本实验的总体目标是描述一种可用于小鼠摄食与肥胖模型的药物自我给药方法。
本文内容
摘要
摘要
在小鼠中进行的临床前研究通常依赖于注射或经口灌胃等侵入性操作来递送药物。这些具有应激性的给药方式会对食物摄入量和体重等重要的代谢参数产生显著影响。尽管将药物掺入啮齿类动物饲料或溶解于饮水中是一种颇具吸引力的替代方案，但这些方法也存在局限性，例如药物在室温下长期放置时的稳定性问题、药物在水中的溶解度限制，以及给药剂量高度依赖于动物摄食或饮水的时间。药物的持续可获得性也限制了其在临床给药方式上的转化相关性。为克服这些局限，可将药物与适口性极高的食物（如花生酱）混合，使小鼠能够自行摄取化合物。小鼠可在短时间内可靠且可重复地摄入药物与花生酱制成的丸粒。该方法相较于注射或灌胃显著降低了应激反应，提供了一种更温和的给药途径。本方案详细阐述了药物配制、动物对安慰剂递送方式的适应性训练以及药物递送的具体操作步骤。文中还讨论了该方法在药物给药时间与昼夜节律相关研究中的应用意义。
引言
本方法的目的是通过一种非侵入性、对小鼠应激较小的操作来递送药物。在小鼠中进行的临床前研究通常依赖于具有较大应激性且侵入性的给药途径，这些途径可能对代谢参数产生显著影响。例如，每日重复的口服灌胃会显著减少小鼠的热量摄入和体重增长1。此外，口服灌胃在技术上具有挑战性，并有可能造成损伤。作为一种替代方法，可将化合物混合于小鼠的食物中或溶解于其饮用水中，使其自行摄取2。然而，这种方法存在一个主要局限性，即依赖于食物或饮水自然的昼夜节律性摄入模式。此外，药物在水中的稳定性或溶解度在长期给药过程中可能成为严重问题。为克服这些局限性，可将药物与适口性极高的食物（如曲奇面团3、果冻4,5或花生酱6）混合，以促使小鼠在指定时间自主摄取药物。该方法相较于注射或每日灌胃，具有显著降低应激的优势1。此给药方式可适用于向小鼠递送多种不同类型的药物。本实验方案展示了将药物与高适口性食物混合后进行药物配制、训练及给药的完整过程。以抗精神病药物利培酮给予C57BL/6J雌性小鼠为例，说明该方法的应用。利培酮在临床上广为人知可引起明显的摄食过多和体重增加效应7，这种效应在啮齿类动物中也能得到良好模拟6,8。该给药系统有助于建立高度可转化的研究模型，可用于研究多种药物及其对调控摄食和体重相关通路的影响9。
方案
所有涉及动物实验的操作均已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 制备药物-花生酱颗粒
- 计算制备所需剂量药物花生酱丸所需的药量，并根据实验所需批量进行放大。重要的是，花生酱丸可根据药物稳定性在 -80 °C 下保存。
- 使用研钵和研杵将药物片剂研磨成粉末。
- 将花生酱置于已去皮的天平上的称量舟中，称取所需量。
- 将花生酱置于盛有温水的烧杯上，直至其融化。
- 将所需量的药粉加入融化的花生酱中，并充分混合。
- 让药物-花生酱混合物冷却，以便于将其放入橡胶模具中。
- 将花生酱-药物混合物填入模具中。此处使用的模具为橡胶状皮质酮丸模具，可制成约 ~100 mg 的花生酱丸。可能需要调整药物与花生酱的比例，以确保适口性。
- 使用纯花生酱重复上述步骤，以制备安慰剂丸。
- 将模具在 -20 °C 或 -80 °C（取决于药物稳定性）下冷冻，使花生酱硬化，直至使用。
2. 小鼠准备
- 将小鼠单只饲养于标准小鼠笼中。笼内铺高吸水性纸垫料，并提供丰富化物品，包括纸巾和饲养圆顶。这种纸垫料有助于准确测量食物摄入量，因为它可将洒落的食物与粪便及垫料区分开来进行定量。
注意：须确保已获得IACUC对单只饲养小鼠的批准。 - 自由供应食物和水，让小鼠适应饲养环境约3天。
3. 药物-花生酱自我给药训练
- 规划并选择一天中药物给药的最佳时间。
- 对小鼠禁食24小时，并确保已获得IACUC对所选禁食时长的批准。
- 将模具从冷冻室中取出，让橡胶模具稍微软化，以便药丸能够顺利从模具中推出。所有训练均可使用安慰剂对照药丸完成。
- 将一颗安慰剂对照花生酱药丸放置在笼壁距离底部约1.5英寸的位置。在第一天，由于新奇性，小鼠可能需要约1小时才能吃完花生酱药丸。
- 训练结束后，提供自由取食和饮水。
- 次日，在相同位置的笼壁上再次放置花生酱药丸，对非禁食小鼠进行进一步训练。
