Summary
Detta protokoll presenterar konstruktionen och användningen av en förenklad helkroppspletysmografiapparat för att övervaka bakteriell andningssjukdomsprogression icke-invasivt.
Abstract
Surrogatdjurmodeller av sjukdom är föremål för 3R för ansvarsfull forskning. Det sker ofta en översyn av förbättringar av djurmodeller för att säkerställa att både djurskydd och vetenskapliga insikter utvecklas med tillgången till ny teknik. Denna artikel visar användningen av förenklad helkroppspletysmografi (sWBP) för att icke-invasivt studera andningssvikt i en modell av dödlig respiratorisk melioidos. sWBP har känsligheten att upptäcka andning hos möss genom hela sjukdomsförloppet, vilket gör det möjligt att mäta de döende associerade symtomen (bradypné och hypopné) och potentiellt användas för att utveckla humana slutpunktskriterier.
Några av fördelarna med sWBP i samband med andningssjukdomar är att värdandningsövervakning kommer närmast av alla fysiologiska mätningar vid bedömning av dysfunktion hos den primära infekterade vävnaden, nämligen lungan. Förutom biologisk betydelse är användningen av sWBP snabb och icke-invasiv, vilket minimerar stress hos försöksdjur. Detta arbete visar användningen av egen sWBP-apparat för att övervaka sjukdom under hela andningssvikt i murinmodellen av respiratorisk melioidos.
Introduction
Respiratoriska bakteriella patogener är ofta förknippade med ett inflammatoriskt svar i lungan som leder till lungpatologi 1,2. I den kliniska miljön inkluderar diagnos av lunginflammation vanligtvis odlingstekniker från sputum, blod-syremättnadsanalys och lungröntgen. Dessa tekniker kan översättas för smådjursinfektionsmodeller, men endast syremättnadsanalys representerar en snabb realtidsanalys hos möss för sjukdomens svårighetsgrad. Syremättnaden i blodet (SpO2) undersöktes tidigare som en metod för att spåra sjukdomsprogression i studier av luftvägssjukdomar; döende möss har dock oväntat höga SpO2-avläsningar både i en Pseudomonas aeruginosa modell3, som inte är den prediktiva eller döende sjukdomen, troligen för att möss kan modulera sin fysiologiska aktivitet. För detta ändamål hittades hittills inte diagnostiska nivåer av SpO2 för bakteriell andningssjukdom hos möss.
Därför undersökte detta arbete användningen av andra kliniskt relevanta metoder för att upptäcka effekterna av lungsjukdom på lungfunktionen som en snabb fysiologisk mätning. Simplified Whole Body Plethysmography (sWBP) erbjuder möjligheten att undersöka andningsfrekvens och djup som en snabb, icke-invasiv biometrisk analys. Tidigare studier har visat hur man monterar WBP-apparater i ett laboratorium4; Flera av de komponenter som visas i sådana studier är dock för närvarande inte kommersiellt tillgängliga. Vidare kräver traditionell WBP komplex datainsamling och databehandling baserat på fuktighet och temperatur 5,6. Därför beslutades att utveckla en förenklad WBP-apparat som kalibreras dagligen till rumstemperatur / luftfuktighet och bedöma om ämnets temperatur/ fuktighetsbidrag har någon effekt på den uppmätta andningsvolymen. Således har en modifierad sWBP-apparat skapats som källor till de för närvarande tillgängliga materialen. Vidare har det undersökts om denna laboratoriebaserade apparat kan upptäcka förändringar i andningen i samband med sjukdomsprogression under modellen av dödlig respiratorisk melioidos hos möss.
Den sWBP-apparat som konstruerades för detta arbete använde kommersiellt tillgänglig utrustning och programvara för att bearbeta analoga trycksensordata till en digital avläsning. Trycksensorn monterades på en lufttät glasburk med skottkontakter. Fördelen med en glasburk är materialets strukturella styvhet, som kommer att motstå förändringar i burkens inre tryck, vilket påverkar mätningar av volymförändringar under övervakningen av andningen. Provtagningskammaren har konstruerats för att ha två portar på de två plana ytorna på den fyrkantiga burken, en för att komma åt kammaren med en Luer-kontakt för kalibrering och den andra för att hysa trycksensorn. Den valda trycksensorn har en mycket känslig mättryckgivare med ett intervall för små tryckförändringar (25 mbar-intervall).
