Summary
Здесь мы представляем метод визуализации образования троичного комплекса между тремя белковыми партнерами с использованием флуоресцентных помеченных белков с помощью анализа FRET-FLIM на основе BiFC. Этот метод ценен для изучения белково-белковых комплексов взаимодействия in vivo.
Abstract
Белково-белковые взаимодействия являются неотъемлемой частью всех биологических процессов в клетках, поскольку они играют решающую роль в регулировании, поддержании и изменении клеточных функций. Эти взаимодействия участвуют в широком спектре явлений, таких как сигнальная трансдукция, реакция патогена, взаимодействие клеток с клетками, метаболические процессы и процессы развития. В случае транскрипционных факторов эти взаимодействия могут привести к олигомеризации субъединиц, секвестрации в конкретных субклеточных контекстах, таких как ядро, цитоплазма и т. Д., Что, в свою очередь, может оказать более глубокое влияние на экспрессию нисходящих генов. Здесь мы демонстрируем методологию визуализации трехстороннего взаимодействия in vivo с использованием бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) с использованием флуоресцентной пожизненной визуализации (FLIM). Два белка, выбранных для этой демонстрации, взаимодействуют как партнеры BiFC, и их восстановленная флуоресцентная активность используется для анализа FRET-FLIM с третьим партнером. Четыре-пятинедельные растения Nicotiana benthamiana, выращенные в камере роста, были использованы в качестве модельной системы растений для этой демонстрации.
Introduction
Белково-белковые взаимодействия (ИПП) составляют основу правильного функционирования эукариотических клеток, регулируя различные метаболические процессы и процессы развития. Некоторые ИЦП являются стабильными, в то время как другие носят преходящий характер. Взаимодействия могут быть классифицированы на основе количества и типа членов во взаимодействии, таких как димерные, тримерные, тетрамерные гомомерные и гетеромерные1. Идентификация и характеристика белковых взаимодействий может привести к лучшему пониманию функций белка и регуляторных сетей.
Факторы транскрипции — это белки, которые участвуют в регуляторных функциях. Они регулируют скорость транскрипции своих нисходящих генов, связываясь с ДНК. Иногда олигомеризация или образование белков комплексов высшего порядка является предпосылкой для выполнения их функций2. Факторы транскрипции РАСТЕНИЙ MADS-box представляют собой гомеотические гены, которые регулируют различные процессы, такие как переход флоры, развитие цветочных органов, удобрение, развитие семян, старение и вегетативное развитие. Известно, что они образуют комплексы высшего порядка, которые связываются с ДНК3,4. Изучение сетей PPI среди факторов транскрипции и их интеракторов дает представление о сложности, лежащей в основе транскрипционной регуляции.
Транзиторная экспрессия белка в Nicotiana benthamiana была популярным подходом к изучению локализации белка или белково-белковых взаимодействий in vivo5. BiFC и FRET являются методами изучения белково-белковых взаимодействий in vivo с использованием флуоресцентных репортерных систем6. Было показано, что комбинация этих двух методов раскрывает взаимодействие между тремя белками7. FRET измеряется с использованием акцепторного фотоотбеливания, сенсибилизированного излучения и метода флуоресцентной визуализации (FLIM). Анализ FRET на основе FLIM появился как инструмент, который обеспечивает точную количественную оценку и пространственно-временную специфичность для измерений передачи энергии между двумя молекулами на основе их флуоресцентного времени жизни8. FLIM измеряет время, в течение которого флуорофор остается в возбужденном состоянии до испускания фотона, и лучше, чем методы, которые используют только измерения интенсивности9,10. Помимо гетерологичных систем, таких как Nicotiana benthamiana и луковые эпидермальные пилинги, более поздние отчеты продемонстрировали использование корней Arabidopsis и молодых саженцев риса и т. Д. Для анализа in vivo белково-белковых взаимодействий в нативных условиях11,12.