- 在进食状态的小鼠中重复训练约3天。到第三天时，小鼠吃完花生酱药丸所需时间将少于30分钟。
4. 实验
- 根据小鼠体重将其随机分配至不同的处理组，确保各组在处理前具有相同的平均体重。
- 计划在小鼠接受花生酱颗粒训练的相同时间，给予其花生酱药丸（治疗剂或安慰剂）。
- 称量食物和小鼠体重，并记录数值。
- 确保将花生酱药丸（治疗剂或 placebo）放置在训练期间确定的笼内相同位置。
- 在整个实验期间每日持续进行给药操作。
结果
在本示例中，花生酱用于每日向小鼠递送利培酮，持续14天。
本研究表明，通过该方法持续给予利培酮，与对照组相比，可显著且高度可重复地增加摄食量和体重（图1a，b）。此外，与腹腔注射等其他更具应激性的给药方式相比，该给药方法可获得高度一致的实验数据（图1c，d）。
图 1。给药方式对小鼠食物摄入量和体重增加的影响。 C57BL/6J 雌性小鼠每天上午 8 点接受含利培酮（3 mg/kg）的花生酱颗粒或安慰剂对照颗粒处理，持续 14 天。与对照组相比，通过花生酱给予利培酮的小鼠每日食物摄入量显著更高（a），体重增加也显著更多（b）。此外，与通过花生酱自主给药相比，腹腔注射给予利培酮（3 mg/kg）对食物摄入量（c）和体重增加（d）的影响较弱。数据以均值 ± 标准误表示，并通过学生 t 检验进行分析。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
在实施本方案时，重要的是在整个研究过程中保持食物摄入量和体重测量的准确性以及给药时间的一致性。尽管这种自我给药方法需要较长的训练阶段，但这一过程对于使小鼠适应花生酱的新奇性并确保其在规定时间摄入药物尤为关键。一旦建立成功，该技术还具有很高的实验灵活性，可进行修改和调整，以实现每天多次、不同剂量的药物递送。当小鼠以标准普通饲料为主要营养来源时，该技术效果最佳。当小鼠被喂食高脂肪、高糖且适口性极佳的饮食时，训练阶段可能更具挑战性，因为在这些条件下部分小鼠摄入花生酱的意愿会降低，这也是该技术的一个局限性。
与现有的注射或口服灌胃等方法相比，这种药物自递送方法造成的应激最小，能够获得关于药物对代谢表型（包括摄食量和体重）影响的可靠且一致的数据。该技术的未来应用包括在昼夜节律与代谢健康的背景下，研究给药时间对摄食和体重增加的影响10。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助项目 R01DK117872（授予 OO）以及 Larry L Hillblom 基金会博士后奖学金（授予 RCZ）支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57B6/J 小鼠 | Jackson Labs, Sacramento, CA, USA | 664 | |
| 皮质酮缓释丸模具 | Ted Pella Inc, Redding, CA, USA | 106A | |
| 小鼠 igloo | VWR, Visalia, CA, USA | 89067-850 | 笼内环境丰富化用品 |
| 花生酱 | Jif Peanut Butter, Orrville, OH, USA | 顺滑型花生酱 | |
| 研钵和研杵 | VWR, Visalia, CA, USA | 470148-960 | |
| 利培酮 | Patriot Pharmaceuticals, Horsham, PA, USA | 50458-593-50 | |
| 啮齿类动物饲料 | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5001 | |
| 称量舟 | VWR, Visalia, CA, USA | 10803-148 | |
| 电子天平 | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | MS104TS | |
| Wypall 纸 X60 | Kimberly-Clark, Corinth, MS, USA | 34865-05 | 吸水性纸垫料 |
参考文献
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