Summary
Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.
Abstract
Bağırsak dokusunun yapısı, konakçı ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki yakın ve karşılıklı etkileşimleri kolaylaştırır. Bu çapraz görüşmeler yerel ve sistemik homeostazların sürdürülmesi için çok önemlidir; bağırsak mikrobiyota bileşimindeki (disbiyozis) değişiklikler çok çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir. Konak-mikrobiyota etkileşimlerini inceleme yöntemleri, fizyolojik doku yapısının korunması (in vivo hayvan modelleri kullanırken) ve deney faktörleri üzerindeki kontrol seviyesi (basit in vitro hücre kültürü sistemlerinde olduğu gibi) arasında doğal bir dengeyi kapsar. Bu dengeyi ele almak için, Yissachar ve arkadaşları yakın zamanda bir bağırsak organı kültür sistemi geliştirdiler. Sistem naif bir kolon dokusu yapımını ve hücresel mekanizmaları korur ve ayrıca sıkı deneysel kontrole izin vererek vivoolarak kolayca gerçekleştirilemeyen deneyleri kolaylaştırır. Çeşitli bağırsak bileşenlerinin (epitel, immünolojik ve nöronal elementler gibi) kısa süreli yanıtlarını ışık pertürbasyonlarına (anaerobik veya aerobik mikroplar, farelerden veya insanlardan gelen tüm mikrobiyota örnekleri, ilaçlar ve metabolitler dahil) ayırmak için en uygun olanıdır. Burada, özel yapım bir bağırsak kültürü cihazı kullanarak birden fazla bağırsak parçasının organ kültürü için optimize edilmiş bir protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Luminal pertürbasyonlara konak yanıtları, doku bölümlerinin veya tüm montajlı doku parçalarının immünofluoresans boyanması, floresan yerinde hibridizasyon (FISH) veya zaman atlamalı görüntüleme ile görselleştirilebilir. Bu sistem, yeni nesil sıralama, akış sitometrisi ve çeşitli hücresel ve biyokimyasal tahliller de dahil olmak üzere çok çeşitli okumaları destekler. Genel olarak, bu üç boyutlu organ kültürü sistemi büyük, bozulmamış bağırsak dokularının kültürünü destekler ve yerel bağırsak ortamında konak-mikrobiyota etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü analizi ve görselleştirilmesi için geniş uygulamalara sahiptir.
Introduction
Bağırsak, hücrelerin birbirleriyle ve ışık içeriğiyle (mikrobiyota, gıda vb.) etkileşime girmesini ve iletişim kurmasını sağlayan belirli bir yapıda düzenlenmiş çok çeşitli hücre tipleri (epitel hücreleri, bağışıklık sistemi hücreleri, nöronlar ve daha fazlası) içeren son derece karmaşık bir organdır. 1. Şu anda, konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmek için mevcut olan araştırma araç kutusu in vitro hücre kültürlerini ve in vivo hayvan modellerini içerir2. In vivo hayvan modelleri fizyolojik doku konstrüksiyon3 sağlar, ancak zayıf deneysel kontrol ve deney koşullarını manipüle etme yeteneği sınırlıdır. İn vitro kültür sistemleri ise, mikroplarla desteklenebilen birincil hücreleri veya hücre hatlarını kullanın4Deney parametreleri üzerinde sıkı kontrol sağlar, ancak hücresel karmaşıklıktan ve doku mimarisinden yoksundur. Modern in vitro tahliller, fare veya insan kaynaklarından elde edilen epitel organoidler 5,6ve mukozal mikroçevreyi taklit eden örnekler gibi sağlıklı ve patolojik insan dokusu örneklerinin ileri düzeyde kullanılmasına izin verir7. Başka bir örnek, bağırsak değişmez8'infizyolojik durumunu taklit etmek için insan kolonik epitel hücre hattı (Caco2), hücre dışı matris ve mikroakışkan kanalları içeren 'çip üzerindeki bağırsak' tahlildir. Bununla birlikte, in vitro örnekler ne kadar gelişmiş ve yenilikçi olsalar da, normal bir doku mimarisi veya naif hücresel bileşim sağlamaz.
