裹高性能表压传感器的 1/4“ NPT 螺纹，并将它们拧入隔板。使用烙铁将压力传感器接线连接到 8 针公头 DIN 连接器，使用制造商接线说明与市售的高质量数据采集设备接口（参见 材料表）。
2. 系统设置
- 按照制造商的说明，使用 8 针 DIN 连接器将采样室连接到桥式放大器，将桥式放大器连接到数据采集设备。
- 使用制造商的电缆将数据采集设备连接到电源和运行生理数据分析软件的计算机。
注意：确保数据采集设备在使用前通电并预热至少5分钟，以确保传感器稳定其测量。 - 启动软件以与数据采集系统接口。
- 下载软件中可选的肺活量计模块，并在肺活量计>设置窗口中将默认单位设置从 L/s 修改为 μL/s。
3. 系统校准
- 在软件中，创建一个具有以下数据窗口的 4 通道窗口： 通道 1： 采样率为 4 k/s 和 1 mV 范围的源数据;通道2：通道1的数字滤波器，使用高通 1 Hz自动调节 滤波器;通道 3：通过对 100 个样本求平均值来 平滑 通道 2 数据;通道 4：通道 3 数据的 肺活量测定流程 （自定义流头，校准公式 （μL/s） = 120，000 x 电压）。
注意：120，000 是占位符相关系数，将在校准期间修改。 - 使用以下列设置通道 4 的 DataPad 分析：第 1 列： 通道 4 数据、注释>完整注释文本;第 2 列：通道 4 数据，循环 测量>平均循环频率;第 3 列：通道 4 数据，循环 测量>平均循环高度。
- 将图表显示右下角的帧速率设置为 100：1。将此窗口配置保存为所有未来算例的模板。
- 关闭样品室盖，将 25 μL 气密注射器连接到 Luer 隔板连接器。将注射器与 Chaney 适配器安装，以重复提供 20 μL 的体积。
注意：可选的短管1/16“管和鲁尔/倒钩连接器可用于将注射器连接到样品室。但是，应避免使用长管，以避免样品室的总风量发生重大变化。 - 使用 Chaney 适配器的深度停止将 20 μL 空气吸入注射器。
- 将软件中的全音调零（设置>将所有输入归零（Alt-Z））并开始录制。
- 在记录时，以稳定的基线快速按下/撤回注射器柱塞约 10 次重复，以以测量的 20 μL 呼吸复制受试者呼吸。停止录制。
注意：人工呼吸的频率应超过2 Hz，以最大限度地提高校准的可重复性。 - 通过右键单击编号的pleth记录的开头并单击 添加注释来标记测量样品的身份。
- 重置 注射器，将输入 归零 ，并重复两次 20 μL 脉冲的记录测量（总共三次记录）。
- 完成所有测量后，使用计算机鼠标选择准确代表人工 20 μL 呼吸的呼吸褶皱部分。
注意：在 DataPad 模块中，数据将显示在预览标题中，提供呼吸频率（平均循环频率，Hz）和呼吸深度（平均循环高度，μL）的临时读数。可以使用“添加到数据板”图标将数据预览记录到 数据板 中。 - 查看第 3 列数据（平均循环高度），并计算三个记录中测量的平均呼吸量。对平均测量的呼吸量执行以下计算：校准系数 = 输送量 / 测量量 x 120，000。
注意：120，000是步骤3.1中使用的占位符流头校准系数，现在根据测量数据修改。该系统现在使用当前环境温度和湿度校准为典型的小鼠呼吸。该系统现在可以监测受试者的呼吸，并且可以每天重新执行校准，以考虑温度/湿度的任何波动。
4. 受试者监测
- 按照步骤 3.4 中所述打开主模板，或完成步骤 4.2 到 4.3。
- 在软件中，创建一个具有以下数据处理的 4 通道窗口： 通道 1： 采样率为 4 k/s 和 1 mV 范围的源数据;通道 2：通道 1 的数字滤波器，使用高通 1 Hz 自动调整滤波器;通道 3：通过平均 100 个样本对通道 2 数据 进行平滑处理 ;通道 4：通道 3 数据的 肺活量 测定流程（自定义流头，校准公式 （μL/s） = 120，000 x 电压）。
注意：120，000是当前压力传感器计算的相关系数;但是，用户应执行步骤3中描述的系统校准，并改用此用户定义的相关系数。 - 使用以下列设置通道 4 的 DataPad 分析：第 1 列： 通道 4 数据、注释>完整注释文本;第 2 列：通道 4 数据，循环 测量>平均循环频率;第 3 列：通道 4 数据，循环 测量>平均循环高度。