Detta protokoll demonstreras med hjälp av en murin modell av respiratorisk melioidos. Burkholderia pseudomallei (Bp) är bakteriemedlet för melioidos - en sjukdom som är förknippad med tropiska regioner i världen7. Bp finns i miljön, särskilt i våta miljöer med stående vatten och fuktig jord, från vilken det vanligtvis orsakar subkutana infektioner av skär / repor hos mottagliga värdar. Bp är dock också smittsamt vid inandning och är ett potentiellt hot för användning i bioterrorism genom aerosolspridning. Medan helt virulent Bp kräver hantering i ett BSL-3-laboratorium, konstruerades tidigare en akapsulär mutantstam, som säkert kan hanteras vid BSL-2 och uteslutas från urvalsmedelskriterierna8. Vidare har en intubationsmedierad intratrakeal (IMIT) infektionsmodell av respiratorisk melioidos utvecklats för att studera andningssjukdomsprogression av Bp 5,9. Vi har använt denna infektionsmodell för att karakterisera den förändring i andningen som sker under sjukdomsprogression genom den döende slutpunkten.
Protocol
De förfaranden som beskrivs här granskades och godkändes av University of Louisville Institutional Biosafety Committee (protokoll # 14-038) och Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll # 19567).
1. Sammansättning av provtagningskammaren
- Skapa två hål med en 3/4 " diamantborr på en borrpress på de plana ytorna på en 600 ml fyrkantig glasbred mun Mason konserveringsburk med 95 mm packning och lufttäta lock, med borgen och avtryckarklämlock (figur 1).
OBS: En provtagningskammare är inte kommersiellt tillgänglig och måste konstrueras. - Montera ett mässingsskott (1/4 " NPT-inre gänga, 3/4-16 UNF yttre gänga) genom båda hålen i Mason-burken med gummibrickor (3/4 " innerdiameter, 1 " ytterdiameter) på båda kontaktytorna mellan skottet och glaset för att säkerställa en lufttät tätning.
- Använd en skottenhet för en trycksensor medan du fäster det andra skottet med en Luer-ansluten spruta för kalibreringsändamål.
- För trycksensorn, linda in 1/4 "NPT-gängorna på en högpresterande tryckgivare med teflontejp och gänga dem i skottet. Använd ett lödkolv för att ansluta trycksensorkablarna till en 8-polig DIN-kontakt för hane, med hjälp av tillverkarens ledningsanvisningar för gränssnitt med en kommersiellt tillgänglig högkvalitativ datainsamlingsenhet (se materialförteckning).
OBS: Detta kräver användning av ett 150 K ohm 1/8 watt 1% metallfilmmotstånd i DIN-kontaktens ledningar. - För kalibreringsporten, använd en 1/4 "hane NPT till 1/8" kvinnlig NPT-adapter för att ansluta en 1/8 " hane NPT till en kvinnlig Luer-låsförnicklad kontakt till mässingsskottet som lindar gängade anslutningar med teflontejp. Använd ett polypropengängat Luer-lock för att täta Luer-kontakten när den inte används.
OBS: Dra inte åt skottkontakterna på glasburken, eftersom detta kommer att utveckla sprickor. Om så önskas kan silikon tillsättas till gummipackningarna för att säkerställa en lufttät tätning av skotten till glasburken.
- För trycksensorn, linda in 1/4 "NPT-gängorna på en högpresterande tryckgivare med teflontejp och gänga dem i skottet. Använd ett lödkolv för att ansluta trycksensorkablarna till en 8-polig DIN-kontakt för hane, med hjälp av tillverkarens ledningsanvisningar för gränssnitt med en kommersiellt tillgänglig högkvalitativ datainsamlingsenhet (se materialförteckning).