Bunu ele almak için, Yissachar ve arkadaşları son zamanlarda sağlam bağırsak parçalarını koruyan bir ex vivo organ kültürü sistemi geliştirdi9 (Şekil 1) ex vivo, hem in vivo hem de in vitro modellerin avantajlarından yararlanıyor. Bu ex vivo gut organ kültürü sistemi, altı kolon dokusunun çok katlı kültürünü destekleyen, sistemin giriş ve çıkışlarını kontrol ederken benzer koşullar altında deneysel girdilerin incelenmesine izin veren özel yapım bir kültür cihazına dayanmaktadır. Son çalışmalar, bu sistemin bireysel bağırsak bakterilerine bağırsak yanıtlarını analiz etmek için değerli olduğunu göstermiştir9, tüm insan mikrobiyota örnekleri10 ve mikrobiyal metabolitler11. Bu sistem, ilk kez, bu erken konak-mikrobiyota etkileşimlerinin konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrol ile incelenmesine izin verir. Ayrıca, deney boyunca sistemin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve manipüle etmesine izin verir.
Şekil 1: Bağırsak kültürü cihazının şemaları. Bütün bir bağırsak dokusu parçası, odanın çıkış ve giriş portlarına (üstte), lümenin içindeki ve dış orta odanın içindeki orta akışı düzenleyen pompalarla tutturulur. Tüm cihaz (altta) bu tür 6 odacık içerir. Bu rakam Yissachar ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, hayvan refahı etik komitesi tarafından onaylanan hayvan bakım yönergelerini izler.
1. Deney hazırlığı
- Bağırsak organ kültürü cihazının imalatı (3 gün)
- 3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazda 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyu ve cihaz kapağı kapağı vardır) (3D dosyalar eklenmiştir).
NOT: Bu plastik kalıplar çok sayıda cihazın imalatı için kullanılabilir. - Künt uçlu iğneleri (22 G & 18 G) cihaz kalıbı içinde uygun konuma getirin ve cihazın ve kapağın bir seti için yaklaşık 20 g polidimetilsiloksan (PDMS) karışımı (1:10 ağırlık oranı, tabandan katalizöre) dökün.
- Hava kabarcıklarını PDMS karışımından çıkarmak için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.
- PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları bir gecede 55 °C'de kuluçkaya yatırın.
- PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan çıkarın ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın.
- Pdms kalıntılarını bir cerrahi bıçak kullanarak kuyu anahattından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak bir kapak camına (75 mm x 50 mm mikro slaytlar) takın ve parçaları gece boyunca ayarlamak üzere bırakın (yapıştırıcıyı cihazın pürüzsüz tarafına uygulayın).
- Lümen için on iki 22 G iğne ve kuyu için on iki 18 G iğne yerleştirin. Silikon kullanarak tüm iğneleri yerinde sabitle ve gece boyunca ayarlasın. Bağırsak organ kültürü cihazına uygun hava akışı için kapak kapağına iki adet 18 G iğne yerleştirin.
- Su dolu bir şırınga kullanarak tüm iğneleri sızıntılara karşı kontrol edin. Kuyuları su ile doldurarak kuyulardan sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
- Kolona bağlanacak her 22 G iğneye iki cerrahi düğüm yerleştirin. Cihazı ve kapağı bir otoklav kese kağıdına yerleştirin ve bir otoklavda sterilize edin.
- 3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazda 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyu ve cihaz kapağı kapağı vardır) (3D dosyalar eklenmiştir).
- Kültür ortamı (0,5 saat)
- Biyolojik bir kaputun içinde, aşağıdakileri karıştırın (50 mL tüpte): 37 mL Iscove Modifiye Dulbecco'nun Ortası (IMDM), 10 mL KSR serum replasmanı, 1 mL B27 takviyesi, 0,5 mL N2 takviyesi, 0,5 mL 1 M HEPES tamponu ve 0,5 mL esansiyel olmayan amino asitler.