Помимо подходящей системы выражения, выбор взаимодействующих партнеров для анализов BiFC и FRET также имеет решающее значение для успеха этого эксперимента. PPI среди партнеров, используемых в конфигурации BiFC, должен быть проверен с использованием соответствующих элементов управления перед их использованием в качестве сопряженного партнера в эксперименте FRET13. BiFC использует структурное дополнение N- и C-концевых частей флуоресцентного белка. Общим ограничением в большинстве, если не во всех флуоресцентных белках, используемых в анализах BiFC, была самосборка между двумя производными нефлуоресцентными фрагментами, способствующая ложноположительной флуоресценции и уменьшающая отношение сигнал-шум (S / N)14. Последние разработки, включая точечные мутации или положение расщепления флуоресцентного белка, дали начало парам BiFC с повышенной интенсивностью, более высокой специфичностью, высоким соотношением S/N15,16. Эти флуоресцентные белки также могут быть использованы для проведения BiFC в зависимости от пригодности эксперимента.
Традиционно CFP и YFP использовались в качестве пары донора и акцептора в экспериментах FRET17. Тем не менее, было обнаружено, что YFP или m-цитрин являются лучшими донорами FRET (при использовании с RFP в качестве акцептора) из-за высокого квантового выхода (QY) во время нативной экспрессии целевых белков в корневой системе Arabidopsis. Выбор промоторов (конститутивных и нативных/эндогенных) и флуорофоров также играет решающую роль в разработке успешного эксперимента BiFC-FRET-FLIM. Важно отметить, что эффективность доноров FRET и пригодность пар FRET, как правило, меняются с изменением промотора и биологической системы, используемой для экспрессии. QY флуорофора, который относится к его яркости, зависит от рН, температуры и используемой биологической системы. Мы предлагаем тщательно рассмотреть эти критерии, прежде чем выбирать пару флуорофоров для эксперимента FRET. Биологическая система, промоторы и белки, используемые для этого протокола, хорошо работали с флуорофорами CFP-YFP для эксперимента BiFC FRET-FLIM.
В настоящем исследовании мы включили функцию FLIM для визуализации взаимодействия между тремя белковыми молекулами с использованием FRET на основе BiFC. В этом методе два белка помечаются разделенным белком YFP, а третий белок — CFP. Поскольку мы были заинтересованы в изучении взаимодействия гомодимера белка MADS-box (M) с белком датчика кальция (C), эти белки были помечены флуоресцентными белками в векторах pSITE-1CA и pSITE-3CA18. Два из взаимодействующих партнеров в этом анализе были помечены N- и C-концевыми частями YFP в векторах pSPYNE-35S и pSPYCE-35S19,и их взаимодействие приводит к восстановлению функционального YFP, который действует как акцептор FRET, к третьему взаимодействующему партнеру, который помечен CFP (действуя как донор FRET)(рисунок 1 ). В этом конкретном случае PPI между двумя мономерами M и между M и C был проверен путем выполнения BiFC в трех различных системах вместе с дрожжево-двухгибридной системой. Эти векторы были мобилизованы в штамм Agrobacterium tumifaciens GV3101 путем электропорации. Штамм GV3101 имеет обезоруженную Ti плазмиду pMP90 (pTiC58DT-ДНК) с резистентностью к гентамицину20. Штамм p19 Agrobacterium добавляли вместе со всеми инфильтрациями для предотвращения глушения трансгенов21. Мы рекомендуем, чтобы три белка также использовались в противоположных конформациях для проверки трехсторонних взаимодействий.
В этом методе мы использовали FLIM, где сначала время жизни флуоресценции донора (срок службы неутоленного донора) измеряется при отсутствии акцептора. После этого его срок службы измеряется в присутствии акцептора (закаленный срок жизни донора). Эта разница в времени жизни донорской флуоресценции используется для расчета эффективности FRET, которая зависит от количества фотонов, демонстрирующих сокращение времени жизни флуоресценции. Ниже приведен подробный протокол для определения образования троичного комплекса между любыми тремя белками путем временной экспрессии флуоресцентных помеченных белков в Nicotiana benthamiana и анализа их взаимодействия с помощью BiFC-FRET-FLIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клонирование генов во входных и целевых векторах(рисунок 2)
- Амплифицировать кодирующую последовательность (CDS) интересующих генов (генов M и C в нашем случае) с помощью ПЦР и клонировать их в соответствующих входных векторах (например, векторе pENTR/D-TOPO; см. таблицу 1 для векторов, используемых в этом эксперименте).