2. Inställning av systemet
- Anslut provtagningskammaren till en broförstärkare med en 8-stifts DIN-kontakt och bryggförstärkaren till datainsamlingsanordningen enligt tillverkarens instruktioner.
- Anslut datainsamlingsenheten till en strömförsörjning och en dator som kör programvara för fysiologisk dataanalys med tillverkarens kablar.
OBS: Se till att datainsamlingsenheten är påslagen och uppvärmd i minst 5 minuter före användning för att säkerställa att sensorn stabiliserar sina mätningar. - Starta programvaran för att samverka med datainsamlingssystemet.
- Ladda ner den valfria spirometrimodulen i programvaran och ändra standardenhetsinställningarna från L / s till μL / s i fönstret Spirometri > inställningar .
3. Kalibrering av systemet
- I programvaran skapar du ett 4-kanalsfönster med följande datafönster: Kanal 1: Källdata med 4 k / s samplingsfrekvens och 1 mV-intervall ; Kanal 2: Digitalt filter på kanal 1 med ett högt pass 1 Hz automatiskt justeringsfilter ; Kanal 3: Utjämning av kanal 2-data med i genomsnitt 100 prover; Kanal 4: Spirometriflöde av kanal 3-data (anpassat flödeshuvud, kalibrerat till formel (μl / s) = 120 000 x spänning).
120 000 är en platshållarkorrelationskoefficient som kommer att ändras under kalibreringen. - Ställ in DataPad-analys av kanal 4 med följande kolumner: Kolumn 1: Kanal 4-data, kommentarer > fullständig kommentartext; Kolumn 2: Kanal 4-data, cykliska mätningar > genomsnittlig cyklisk frekvens; Kolumn 3: Kanal 4-data, cykliska mätningar > genomsnittlig cyklisk höjd.
- Ställ in bildrutehastigheten på 100:1 längst ned till höger på diagramvisningen. Spara den här fönsterkonfigurationen som en mall för alla framtida studier.
- Stäng provkammarens lock och fäst en 25 μL gastät spruta på Luer-skottkontakten. Montera sprutan med en Chaney-adaptersats för att upprepade gånger leverera en volym på 20 μl.
OBS: Ett valfritt kort stycke 1/16 "slang och Luer / barb-kontakter kan användas för att ansluta sprutan till provkammaren. Långa slangar bör dock undvikas för att undvika betydande förändringar av provkammarens totala luftvolym. - Dra in 20 μl luft i sprutan med hjälp av Chaney-adapterns djupstopp.
- Nollställ pleth i programvaran (Setup > Zero All Inputs (Alt-Z)) och starta en inspelning.
- Under inspelningen och med en stabil baslinje trycker du snabbt ner/drar ut sprutkolven i cirka 10 repetitioner för att replikera försökspersonens andning med ett uppmätt andetag på 20 μl. Stoppa inspelningen.
OBS: Frekvensen för de konstgjorda andetagen bör överstiga 2 Hz för att maximera kalibreringens reproducerbarhet. - Märk identiteten på det uppmätta provet genom att högerklicka på början av den numrerade pleth-inspelningen och klicka på Lägg till kommentar.
- Återställ sprutan, nollställ ingången och upprepa inspelningsmätningar med 20 μl-pulser ytterligare två gånger (tre totala inspelningssessioner).
- När du har slutfört alla mätningar använder du datormusen för att välja en del av andningspleth som exakt representerar de konstgjorda 20 μL-andetagen.
OBS: Inom DataPad-modulen visas data i förhandsgranskningshuvudet som ger en tillfällig avläsning av andningsfrekvensen (genomsnittlig cyklisk frekvens, Hz) och andningsdjup (genomsnittlig cyklisk höjd, μL). Förhandsgranskningen av data kan spelas in i DataPad med ikonen Lägg till i DataPad . - Granska kolumn 3-data (genomsnittlig cyklisk höjd) och beräkna den genomsnittliga uppmätta andningsvolymen från de tre inspelningarna. Utför följande beräkning av den genomsnittliga uppmätta andningsvolymen: Kalibreringskoefficient = levererad volym / uppmätt volym x 120 000.