- 将受试者放入采样室并盖上盖子。对于该实验，使用有意识的4-12周雌性白化C57BL / 6J小鼠（B6（Cg）-Tyrc-2J / J）。
- 通过短暂松开Luer隔板盖并重新拧紧来平衡腔室中的大气压力（通过密封盖子）。
- 在将所有输入归零（Alt-Z 快捷方式）并开始记录之前，观察受试者在采样室内没有主动移动。
注意：如果受试者开始在采样室中移动，基线可能会移离刻度，这可以通过在记录中间重新归零所有输入来解决，这将在刻度上创建一个新的记录。假设受试者在录音过程中进行探索或梳理;注意体积描记法记录的哪一部分最能准确反映正常呼吸。 - 通过右键单击编号的pleth记录的开头来标记主题的身份，然后单击 添加评论。
- 将受试者放回笼子。将密封采样室中花费的时间限制在5分钟，以避免窒息和压力。
注意：窒息的风险很低，因为健康的小鼠不会以 <15 mL/min 的速度快速消耗样品室的 600 mL 空气量。 - 使用计算机鼠标选择准确表示受试者呼吸的呼吸褶皱部分。
注意：在 DataPad 模块中，数据将显示在预览标题中，提供呼吸频率（平均循环频率，Hz）和呼吸量（平均循环高度，μL）的临时读数。可以使用“添加到数据板”图标将数据预览记录到 数据板 中。 - 继续一次测量一只受试者小鼠，并将呼吸褶皱的代表性部分记录到DataPad。
- 数据记录后，将数据板数据导出到Excel。按如下方式计算分钟体积：分钟体积 （mL/min） = 呼吸频率 （Hz） x 呼吸量 （μl） x 0.06。
Representative Results
系统校准
数据分析软件允许直接校准自定义流头，例如本文描述的流头。这是在设置肺活量流量时执行的。如步骤3.1中所述，存在输入已知校准风量的选项，该选项计算系统内的电压与体积相关系数。然而，这会产生基于单次读数的相关系数，并且已经观察到n = 1标准校准的固有变化具有较差的效用。目前的方法可以解决这一缺点，并允许用户使用多个读数平均来计算校准系数来执行每日校准。本文演示了用20 μL注入空气进行校准，代表了典型小鼠的典型高端呼吸量。该软件假设原点截距（0，0），因此使用这种方法在0-20 μL范围内进行校准。
这里提出的sWBP方法每天校准，从而考虑环境湿度/温度的任何波动。用于特定WBP的原始方法可以追溯到1955年Drorbaugh和Fenn的方法，他们开发了用于测量人类婴儿通气的WBP5。Drorbaugh和Fenn的计算考虑了环境和主题的温度和湿度的变化。目前的方法通过校准每个sWBP会话来校正环境波动。尽管如此，还是决定解决小鼠鼻腔/肺呼吸的加热和加湿是否会影响已知空气量的测量。因此，创建了一个人工设备来模拟受试者对加热和加湿校准空气测量的影响。将Luer连接器连接到15 mL锥形管上，并将该密封锥形在线放置在样品室和气密校准注射器之间。使用在室温（23°C）下保持的空锥形管进行20 μL校准。然后将锥形管部分填充蒸馏水到鲁尔连接器的正下方，从而有时间平衡锥形的顶部空间;然后重新测量校准体积以研究湿度的影响。将锥形管置于加热块中，在潮湿环境中在37°C下平衡，最后在无水的情况下平衡至37°C，以评估受试者加热的效果，并且没有额外的湿度贡献。 图2 显示，所有测试条件均未显著影响气密注射器提供的校准20 μL测量结果。从这一发现中得出的结论是，sWBP提供了一种监测研究动物呼吸的可访问方法，而无需根据动物受试者的温度和湿度进行复杂的计算，因为这些计算对测量的呼吸量没有显着影响。
受试者监测