- Выращивайте клоны на пластинах, содержащих антибиотики. Валидировать клоны, которые отбираются на антибиотиках путем рестрикции пищеварения и секвенирования ДНК22,23.
- Мобилизовать восстановленные CDS из входных клонов к векторам назначения (pSPYNE-35S, pSPYCE-35S, pSITE-1CA и pSITE-3CA) и подтвердить перенос последовательностей от входа к векторам назначения путем переваривания фермента рестрикции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все векторы, используемые в этом эксперименте, перечислены в таблице 1. - Наконец, преобразование клеток Agrobacterium GV3101 (pMP90 (GentR))с векторами назначения путем электропорации(рисунок 3)24.
2. Условия роста растений Nicotiana benthamiana
ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивайте растения Nicotiana до 4-6 листовой стадии в контрольных условиях.
- Для выращивания растений Nicotiana подготовьте почвенную смесь, смешав коммерчески доступные почвенные смеси с кокопеатом и компостом в соотношении 2:1:1.
- Выложите слой этой почвенной смеси толщиной 1 дюйм в пластиковый лоток, чтобы сделать почвенное ложе и насытить его деионизированной водой. Посыпьте около 200 семян в эту почвенную грядку.
- Переложите его в больший лоток, содержащий 1 см стоячей воды. Накройте этот лоток полиэтиленовой пленкой, чтобы создать влагозащищенную камеру.
- Перенесите эту установку в камеру роста, установленную при 23 °C с 16-часовым световым и 8-часовым темным циклом с интенсивностью света 150-170мкмоль/м2с.
- Через две недели перенесите молодые саженцы в небольшие, 3-4-дюймовые горшки, содержащие насыщенную водой почвенную смесь.
- Поместите эти горшки в пластиковые лотки и переложите их в камеру роста еще на четыре недели.
3. Подготовка бактериальных штаммов к агроинфильтрации
ПРИМЕЧАНИЕ: Для агроинфильтрации бактериальные штаммы должны быть свежевыращены и смешаны вместе со штаммом p19 Agrobacterium в соответствующих соотношениях.
- Приготовьте агаровые пластины 2xYT, содержащие рифампицин (100 мкг/мл), гентамицин (25 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл) для агробактерий, содержащих вектор pSPYNE-35S и pSPYCE-35S. Для штамма, содержащего вектор pSITE, используйте рифампицин (100 мкг/мл), гентамицин (25 мкг/мл) и спектиномицин (50 мкг/мл).
- Прореживайте штаммы Agrobacterium, содержащие плазмиды на этих пластинах, используя стерильные петли прививки в ламинарной вытяжке.
- Инкубируйте их при температуре 28 °C в течение 48 ч в темноте.
- Начните эту процедуру с инокуляции штамма Agrobacterium GV3101, содержащего конструкции BiFC и FRET (приготовленные в векторах pSPYNE-35S, pSPYCE-35S и pSITE) из полосатых пластин в 10 мл бульона 2xYT, содержащего соответствующие антибиотики (рифампицин (100 мкг/мл), гентамицин (25 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл) или спектиномицин (50 мкг/мл)).
- Кроме того, инициируют культуру штамма агробактерий p19 путем инокуляции 10 мл бульона 2xYT, содержащего рифампицин (100 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: штамм p19 добавляется для предотвращения глушения трансгенов. - Накройте колбу алюминиевой фольгой и держите ее в шейкере инкубатора при температуре 28 °C и 170 об/мин в течение 16 часов в темноте.
- После ночного роста переложите 1 мл этой культуры в одноразовую кювету для измерения оптической плотности (O.D.) культур при 600 нм с помощью спектрофотометра.
- Смешайте культуры соответствующего партнера BiFC и FRET, содержащие штаммы, таким образом, чтобы конечный O.D. каждой культуры составлял 0,5, а p19 - 0,3 в общем объеме 2 мл.