OBS: 120 000 var platshållaren Flödeshuvudkalibreringskoefficient som användes i steg 3.1 nu modifierad från uppmätta data. Systemet är nu kalibrerat till typisk musandning med aktuell omgivningstemperatur och luftfuktighet. Systemet kan nu övervaka försökspersonens andning, och kalibreringen kan utföras dagligen för att ta hänsyn till eventuella fluktuationer i temperatur / fuktighet.
4. Övervakning av ämnen
- Öppna en huvudmall enligt beskrivningen i steg 3.4 eller slutför steg 4.2 till 4.3.
- I programvaran skapar du ett 4-kanalsfönster med följande databehandling: Kanal 1: Källdata vid 4 k / s samplingsfrekvens och 1 mV-intervall ; Kanal 2: Digitalt filter på kanal 1 med ett High Pass 1 Hz Auto Adjust-filter; Kanal 3: Utjämning av kanal 2-data genom medelvärde av 100 prover; Kanal 4: Spirometriflöde av kanal 3-data (anpassat flödeshuvud, kalibrerat till formel (μl / s) = 120 000 x spänning).
OBS: 120 000 är korrelationskoefficienten beräknad för den aktuella trycksensorn; Användaren bör dock utföra den systemkalibrering som beskrivs i steg 3 och använda den här användardefinierade korrelationskoefficienten i stället. - Ställ in DataPad-analys av kanal 4 med följande kolumner: Kolumn 1: Kanal 4-data, kommentarer > fullständig kommentartext; Kolumn 2: Kanal 4-data, cykliska mätningar > genomsnittlig cyklisk frekvens; Kolumn 3: Kanal 4-data, cykliska mätningar > genomsnittlig cyklisk höjd.
- Placera motivet i provtagningskammaren och stäng locket. För detta experiment användes en medveten 4-12 veckors kvinnlig albino C57BL/6J mus (B6(Cg)-Tyrc-2J/J).
- Utjämna atmosfärstrycket i kammaren (från tätning av locket) genom att kort lossa Luer-skottlocket och dra åt igen.
- Observera att motivet inte rör sig aktivt i provtagningskammaren innan du nollställer alla ingångar (Alt-Z-genväg) och påbörjar en inspelning.
OBS: Om motivet börjar röra sig i provtagningskammaren kan baslinjen röra sig från skalan, vilket kan åtgärdas genom att nollställa alla ingångar i mitten av en inspelning, vilket skapar en ny inspelning på skalan. Antag att ämnet ägnar sig åt utforskning eller grooming under inspelningen; Observera vilken del av pletysmografiinspelningen som mest exakt återspeglar normal andning. - Märk ämnets identitet genom att högerklicka på början av den numrerade pleth-inspelningen och klicka på Lägg till kommentar.
- Sätt tillbaka ämnet till buret. Begränsa tiden i den förseglade provtagningskammaren till 5 minuter för att undvika kvävning och stress.
OBS: Risken för kvävning är låg med tanke på att provkammarens luftvolym på 600 ml inte snabbt kommer att spenderas av en frisk mus som andas vid <15 ml/min. - Använd datormusen för att välja en del av andningen som exakt representerar ämnets andning.
OBS: Inom DataPad-modulen visas data i förhandsgranskningshuvudet som ger en tillfällig avläsning av andningsfrekvensen (genomsnittlig cyklisk frekvens, Hz) och andningsvolym (genomsnittlig cyklisk höjd, μL). Förhandsgranskningen av data kan spelas in i DataPad med ikonen Lägg till i DataPad . - Fortsätt mäta motivmöss en i taget och registrera representativa delar av andningspleth till DataPad.