- Tüm ortamı filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
- Boru ve cerrahi takım hazırlama
- Giriş lümen, giriş kuyusu, çıkış lümen ve çıkış kuyusu (12 kısa tüp ve 12 uzun tüp) için uygun boru uzunluğunu kesin. Tüpün her iki tarafına uygun bir adaptör bağlayın.
- Cerrahi aletleri hazırlayın: düz makas, 4x ince kanat ve 2x keskin eleps.
- Tüpleri ve cerrahi aletleri bir otoklav kağıt torbasına yerleştirin ve bir otoklav kullanarak sterilize edin.
- Işıltı girişini hazırlayın (istenen stimülasyon - bakteri, dışkı, ilaçlar vb.).
- Deneyden önce, bakteri kültürünün bakteri yükünü, seri seyreltmeler12ve aerobik ve / veya anaerobik koşullar altında kültürü belirleyin.
- Bakteri yükünü hesapladıktan sonra, gerekli bakteri konsantrasyonu elde etmek için steril doku kültürü ortamında bakteri kültürlerini seyreltin. Dışkı örnekleri için 100 μm süzgeç kullanarak filtreleyin.
NOT: Nonbakteriyel stimülasyon (ilaçlar, metabolitler vb.) için, bağırsak kültürü ortamını kullanarak maddeyi gerekli konsantrasyona seyreltin.
2. Deneme kurulum hazırlığı
- Organ kültürü inkübatörünün içinde, ısıtıcı ünitesini açın ve 37 ° C'ye ayarlayın.
- Pompaların yanı sıra giriş ve çıkış şırınnalarını da kurun.
- Doku kültürü ortam girişi
- Biyolojik veya laminer akış davlumbazında, giriş kuyusu şırınnalarını tam kültür ortamı ile doldurun. Son hacim deneyin süresine ve akış hızına bağlıdır; genellikle 1 mL/h artı temizleme için ek ortam.
- Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.
- Giriş şırınnalarını temizle. Kuyu ortamının tüm tüplerden atık bir cama aktığından emin olun.
- Işıltılı giriş
- Işınlama giriş şırınglarını stimülasyon tedavisi (bakteri, ilaç vb.) ile doldurun. Hacim, denemenin süresine ve akış hızına bağlıdır (genellikle 30 μL / s artı temizleme için ek ortam).
- Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.
- Giriş şırınmalarını temizle. Stimülasyonun tüm tüplerden atık bir bardağa aktığından emin olun. Farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat edin.
- Çıkış
- Boş şırıngları çıkış şırıngır pompalarına yerleştirin (pompa modunu 'çekilme' olarak ayarlayın).
- Cihaz kurulumu
- Gaz karışımını (%95 O 2 +%5 CO2)kontrol eden regülatörü hafif ve minimum bir akış için ayarlayın.
- Cihazı laminar kaputta inceleyin.
- İğneleri yıkamak için cihazın iğnelerini steril IMDM ile yıkayın.
- Cihazın her kuyusuna 500 μL steril kültür ortamı ekleyin.
- Doku diseksiyonu için hazırlık
- Steril cerrahi aletleri laminar kaputun içine koyun.
- 10 mL'lik bir şırıngayı steril IMDM ile doldurun ve kolonun yıkanması için steril (otomatik kapatılmış) 22 G künt uçlu bir iğne bağlayın.
3. Organ kültürleri
- Farelerin kurban ve doku diseksiyonu
- Laminar bir başlıkta, 12-14 günlük fareleri kafa keserek kurban edin. Fareleri% 70 etanol ile püskürtün ve fareleri plastik bir tabağa yerleştirin.
- Keskin makas ve tokmaklar kullanarak fareyi parçalara ayırın ve tüm yağ ve bağ dokularını keserek sindirim sistemini mideden anüse kadar çıkarın. Kolonu kesin ve yeni bir tabağa yerleştirin.