- Для достижения этих соотношений используйте формулу, указанную ниже:
Полученный OD = O.D. культуры, измеренной при 600 нм
Vкультура = Объем требуемой культуры
Odfinal = 0,5 для конструкций и 0,3 для p19
Vfinal = Конечный объем для инфильтрации, который составляет 2 мл
ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинации конструкций, используемые в данном исследовании, указаны в таблице 2. - Центрифугируйте смешанные культуры Agrobacterium при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно выбрасывайте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 2 мл свежеприготовленного инфильтрационного буфера (10 мМ MES, 100 мкМ ацетосиргинона и 10 мМMgCl2). Используйте вихревой смеситель, чтобы сделать однородную клеточную суспензию.
- Инкубируют трубки, содержащие повторно суспендированные клетки, в темноте при комнатной температуре в течение 3 ч.
- Между тем, маркируйте каждый горшок с растением конструкционной смесью, в которую он будет проникать. Используйте два растения для каждой инфильтрационной смеси.
- Наполните 1 мл безыгольчатого шприца агробактериальной смесью. Осторожно, но плотно прижмите шприц к абаксиальной стороне полностью расширенного листа, поддерживая лист с другой стороны. Осторожно толкайте плунжер до тех пор, пока растворы не заполнятся в области листа, эквивалентной 2-3-кратному кончику шприца.
- Проникают до четырех пятен на листе и 3-4 листа на растение, как показано на рисунке 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте перчатки или протирайте перчатки 70% спиртом между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. - Переложите все горшки в лоток и высиживайте в камере роста в тех же условиях, которые указаны в шаге 2.
- Проверьте небольшую часть агроинфильтрованного листа в разные моменты времени с помощью флуоресцентного микроскопа. Когда флуоресценция как от YFP, так и от CFP обнаруживается в клетках, перейдите к конфокальному микроскопу для анализа BiFC-FRET FLIM. В этом эксперименте анализ проводили через 3 дня после агроинфильтрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите период инкубации после агроинфильтрации индивидуально для каждого промотора и комбинации генов, чтобы избежать чрезмерной экспрессии химерных белков, используемых в анализе BiFC-FRET FLIM. Сверхэкспрессия партнерских белков может привести к ложноположительным взаимодействиям.
4. Подготовьте слайды для флуоресцентной визуализации
- Когда растения будут готовы к визуализации, вырежьте квадратные образцы листьев, на расстоянии 5-8 мм от инфильтрационной раны, и установите их в дистиллированную воду на чистых горках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму фоновую флуоресценцию, очистите слайды 80% этанолом, а затем дистиллированной водой 3-4 раза, высушите их на воздухе и держите на абсорбирующем листе. - Накройте образец листа чистым обшивочным листом и запечатайте ногтевой эмалью.
- Визуализируйте эти образцы под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом.
5. Анализ FRET-FLIM с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: В данной процедуре основой определения и количественной оценки взаимодействия между двумя белками является сокращение времени жизни флуоресценции партнера-донора FRET при его взаимодействии с акцептором, которое используется для расчета эффективности FRET. Сложность в случае трехстороннего взаимодействия еще больше возрастает, потому что FRET-акцептор в этом случае представляет собой не одну молекулу, а расщепленную пару YFP-BiFC, которая сначала должна быть восстановлена in vivo, чтобы стать функциональным FRET-акцепторным флуорофором. Для проведения FRET-FLIM необходимо определить время жизни флуоресценции донорской молекулы - сначала в одиночку, а затем в присутствии партнера FRET.
- Откройте приложение FLIM в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе, запустите консоль и используйте подсчет фотонов с распознаванием образов для измерения срока службы флуоресценции. Выберите стандартный режим измерения «Подсчет всех фотонов».
- Проанализируйте образцы двух типов агроинфильтрированных растений: один только с донором (C-CFP), а другой с донором и акцептором (C-CFP, наряду с M-YFP).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку взаимодействие М-белка уже было подтверждено с С-белком с использованием BiFC и Y2H, ожидается хорошая эффективность FRET с этой взаимодействующей парой. - Затем отсканируйте агроинфильтрированный лист C-CFP и сосредоточьтесь на клетке, показывающей хорошую флуоресценцию CFP. Инициировать режим лазерного сканирования и настроить систему визуализации CFP и измерений FLIM (λex 440 нм импульсный лазер, λem 480-520 нм гибридными детекторами, скорость сканирования 512 x 512 пикселей при 400 Гц).