- Efter datainspelning exporterar du DataPad-data till Excel. Beräkna minutvolymen enligt följande: Minutvolym (ml/min) = andningsfrekvens (Hz) x andningsvolym (μl) x 0,06.
Representative Results
Kalibrering av system
Dataanalysprogramvaran möjliggör direkt kalibrering av ett anpassat flödeshuvud, till exempel det som beskrivs häri. Detta utförs vid inställning av spirometriflödet. Som beskrivs i steg 3.1 finns det ett alternativ för att mata in den kända kalibreringsluftvolymen, som beräknar korrelationskoefficienten mellan spänning och volym i systemet. Detta genererar emellertid en korrelationskoefficient baserad på en enda läsning, och det har observerats att den inneboende variationen av kalibrering från en n = 1-standard har dålig nytta. Det nuvarande tillvägagångssättet kan åtgärda denna brist och gör det möjligt för en användare att utföra en daglig kalibrering med hjälp av flera avläsningar i genomsnitt för att beräkna en kalibreringskoefficient. Kalibrering med 20 μL injicerad luft demonstrerades häri, vilket representerar en typisk avancerad andningsvolym i en typisk mus. Programvaran antar en ursprungsavlyssning (0,0) och kalibreras därmed från 0-20 μL med hjälp av detta tillvägagångssätt.
Den metod som föreslås här för sWBP kalibreras dagligen och tar därmed hänsyn till eventuella fluktuationer i luftfuktighet / temperatur. De ursprungliga metoderna som användes för specifik WBP går tillbaka till Drorbaughs och Fenns metodik från 1955, som utvecklade WBP för mätning av ventilation hos mänskliga spädbarn5. Drorbaugh- och Fenn-beräkningarna står för variationer i temperatur och luftfuktighet i miljön och ämnet. Den aktuella metoden korrigerar för miljöfluktuationer genom att kalibrera varje sWBP-session. Ändå beslutades att ta itu med huruvida uppvärmning och befuktning av andning över näshålan / lungan hos en mus påverkar mätningen av en känd luftvolym. Således skapades en konstgjord apparat för att efterlikna ämnets effekt på uppvärmning och befuktning av kalibrerade luftmätningar. Luer-kontakter fästes på ett 15 ml koniskt rör och placerade denna förseglade koniska linje mellan provkammaren och den gastäta kalibreringssprutan. En kalibrering på 20 μL utfördes med användning av ett tomt koniskt rör som hölls vid rumstemperatur (23 °C). Det koniska röret fylldes sedan delvis med destillerat vatten till strax under Luer-kontakterna, vilket gav tid att balansera huvudutrymmet för det koniska; Kalibreringsvolymen mättes sedan om för att undersöka effekten av fuktighet. Det koniska röret placerades i ett värmeblock och utjämnades vid 37 ° C i en fuktig miljö och slutligen utjämnades till 37 ° C utan vatten för att bedöma effekten av ämnesuppvärmning och utan ytterligare bidrag av fuktighet. Figur 2 visar att alla testade förhållanden inte signifikant påverkade den kalibrerade 20 μl-mätningen som levererades av den gastäta sprutan. Av detta resultat drogs slutsatsen att sWBP erbjuder ett tillgängligt tillvägagångssätt för att övervaka andningen hos försöksdjur utan behov av komplexa beräkningar baserade på djurförsökspersonens temperatur och fuktighet, eftersom dessa inte har någon signifikant inverkan på uppmätt andningsvolym.