NOT: Kolon dokusu ile teması en aza indirin. Kolon dokusunun orta kısmına dokunmayın. Dokuyu nazikçe ve sadece dokunun kenarlarında tutun.
- Kolon yıkama ve yıkama
- Diseksiyon mikroskobu altında, kolon içeriğini steril IMDM (proksimal tarafa) ile hazırlanan 10 mL şırıngayla (adım 2.7.2) hafifçe yıkayın. Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0,5 mL steril IMDM ile dolu yeni bir 6 kuyu plakasına yerleştirin.
- İki nokta üst üste aygıtı bağlama
- Dokuyu alın ve 22 G iğneye dikkatlice bağlayın ve iki iplikle sıkı bir bağ yapın. Bu noktada, kolonun lümen akışına doğru yönelimini korumak zorunludur (proksimal = giriş, distal = çıkış). 6 doku için de 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.
- Giriş iğnesi Luer kilitlerinin ortamdan boş olduğunu doğrulayın. Değilse, boşaltın. Giriş iğnesi Luer kilidine stimülasyonlar ekleyin (hava kabarcıklarının lümene girmesini önlemek için). Uygun uyarılma ile her iki nokta üst üste için bu adımı tekrarlayın.
- Tüm dokuların bağlı olup olmadığını kontrol edin ve kapak kapağını cihazın üzerine yerleştirin.
- Organ kültürü cihazının pompalara bağlanması
- Cihazı önceden ısıtılmış sıcaklık kontrollü odaya (37 °C) yerleştirin.
- Gaz akışını bağlayın
- Uygun giriş iğnesini kullanarak gaz adaptörünü kapak kapağına bağlayın.
- Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın.
NOT: Proksimal kolon tarafını giriş küvetlerine bağlayın.
- Lümeni stimülasyon girişleriyle arındırın.
- Işıklı stimülasyonu bağırsaktan hafifçe geçirin ve çıkış tüplerindeki orta akışı doğrulayın.
- Harici ortamı yıkayın.
- Harici ortamı 3 kez yıkayın (pompaları hem giriş hem de çıkış için 600 μL/ dk hızında ayarlayın). Her yıkama 1 dakika sürer (kuyuyu boşaltarak başlar).
- Deneye başlayın.
- Pompaları aşağıdaki oranlarda başlatın:
Akış hızı: lümen: giriş- 30 μL/h, çıkış- 35 μL/h
Harici ortam: giriş- 1000 μL/h, çıkış- 950 μL/h
NOT: Deneme süresi 30 dakika ile 24 saat arasında değişebilir.
- Pompaları aşağıdaki oranlarda başlatın:
- Deney sonu (kolon organ kültürleri için 24 saate kadar)
- Tüm tüpleri cihazdan çıkarın.
- Dokuları iğnelerden ayırın ve istenen okumalara devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bağırsak organ kültürü sistemi doku canlılığını korur ex vivo. Doku canlılığının değerlendirilmesi kültür dönemi boyunca yapıldı. Kolon dokusu parçaları bağırsak organ kültürü sisteminde inkübe edildi ve 2/12/24 saat kültürü takiben sabitlendi. Bağırsak epitel hücre (IEC) tabaka bütünlüğü E-cadherin ve sitokeratin-18 antikorları kullanılarak immünofluoresans lekelenmesi ile doğrulandı. Aynı şekilde, ki-67 boyama ile belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu kadeh hücreleri ve lümen içindeki mukus salgısı, kolonik mahzenlerde çoğalma IEC'si tespit edilmiştir (Şekil 2). Bu sonuçlar ve diğerleri9 bağırsak kültürü sisteminin bağırsak fonksiyonunu ve yapısını koruduğunu göstermektedir ex vivo.