- Отрегулируйте фокусировку, масштабирование и интеллектуальное усиление, чтобы сосредоточиться на области, которую необходимо захватить.
- Освещайте образец при достаточной мощности лазера для достижения захвата примерно 0,1 фотона на импульс. Для образцов с переменной интенсивностью флуоресценции захватите 50 кадров для сбора адекватных фотонов, необходимых для измерения срока службы. CFP демонстрирует два срока службы флуоресценции из-за его конформационной адаптации; поэтому подгоняйте данные с помощью n-экспоненциальной модели реконволюции, сохраняя при этом значение n равным 2.
- При этих настройках CFP показывает два времени жизни 1,0 и 3,2 нс. Здесь более высокий, 3,2 нс, срок службы используется для всех последующих расчетов25,26.
- Чтобы рассчитать эффективность FRET с помощью FLIM, который является мерой степени взаимодействия между двумя белками, возьмите образец листа, который был совместно инфильтрирован с C-CFP и M-YFP. Ищите ячейку, которая экспрессирует как C-CFP, так и M-YFP, и подтверждайте их соответствующие модели излучения, возбуждая их с помощью импульсного лазера λex 440 нм, λem 480-520 нм и λex 514 нм лазера белого света с λem 526-550 нм. Последовательно сканируйте и идентифицируйте клетку, которая показывает флуоресценцию CFP и YFP.
- После подтверждения флуоресценции обоих белков переключитесь на консоль FLIM для измерения времени жизни CFP, используя те же настройки, которые мы использовали ранее для измерения времени жизни C-CFP (шаг 5.5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта клетка также экспрессирует M-YFP, который потенциально может взаимодействовать с C-CFP и вызывать сокращение времени жизни C-CFP. - Подойдите к графу, полученному с помощью n-экспоненциальной модели реконволюции, с n = 2. Наблюдалось снижение времени жизни CFP с 3,2 до 2,6 нс, что указывает на резонансную передачу энергии Фёрстера между CFP и YFP(рисунок 5A).
- Теперь запустите консоль FRET в программном обеспечении и рассчитайте эффективность FRET, вручную введя срок службы неугашенного донора в уравнение, представленное в программном обеспечении. А наблюдаемая эффективность FRET составляет: 56%.
- Трехстороннее взаимодействие
- Наконец, чтобы визуализировать взаимодействие между тремя партнерами, возьмите образец листьев у растения, которое было совместно инфильтрировано с C-CFP, M-YFPn и M-YFPc.
- Сканируйте эксплант листьев на предмет клетки, которая показывает как CFP, так и восстановленную флуоресценцию YFP, исходящую от взаимодействия BiFC между двумя M-белками. Используйте те же длины волн лазера и излучения, что и ранее.
- Впоследствии выключите 514-нм лазер и перейдите на консоль FLIM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если димер M-YFP взаимодействует с C-CFP, следует увидеть сокращение времени жизни C-CFP, наблюдаемое во время его взаимодействия с M-YFP. Однако, если C-CFP не взаимодействует с димером M-YFP, его время жизни флуоресценции должно оставаться на уровне 3,2 нс. - Используя настройки, аналогичные упомянутым выше, измерьте срок службы CFP в присутствии восстановленного YFP. Подойдите к графу, полученному с помощью n-экспоненциальной модели реконволюции, с n = 2, и перейдите к консоли FRET.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдается снижение срока службы CFP с 3,2 до 2,3 нс. Рассчитайте эффективность FRET, как описано выше. Расчетный КПД FRET составляет 55%. Сокращение срока службы донора и хорошая эффективность FRET на 55% подтверждают трехстороннее взаимодействие между двумя М-белками и С-белком in vivo (см. Рисунок 5В).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол представляет собой оптимизированный метод изучения in vivo трехсторонних белково-белковых взаимодействий в растениях. Основной принцип протокола заключается в объединении двух методов белкового взаимодействия с флуоресцентной меткой, то есть BiFC и FRET, для создания анализа для измерения образования троичного комплекса между тремя белковыми партнерами. Здесь мы использовали FLIM для измерения срока службы флуоресценции партнера-донора FRET в присутствии и отсутствии акцептора FRET. Ожидалось сокращение времени жизни флуоресценции донора, если между двумя белками наблюдалось положительное взаимодействие. Мы начали с измерения времени флуоресценции донора, то есть белка C-CFP. Мы использовали режим измерения «Подсчет всех фотонов», который создает кривую флуоресцентного распада со всеми фотонами в интересующей области (ROI) и дает измеренное время жизни с меньшей погрешностью, чем традиционный коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов. Высокоскоростной фильтр FLIM обеспечивает использование однофотонных событий между импульсами. Затем была выбрана подходящая математическая модель для попиксельных вычислений и подгонки кривой распада27.