Övervakning av ämnen
sWBP användes för att övervaka andningen under sjukdomen av dödliga luftvägsinfektioner med bakteriepatogenen B. pseudomallei. En utmaning med att övervaka andningen hos medvetna djur är nyfikenheten hos normala friska djur som rör sig i provkammaren. Musens rörelse skapar en ständigt rörlig baslinje som delvis kan mildras genom att förkonditionera försökspersoner till kammaren under en period av flera dagar före mätningen. Denna fråga påverkar främst baslinjemätningen hos friska möss, eftersom försökspersonerna blir slöa under infektion, vilket gör sWBP mycket mer hanterbar med minskad ämnesaktivitet. Det kan vara frestande att försöka använda någon form av återhållsamhet, oavsett om det är fysiskt eller bedövning. Användningen av fysisk återhållsamhet kan påverka den naturliga andningen genom att orsaka stress. Vidare är användningen av anestetika känd för att ha uttalade effekter på andningsfrekvens och djup10; således beslutades att undersöka effekterna av anestesi med den interna sWBP-apparaten. Isofluran används ofta för att utföra in vivo diagnostisk avbildning under infektionsmodellerna, och därför bedövades en C57BL/6-mus och övervakade progressionen tills återhämtning ur anestesi med hjälp av sWBP. Denna studie genomfördes med en juvenil 4-veckors gammal albino C57BL / 6J-mus för att förlänga fönstret för återhämtning från anestesi. Figur 3 visar att det föredragna bedövningsmedlet får möss att uppvisa en långsam andningsfrekvens med en stor tidvattenvolym luft. När möss börjar återhämta sig från sedering ökar deras andningsfrekvens och andningsvolymen minskar, med nettoeffekten att den totala inspirerade luften långsamt ökar. I denna studie konstaterades att andningsvolymen återställs till nivåerna före anestesi inom de första 30 s av återhämtningen. Andningsfrekvensen ökar stadigt tills baslinjeandningen återställs till 2-2,5 min efter borttagning från anestesi. Minutvolymen följde noga effekterna av andningsfrekvensen och nådde baslinjens minutvolym med 2,5 min efter avlägsnande från anestesi. Detta resultat stöder att anestesi inte bör användas i sWBP-metoden. Det påverkar dramatiskt baslinjeandningen, inte överraskande, eftersom anestesi kommer att sakta ner värdmetabolismen, vilket skapar en minskad efterfrågan på inspirerat syre. Sanitet i provkammaren bör också övervägas mellan försökspersoner för att ta itu med studiespecifik infektionskontroll samt effekterna av feromoner från urin eller avföring som kan påverka stressen mellan försökspersonerna.
WBP är en attraktiv strategi för att övervaka lungfunktionen i modeller av luftvägssjukdomar på ett icke-invasivt sätt. sWBP användes för att studera hur andningen förändras under dödliga respiratoriska melioidosinfektioner (figur 4), med tidpunkter som speglar bioluminescensövervakning i lungan. Det observerades att denna modell är förknippad med en tidig början av slöhet, som kvarstår på ett långsamt progressivt sätt tills utvecklingen av den döende sjukdomen vid cirka 3 dagar efter infektion. Det observerades också att mössens andningsfrekvens och totala inspirerade luft (minutvolym) minskar snabbt under den första infektionsdagen och förblir låg under resten av infektionsförloppet (figur 4A,C). Detta mönster överensstämmer med den tidiga slöheten, som kvarstår under de närmaste 2 dagarna av infektionen. Däremot sjunker andningsvolymen inte brant under de första 24 timmarna och har istället en liten och stadig minskning, som närmar sig en linjär nedgång under 3-dagars sjukdomsförloppet (figur 4B).