Hızlı transkripsiyonel konak yanıtı, segmentli filamentli bakteriler (SFB) ile bağırsak kolonizasyonu ile tetiklendi. Bağırsakta indüklenen ilk olayları incelemek için iki farklı immünomodülatör bağırsak mikrobu ile kolonizasyon kullanıldı. Birincil mikrop, daha önce ince bağırsakta Th17 hücresinin farklılaşmasına neden olduğu gösterilen segmentli filamentli bakteriler (SFB)idi 13. SFB negatif SPF fareleri kurban edildi ve ince bağırsak (SI) (ileum) segmentleri parçalanarak bağırsak organ kültürü sistemine bağlandı. SFB'nin in vitro14'ükültürü zor olduğundan, organ kültürleri SFB monokolonize farelerden15 veya GF farelerinden dışkı peletlerinin kontrol olarak askıya alınmasıyla aşılandı. SFB, bağırsak epiteline yapışarak Th17'yi indükler13,16. Böylece bağırsak dokusunun ex vivo kolonizasyonu sonrası SFB'nin mekansal lokalizasyonunun erken değerlendirilmesi gerekti. Gösterildiği gibi (Şekil 3a), tipik SFB filamentleri SI villi ile yakın ilişki içinde floresan in situ hibridizasyon (FISH), SFB girişinden sonra 2 saat kullanılarak tespit edilmiştir. Ek olarak, bir iletim elektron mikroskopisi SFB'yi SI epitel fırça sınırının birkaç mikron içinde sundu (Şekil 3b). Bu noktada, Yissachar ve arkadaşları SFB'nin ince bağırsak epitel ile birincil ilişkisinin dokuda transkripsiyonel bir yanıtı aktive edip etmediğini inceledi. Tüm doku örneklerinin gen ekspresyon profilleri, üç taraflı olarak, SFB ile infüzyondan 2 saat sonra üretildi. Kontrol kültürleri GF veya B.fragilis-monokolonize farelerin dışkı süspansiyonları ile aşılandı (Th17 indükleyici olmayan bir kontrol olarak). Şekil 3c, SFB tarafından ikna edilen değişikliklerin GF kontrolüne kıyasla çoğunlukla küçük genlikte olduğunu göstermektedir.
Şekil 2: Bağırsak organ kültürü sistemi doku canlılığını korur ex vivo. Mucin-2 ve Sitokeratin-18 (üstte), E-cadherin (ortada) ve Ki-67'nin (altta) immünoresans lekelenmesi. Bağırsak organ kültürü cihazında 2/12/24 saat kültürlenmiş taze parçalanmış kolon doku ve dokularının konfokal görüntülemesi. Ölçek çubuğu, 40 mm. Bu rakam Yissachar ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mukozal ilişki ve SFB tarafından tipik bir imzanın hızlı transkripsiyonal tetiklenilmesi. (A, B) SFB,(A) FISH tarafından SFB'ye özgü prob (kırmızı) veya (B) elektron mikroskopisi ile görselleştirilen kültürlü ince bağırsak segmentinde 2 saat sonra bağırsak epitel ile ilişkilidir. (C) SFB ile bağırsak gen ekspresyonunun indüksiyonu. SI organ kültürleri, SFB monokolonize farelerden veya GF kontrollerinden dışkı içeren mikroplarla aşılandı ve tüm dokuda gen ekspresyonunun mikroarray profillenmeden önce 2 saat boyunca kültürlendi. SFB veya GF aşılı kültürleri karşılaştıran bir ''volkan arsası'' üzerindeki gen ifadesindeki değişiklikler. SFB tarafından tüm SI in vivo olarak yukarı veya aşağı düzenlenmiş transkriptler vurgulanır (sırasıyla kırmızı ve mavi). Bu rakam Yissachar ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, Yissachar ve arkadaşlarının yakın zamanda geliştirdiği ex vivo gut organ kültürleri için optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır(yayınlanan 9 ve yayınlanmamış veriler). Bağırsak organ kültürü sistemi, parlak akışı korurken sağlam bağırsak parçalarının çok yönlü kültürünü destekler. İl içi ve ekstra-luminal ortam (stimülasyon dozu, maruz kalma süresi ve akış hızı dahil) üzerinde tam kontrol sağlar ve naif bağırsak dokusu yapısını ve hücresel karmaşıklığını korur9.