Вариант CFP, используемый здесь (и также наиболее часто используемый), имеет конформационную адаптацию, которая приводит к двум срокам жизни флуоресценции. Поэтому мы решили подогнать кривую флуоресцентного распада, используя модель для многоэкспоненциального донора. Это приводит к разделению двух времен жизни CFP, которые в нашем случае наблюдались как 1,0 нс и 3,3 нс. Для расчета эффективности FRET мы использовали более высокий срок службы CFP, т.е. 3,3 нс (средний срок службы флуоресценции, n = 10).
В случае положительного контроля (C-CFP и M-YFP) мы наблюдаем снижение времени жизни флуоресценции донора (C-CFP) с 3,3 нс до 2,5 нс(рисунок 6). А эффективность FRET по следующему уравнению составила 56%.
E = эффективность ЛАД
τD = Срок службы неугашенного донора (образец только донора, C-CFP)
τ AvAmp = Среднее время распада - Средневзвешенный срок службы по амплитуде
Аналогичное упражнение с восстановленным YFP в результате взаимодействия между двумя мономерами M и С-белком также привело к положительному взаимодействию, ведущему к сокращению времени жизни флуоресценции акцептора (C-CFP) до 2,6 нс. Расчетная эффективность FRET в данном случае составила около 55%(рисунок 6).
Если вариант CFP или любой другой донорский флуорофор имеет одно время жизни флуоресценции, кривая распада должна быть подогнана с использованием моноэкспоненциальной донорской модели. В этом случае эффективность FRET может быть рассчитана по формуле:
τ - время жизни флуоресценции образца, содержащего только донора
τ закалка измеряется в присутствии акцептора (во время fret происходит)
Необработанные показания срока службы флуоресценции по меньшей мере из 10 ячеек для каждой экспериментальной установки были сопоставлены в виде точечной диаграммы с помощью онлайн-инструмента PlotsOfData (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/, рисунок 6C)28. Сокращение времени жизни флуоресценции донора FRET дает убедительные доказательства трехстороннего взаимодействия между этими тремя белками.