sWBP用于监测细菌病原体B . pseudomallei致命呼吸道感染期间的呼吸。监测有意识动物呼吸的一个挑战是对样品室内移动的正常健康动物的好奇心。鼠标的移动创造了一个不断移动的基线，可以通过在测量前几天对腔室进行预处理来部分缓解。这个问题主要影响健康小鼠的基线测量，因为受试者在感染期间变得昏昏欲睡，使sWBP更容易管理，受试者活动减少。尝试使用某种形式的约束可能很诱人，无论是物理上的还是麻醉上的。使用身体约束可能会通过引起压力来影响自然呼吸。此外，已知麻醉剂的使用对呼吸频率和深度有显着影响10;因此，决定使用内部sWBP设备研究麻醉的影响。异氟醚通常用于在感染模型期间进行 体内 诊断成像，因此，使用sWBP麻醉C57BL / 6小鼠并监测进展直至从麻醉中恢复。该试验是用幼年4周龄白化C57BL / 6J小鼠进行的，以延长麻醉恢复窗口。 图3 表明，优选的麻醉剂使小鼠在大量潮气量下表现出缓慢的呼吸频率。当小鼠开始从镇静中恢复时，它们的呼吸频率增加，呼吸量减少，净效应是总吸入空气缓慢增加。在该试验中，发现呼吸量在恢复的前 30 秒内恢复到麻醉前水平。呼吸频率稳步增加，直到基线呼吸恢复到从麻醉中取出后2-2.5分钟。分钟体积紧随呼吸频率的影响，在从麻醉中取出后2.5分钟达到基线分钟体积。这一发现支持sWBP方法不应使用麻醉。它极大地影响基线呼吸，这并不奇怪，因为麻醉会减慢宿主的新陈代谢，从而减少对吸入氧气的需求。还应考虑受试者之间样本室的卫生问题，以解决研究特定的感染控制以及尿液或粪便中可能影响受试者之间压力的信息素的影响。
WBP 是一种有吸引力的策略，用于以非侵入性方式监测呼吸系统疾病模型中的肺功能。sWBP用于研究致命性呼吸道类鼻疽感染期间呼吸如何变化（图4），时间点反映了肺部的生物发光监测。据观察，该模型与嗜睡的早期发作有关，嗜睡以缓慢进行的方式持续存在，直到感染后约3天发生垂死的疾病。还观察到小鼠的呼吸频率和总吸入空气（分钟体积）在感染的第一天迅速下降，并且在感染过程的剩余时间内保持低水平（图4A，C）。这种模式与早发性嗜睡一致，早发性嗜睡持续感染的接下来 2 天。相比之下，呼吸量在前24小时内不会急剧下降，而是有轻微而稳定的下降，这在疾病的3天过程中接近线性下降（图4B）。
图 1：sWBP 设备。 定制的样品室由可密封的方形玻璃罐构成，两个平面上有隔板连接器。一个隔板用于安装表压传感器，通过 8 针 DIN 连接 连接到 桥式放大器和数据采集设备数字化仪。第二个隔板装有鲁尔连接器，用于通过气密注射器进行校准。设备已连接到运行该软件的 PC。 请点击此处查看此图的大图。
图2：受试者温度和湿度对呼吸量的影响。 在 20 μL 校准注射器和样品室之间在线安装了带有 Luer 连接器的 15 mL 锥形管。将系统校准至20 μL，锥形管没有额外的温度/湿度贡献。在平衡后收集其他测量值，用蒸馏水的饱和湿度和/或锥形管从室温（23°C）加热到体温（37°C）。通过单因素方差分析与Tukey的多重比较后检验，从每个条件的n = 5次测量中未检测到显着差异。 请点击此处查看此图的大图。
图3：气体麻醉对小鼠呼吸的影响。将来自4周龄雌性白化C57BL / 6J小鼠（8.6g）的代表性数据用3%异氟醚在氧气中镇静5分钟并转移到sWBP样品室中。从麻醉中取出后收集PLITH数据150 s。受试者在从麻醉中取出后 100 秒开始初始行走。（A） 麻醉前基线呼吸，测量 4.97 Hz 呼吸频率、9.74 μL 呼吸量和 2.91 mL 分钟呼吸量。（B）麻醉恢复期间呼吸变化的前60秒。（A-B）垂直轴测量每次呼吸μL，水平轴测量数秒。（中欧）在麻醉恢复的150秒期间收集通气数据，平均每个时间点的≥3个呼吸周期，包括（C）呼吸频率，（D）呼吸量和（E）计算的分钟体积。麻醉前基线值在每个相应的图表中用水平虚线表示。请点击此处查看此图的大图。
图4：呼吸类鼻疽对宿主呼吸的影响。 5只8周雌性C57BL/6小鼠感染4.9log CFU的生物发光 B. pseudomallei 菌株JW270。sWBP在整个感染的3天过程中进行，测量呼吸频率（A）和呼吸量（B）。吸入空气总量计算为分钟体积（C）。五个受试者中的每一个的数据都用三阶多项式回归独立绘制。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