Figur 1: sWBP-apparat. En anpassad provkammare konstruerades av en förslutningsbar fyrkantig glasburk med skottkontakter på två plana ytor. Ett skott användes för att montera en mättryckssensor ansluten till en broförstärkare och datainsamlingsenhetsdigitaliserare via en 8-polig DIN-anslutning. Det andra skottet var utrustat med en Luer-kontakt för kalibrering med en gastät spruta. Enheten var ansluten till en dator som kör programvaran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekt av motivets temperatur och fuktighet på andningsvolymen. Ett 15 ml koniskt rör med Luer-kontakter installerades i linje mellan 20 μl kalibreringssprutan och provkammaren. Systemet kalibrerades till 20 μL utan ytterligare temperatur/fuktighetsbidrag från det koniska röret. Andra mätningar samlades in efter jämvikt med mättad fuktighet från destillerat vatten och/eller uppvärmning av det koniska röret från rumstemperatur (23 °C) till kroppstemperatur (37 °C). Ingen signifikant skillnad upptäcktes från n = 5 mätningar av varje tillstånd av envägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelse efter test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekt av gasbedövning på andning hos möss. Representativa data från en 4 veckor gammal kvinnlig albino C57BL/6J-mus (8,6 g) sederades i 5 minuter med 3% isofluran i syre och överfördes till en sWBP-provkammare. Pleth-data samlades in i 150 s efter borttagning från anestesi. Ämnet började initial ambulation av 100 s efter avlägsnande från anestesi. (A) Baslinjeandning före anestesi, mätning av en andningsfrekvens på 4,97 Hz, 9,74 μL andningsvolym och 2,91 ml minutvolym. (B) De första 60 sna av förändringar i andningen under återhämtning från anestesi. (A–B) Vertikal axel som mäter μL per andetag och horisontell axel i sekunder. (C–E) Ventilationsdata samlades in under 150 s återhämtning från anestesi, i genomsnitt från ≥3 andningscykler per tidpunkt för (C) andningsfrekvens, (D) andningsvolym och (E) beräknad minutvolym. Baslinjevärdena före anestesi anges med en horisontell prickad linje i respektive diagram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekt av respiratorisk melioidos på värdens andning. Fem 8-veckors kvinnliga C57BL/6-möss infekterades med 4,9 log CFU av bioluminescerande B. pseudomallei stam JW270. sWBP genomfördes under hela 3-dagars infektionsförloppet, mätning av andningsfrekvens (A) och andningsvolym (B). Den totala inspirerade luften beräknades som minutvolymen (C). Data för var och en av de fem ämnena plottas oberoende med tredje ordningens polynomregression. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
sWBP är ett attraktivt tillvägagångssätt för att öka förståelsen för luftvägsinfektioner i smådjursmodeller. Det är viktigt att det är ett icke-invasivt tillvägagångssätt, och som sådant utgör det inte en betydande risk för att orsaka onödig stress för försöksdjur under en infektionsutmaning. Faktum är att förfarandet för övervakning av försökspersonens andning är ett snabbt test som kräver flera minuter och minimal ämneshantering. Den vetenskapliga fördelen är den högupplösta förståelsen av hur mikrobiella patogener påverkar lungfunktionen under sjukdom. Detta tillvägagångssätt kommer att ge nytta för grundforskning, underlätta förståelsen för hur en patogen orsakar sjukdom, samt ge ett translationellt verktyg för att förstå hur en ny terapeutisk återställer en forskning som är föremål för ett tillstånd av andningshälsa.
I detta manuskript tillhandahålls representativa resultat för patogenen B. pseudomallei, vilket orsakar ett tidigt slött svar. Inte alla bakteriella lunginfektioner förekommer på samma sätt i musinfektionsmodeller. Tidigare erfarenheter av andra infektionsmodeller har visat att bakteriepatogenen Klebsiella pneumoniae uppträder som en asymptomatisk infektion fram till den punkt då möss dukar under för infektion, även vid ungefär dag 3 efter infektion11. Det antas att värdens efterfrågan på inspirerad luft (dvs minutvolym) kan relatera nära till graden av slöhet som en given sjukdom presenterar. Framtida studier kommer att krävas för att undersöka hur olika bakteriella patogener påverkar lungfunktionen under andningssjukdomar. Det är underförstått att olika patogener har unika metoder för att undvika värdförsvar, inklusive skillnader i, (1) benägenhet att vara intracellulära eller extracellulära patogener, (2) förmågan att orsaka tidigt / sent hypotermiskt svar och (3) användning av olika repertoarer av virulensdeterminanter 3,12,13. Därför är det troligt att olika sjukdomsstrategier kommer att resultera i unika effekter på lungfunktion och andning under infektion.