Рисунок 1:Схематическое представление принципа метода BiFC и BiFC FRET-FLIM. Взаимодействие между двумя M-белками приводит к восстановлению YFP, и эта пара может затем действовать как акцепторная молекула. Третий белок C-CFP выступает здесь в качестве донора FRET. Таким образом, положительный сигнал FRET доказывает трехстороннее взаимодействие между двумя М-белками и одним С-белком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Клонирование генов M и C в векторах конечного назначения. Кодирующие последовательности генов амплифицируются и сначала клонируются в векторе pENTR/D-TOPO с последующей мобилизацией конструкций в векторах конечного назначения pSITE-1CA, pSITE-3CA, pSPYNE-35S и pSPYCE-35S реакцией рекомбинации LR Clonase II. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Используя электропорацию, желаемые векторные комбинации доставляются в штамме GV3101 Agrobacterium tumefaciens. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Схематическая иллюстрация агроинфильтрации растений Nicotiana и комбинаций конструкций, используемых для эксперимента. (A)C-CFP, содержащая агробактериальную культуру, выступает в качестве донорского образца (B) C-CFP и M-YFP служат положительным контролем FRET, (C) C-CFP и M белок в конформации BiFC; M-YFPn и M-YFPc используются для изучения трехстороннего взаимодействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Представление времени жизни флуоресценции образцов при отсутствии и наличии акцептора. (A) Время жизни C-CFP в присутствии M-YFP уменьшается до 2,67 нс, как показано на гистограмме. Аналогично(B)показывает сокращение времени жизни C-CFP до 2,3 нс в случае трехстороннего взаимодействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Трехстороннее взаимодействие между двумя мономерами M и С-белком, проанализированным с использованием анализа FRET-FLIM на основе BiFC. (A)Клетка, показывающая либо только CFP (i), либо оба CFP и YFP (ii и iii), исходящие от донорских и акцепторных белков с использованием соответствующих длин волн возбуждения и излучения. (B)i, ii, iii представляет собой FLIM-изображение, показывающее время флуоресценции CFP в ячейке. Шкала цветов представляет псевдоцвет, соответствующий времени жизни. Шкала bar = 50 мкм. (C) Диаграмма рассеяния, показывающая время флуоресценции CFP при наличии в одиночку или с взаимодействующими партнерами, где n = 10. Сюжет генерируется с помощью онлайн-инструмента PlotsOfdata (https://huygens.science.uva.nl/PlotsOfData/); Среднее время жизни флуоресценции представлено в виде линии между точками образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Отрицательный контрольный эксперимент для валидации взаимодействия между белками M и C с помощью BiFC. Взаимодействие между мутированной формой M-белка (MΔCBD), в которой отсутствуют все области связывания С-белка, и слиянием С-белка-YFPc пытается служить отрицательным контролем для анализа BiFC. Верхние панели показывают переходную экспрессию MΔCBD-GFP в клетках луковой кожуры, а результаты попытки взаимодействия между MΔCBD-YFPn и C-YFPc показаны на нижних панелях. Отсутствие флуоресценции от восстановленного YFP свидетельствует об отсутствии взаимодействия между MΔCBD и С-белком. N, ядро; C, цитоплазма; BF, яркое поле; FL, флуоресценция; OL, цифровое наложение, цитоплазматическая область показана белыми стрелками. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| S.No. | Вектор | Подбор антибиотиков |
| Вектор записи | ||
| 1 | pENTR/D-TOPO | Канамицин |
| Векторы назначения | ||
| 2 | пСПАЙН-35С | Канамицин |
| 3 | пСПЫЦЕ-35С | Канамицин |
| 4 | pSITE-1CA | Спектиномицин |
| 5 | pSITE-3CA | Спектиномицин |
Таблица 1: Векторы, использованные в исследовании.
| S.No. | Взаимодействие | Комбинация конструкций |
| 1 | Трехстороннее взаимодействие | C-CFP + M-YFPn: M-YFPc + p19 |
| 2 | Позитивный контроль | C-CFP + M-YFP + p19 |
| 3 | Отрицательный контроль | C-CFP + Пустой-YFP + p19 |
| Опционально (противоположные конформации) | ||
| 4 | Трехстороннее взаимодействие | M-CFP + M-YFPn: C-YFPc + p19 |
| 5 | Позитивный контроль | M-CFP + C-YFP + p19 |
| 6 | Отрицательный контроль 1 | M-CFP + Пустой-YFP + p19 |
| 7 | Отрицательный контроль 2 | Пустой -CFP + C-YFP + p19 |
| 8 | Отрицательный контроль 3 | Пустой -CFP + M-YFP + p19 |