Protokoldeki kritik adımlar şunlardır. (1) Doku diseksiyonu, doku hasarını en aza indirmek için en az sürede ve çok nazikçe yapılmalıdır (bu da hücre ölümüne ve hasarlı siteler aracılığıyla ışık içeriğinin sızmasına neden olabilir). (2) Giriş portunu proksimal kolona, çıkış portunu da kolonun distal ucuna bağlayarak cihazdaki doku yönlendirmesini koruyun. (3) Bağırsakları cihaza bağladıktan sonra, dokunun sağlam olduğundan ve bağlantı noktalarının ışık içi bağlantı noktalarına sızmadığından emin olun. Bu, bakteriyel stimülasyonu lümenin içinde tutacak ve mümkün olduğunca steril tutulması gereken dış ortamı kirletmeyecektir. (4) Dokular 12-14 günlük farelerden ayrılmalıdır. Genç farelerde, kolon daha küçük ve daha yumuşaktır ve farklı kullanım ve kültür koşulları gerektirir (veriler gösterilmez). Yaşlı farelerden gelen dokular, doku canlılığını ve kültür süresini etkileyen önemli ölçüde daha büyüktür. (5) Bağırsak tepkilerindeki değişkenliği azaltmak için, her cihazda çöp arkadaşı farelerden parçalanmış dokuları kullanın (in vivo deneysel tasarıma benzer şekilde endojen mikrobiyom bileşimindeki değişkenliği azaltın).
Bağırsak kültürü sisteminin mevcut sınırlamaları şunlardır. (1) Her cihaz, bir denemede test edilebilen farklı koşulların sayısını sınırlayan altı kanal içerir. (2) Dokular 12-14 günlük farelerden ayrılmalıdır (yukarıya bakın); böylece enterik bağışıklık sistemi ve epitel bariyeri nihai olgunlaşmaya ulaşmamıştır. (3) Kültür süresi 24 saati aşarsa kültürde doku canlılığı bozulur (kolon dokuları için ince bağırsak için daha az). (4) Bu protokol özel ekipman satın alınmasını gerektirir (yani şırıngır pompaları, özel yapım inkübatör ve diğerleri).
Özetle, bağırsak organ kültürü sistemi, basit in vitro testlerden karmaşık in vivo deneylere kadar ara deneysel bir adım görevi görür. Bu sistemin önemli ve benzersiz bir avantajı olan bağırsak fizyolojisinin korunması (in vivo modellerine çok benzer) ile yüksek kontrol edilebilirliğin (basit in vitro testlerde olduğu gibi) bir kombinasyonunu sunar. Bu avantaj, farelerde kolayca yapılamayan deneyleri kolaylaştırır (yani, bağırsakta yaşayan hücrelerin erken yanıtlarını yüksek zamansal çözünürlükte izlemek). Son zamanlarda, bağırsak mikrobiyomu (spesifik mikroplar ve tüm insan kaynaklı mikrobiyota) ile bağırsak bağışıklık ve sinir sistemleri arasında bazı şaşırtıcı bağlantılar keşfetmemizi sağladı9,10. Genel olarak, bu güçlü ve benzersiz araç çok çeşitli okuma teknikleri (yeni nesil sıralama, görüntüleme, hücre sıralama ve daha fazlası dahil) ile birleştirilebilir ve sağlık ve hastalıkta konak mikrobiyom etkileşimleri hakkında bazı yeni içgörüler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yissachar laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine bağırsak organ kültürü sistemi protokolünü optimize etmedeki değerli katkıları için teşekkür ederiz. Yael Laure'ye makalenin eleştirel düzenlemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (3114831 No. hibe), İsrail Bilim Vakfı - Broad Institute Ortak Programı (8165162 Sayılı hibe) ve gassner Tıbbi Araştırma Fonu, İsrail tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
References
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
- Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
- Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
- Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
- Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
- Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
- Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
- Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).