sWBP是增强小动物模型中呼吸道感染理解的一种有吸引力的方法。重要的是，它是一种非侵入性方法，因此，在感染挑战期间，它不会对研究动物造成过度压力的重大风险。事实上，监测受试者呼吸的过程是一项快速测试，需要几分钟和最少的受试者处理。科学上的好处是高分辨率地了解微生物病原体在疾病期间如何影响肺功能。这种方法将为基础研究提供益处，促进对病原体如何引起疾病的理解，并提供一种转化效用，以了解一种新的治疗方法如何将研究对象恢复到呼吸系统健康状态。
在本手稿中，提供了病原体 B. pseudomallei 的代表性结果，该病原体会导致早期昏昏欲睡的反应。并非所有细菌性肺部感染在小鼠感染模型中都以相同的方式存在。以前使用其他感染模型的经验表明，细菌病原体肺炎克雷伯菌表现为无症状感染，直到小鼠屈服于感染，也是在感染后大约第3天11。据推测，宿主对吸入空气的需求（即分钟体积）可能与给定疾病出现的嗜睡程度密切相关。未来的研究将需要检查不同的细菌病原体如何影响呼吸系统疾病期间的肺功能。据了解，不同的病原体具有逃避宿主防御的独特方法，包括（1）细胞内或细胞外病原体的倾向，（2）引起早期/晚期低温反应的能力，以及（3）使用不同的毒力决定簇库3，12，13。因此，不同的疾病策略很可能会对感染期间的肺功能和呼吸产生独特的影响。
可以修改此协议中描述的推荐设置，以适应sWBP期间存在的独特挑战。在sWBP记录过程中遇到的常见问题之一是受试者在样品室内的移动。如前所述，这种运动会改变基线，并可能影响呼吸测量的准确性。使用数字滤波器对移动基线进行归一化，允许在微小移动的情况下进行可行的呼吸测量。过度移动可能会将基线测量值推出归零输入的范围。建议在1 mV范围（通道1设置）下进行记录，这样可以在仍然观察体积描记法的峰值的同时避免范围外的数据丢失。对于异常活跃的受试者，可能需要将记录范围延长>1 mV，以避免持续的超出范围信号。
推荐的程序要求每天校准（或在每个会话中）以适应环境湿度/温度波动。传统的WBP使用复杂的计算，将环境和受试者5，6的温度/湿度考虑在内。已经证明，在目前的sWBP设备中，主机温度/湿度的影响不会显着改变校准源的测量呼吸量。因此，sWBP中的这种方法与Drorbaugh和Fenn>50年前的方法根本不同。在这里，sWBP直接将压力变化与测量的呼吸量相关联，而无需主机进一步校正。
将研究动物WBP与临床WBP进行对比至关重要。sWBP尝试收集的生物特征数据类型是呼吸量和频率。这种测量值是使用简单的肺活量测定仪在临床上收集的，其中患者将呼吸监测器放在嘴边，并在监测气流的设备中正常呼吸。研究动物的类似肺活量测定需要克制，从而导致压力和呼吸的固有中断。因此，简单的肺活量测定法在临床上是有效的，但不适用于研究动物。WBP在临床中的基本目的是收集高级数据，包括残余肺容量等测量值。此类数据只能包含在受试者能够遵循有关其呼吸方式的说明的上下文中，包括强制呼气（通过深呼气排空肺部）。不能依靠研究动物遵循研究人员的呼吸指示。在WBP期间临床上收集的许多高级测量值无法在研究动物中重现。研究动物的WBP与临床WBP有根本的不同。动物WBP旨在以不受限制的方式收集简单的通气数据（呼吸频率和音量），以避免动物压力和呼吸扰动。到目前为止，在研究动物中使用WBP似乎复制了临床WBP中使用的技术，包括基于环境和受试者温度和湿度的复杂计算，但没有能力从受试者那里收集高级数据，可以遵循如何执行强制过期的说明。考虑到这一点，试图证明WBP的简化版本是否足以收集与呼吸系统疾病研究相关的呼吸频率和音量。采用校准会话，以补偿环境温度和湿度的任何变化。此外，用人造小鼠证明，将温度和湿度置于测量的呼吸量下对准确测量呼吸量没有显着影响。结论是，sWBP在研究动物研究中具有很好的应用，不需要用户对数据进行繁琐的数学处理。
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这些研究得到了美国国立卫生研究院COBRE拨款P20GM125504-01子项目8246的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
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