Таблица 2: Комбинации конструкций, используемые в исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол демонстрирует использование анализа FRET-FLIM на основе BiFC для установления образования троичного комплекса между двумя мономерами белка MADS-box и белка датчика кальция. Протокол адаптирован из отчета Y. John Shyu et al., где они разработали метод FRET на основе BiFC для визуализации троичного комплекса, образованного между гетеродимерами Fos-Jun и NFAT или p65 с использованием метода сенсибилизированной эмиссии7. Ранее трехфторофорная система FRET была разработана Гальперином и его коллегами в 2004 году29,но для этого требуется шесть фильтров, содержащих сложную настройку микроскопа. Кроме того, быстрое движение органелл, таких как эндосомы, во время получения изображения накладывало экспериментальные трудности. С другой стороны, FRET-FLIM на основе BiFC использует фильтры только для двух флуорофоров и имеет упрощенную настройку микроскопа. Эта настройка позволяет напрямую визуализировать троичный комплекс, в отличие от системы 3-FRET. Это также имеет преимущество перед системой BiFC-FRET в том, что она более надежна и количественна, чем измерения FRET, включающие сенсибилизированное излучение7. В этом анализе время жизни флуоресценции отдельных фотонов измеряется для расчета эффективности FRET, а не общих изменений относительной интенсивности флуоресценции донорских и акцепторных молекул. Еще одно преимущество метода на основе FLIM перед методом BiFC-FRET заключается в том, что необходимо измерять только время жизни донора; качества флуоресцентного излучения акцептора не влияют на результат измерений FRET. Преимущества и простота этого метода делают FRET-FLIM на основе BiFC более простым, простым и более количественным методом изучения трехсторонних взаимодействий. Тем не менее, нужно иметь доступ к конфокальной установке с импульсными лазерами, быстрыми детекторами, способными считать один фотон и совместимым программным обеспечением.
Для успеха этого эксперимента важно, чтобы взаимодействие между двумя белковыми партнерами, используемыми в конформации BiFC, было проверено с использованием нескольких методов и соответствующих элементов управления, прежде чем использовать их в качестве акцептора FRET. Желательно использовать отрицательные элементы управления, такие как мутированная форма взаимодействующего партнера или несвязанный колокализующий белок в качестве отрицательного взаимодействующего партнера16. Отрицательные средства контроля для проверки взаимодействий BiFC между белками M и C, используемые в этом протоколе, включали мутации в предполагаемом связывающем домене этих белков, которые полностью отменили сигнал BiFC(Дополнительный рисунок 1). Более того, это взаимодействие было также подтверждено методами Y2H и FRET в разных системах.
Также рекомендуется временная оптимизация экспрессии белков в Nicotiana, чтобы можно было свести к минимуму неблагоприятные последствия сверхэкспрессии белков, которые могут привести к ложноположительным результатам. Также необходимо включить штамм p19 вместе с агробактериальными штаммами, содержащими конструкции для предотвращения посттранскрипционного глушения генов. p19 является супрессором глушения генов от томатного кустистого каскадерского вируса и повышает эффективность трансформации до 90%30. В последнее время были разработаны более совершенные версии флуорофоров, а именно m-turquoise-SYFP2, SYFP2-mRFP и SCFP3a-SYFP2. Они могут быть использованы в качестве пар FRET в зависимости от их пригодности к целевой системе и типу клеток11. Измерения FRET-FLIM должны проводиться как минимум в десяти ячейках для получения статистически значимых данных. Там, где это возможно, добавление большего числа образцов в измерения еще больше повысит качество и надежность данных. В зависимости от донорского флуорофора следует выбрать математическую модель, соответствующую данным кривой распада времени флуоресценции.
Протокол, описанный здесь, является мощным инструментом для определения трехсторонних взаимодействий в живых клетках. Он помогает определить внутриклеточное расположение взаимодействующего комплекса, что важно при расшифровке функции и физиологического значения любого белкового комплекса. Он также может разрешать относительные концентрации взаимодействующего партнера на основе данных FRET-FLIM, которые не могут быть выяснены только методами измерения интенсивности10. В конечном счете, анализ FRET-FLIM на основе BiFC дает возможность изучить и охарактеризовать важные аспекты трехсторонних белковых взаимодействий, которые могут быть использованы как в животных, так и в растительных системах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
NB, GG, SB, KC искренне благодарят Комиссию по университетским грантам (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE и Совет по научным и промышленным исследованиям (CSIR) за их исследовательские стипендии. Мы с благодарностью выражаем признательность Департаменту биотехнологии (DBT), правительству Индии, Департаменту науки и техники (DST-FIST), правительству Индии за финансовую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