De rekommenderade inställningarna som beskrivs i det här protokollet kan ändras för att hantera unika utmaningar som finns under sWBP. Ett av de vanligaste problemen som upplevs under en sWBP-inspelningssession är ämnets rörelse inom provkammaren. Som nämnts ändrar denna rörelse baslinjen och kan påverka noggrannheten i andningsmätningarna. Ett digitalt filter användes för att normalisera den skiftande baslinjen, vilket möjliggjorde livskraftiga andningsmätningar trots små rörelser. Överdriven rörelse kan driva en baslinjemätning utanför intervallet för en nollställd indata. Inspelningar rekommenderas vid 1 mV-intervall (kanal 1-inställning), vilket ger en kompromiss med att fortfarande observera topparna i pletysmografin samtidigt som man undviker förlust av data utanför intervallet. För exceptionellt aktiva försökspersoner kan det vara nödvändigt att utöka inspelningsområdet >1 mV för att undvika ihållande signaler utanför räckvidden.
Den rekommenderade proceduren kräver daglig kalibrering (eller vid varje session) för att tillgodose miljöfuktighet / temperaturfluktuationer. Traditionell WBP använder komplexa beräkningar som tar hänsyn till temperatur/luftfuktighet i både miljö och ämne 5,6. Det har visats att effekterna av värdens temperatur/luftfuktighet i den nuvarande sWBP-apparaten inte signifikant förändrar den uppmätta andningsvolymen för en kalibreringskälla. Därför skiljer sig detta tillvägagångssätt i sWBP fundamentalt från Drorbaughs och Fenns >50-åriga tillvägagångssätt. Här relaterar sWBP direkt tryckförändringar till en uppmätt andningsvolym utan ytterligare korrigering från värden.
Det är viktigt att kontrastera försöksdjur WBP med klinisk WBP. De typer av biometriska data som försöktes samla in av sWBP är andningsvolym och frekvens. Sådana mätningar samlas in kliniskt med hjälp av enkel spirometriutrustning där en patient håller en andningsmonitor mot munnen och andas normalt in i en enhet som övervakar luftflödet. Liknande spirometri hos försöksdjur kräver återhållsamhet, vilket bidrar till stress och en inneboende andningsstörning. Därför är enkel spirometri funktionell kliniskt men inte för försöksdjur. WBP tjänar ett viktigt syfte i kliniken för att samla in avancerade data, inklusive sådana mätningar som kvarvarande lungvolym. Sådana data kan endast innehållas i samband med att ett ämne kan följa instruktioner om hur de andas, inklusive tvingad utgång (tömning av lungan genom en djup utandning). Försöksdjur kan inte lita på att följa andningsinstruktioner från en forskare. Många av de avancerade mätningar som samlats in kliniskt under WBP kan inte reproduceras hos försöksdjur. WBP hos försöksdjur skiljer sig fundamentalt från klinisk WBP. Animal WBP strävar efter att samla in enkla ventilationsdata (andningsfrekvens och volym) på ett icke-återhållsamt sätt för att undvika djurstress och andningsstörning. Hittills verkar användningen av WBP hos försöksdjur replikera de tekniker som används i klinisk WBP, inklusive komplexa beräkningar baserade på temperatur och luftfuktighet i miljö och ämne, men utan möjlighet att samla in avancerade data från ett ämne som kan följa instruktioner om hur man utför en tvingad utgång. Med detta i åtanke försökte man visa om en förenklad version av WBP skulle räcka för att samla in den relevanta andningsfrekvensen och volymen som är relevant för studier av andningssjukdomar. En kalibreringssession användes, vilket kompenserade för eventuella variationer i omgivningstemperatur och luftfuktighet. Vidare visades det med en konstgjord mus att ämnestemperatur och fuktighet till en uppmätt andningsvolym inte har någon signifikant effekt på att noggrant mäta andningsvolymen. Man drog slutsatsen att sWBP har utmärkt tillämpning på djurstudier, utan krav på användaren att använda besvärlig matematisk behandling av data.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Dessa studier stöddes av National Institutes of Health COBRE-bidrag P20GM125504-01 Delprojekt 8246.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A. Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. Gullo, A. , Springer. (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
