Summary
Automatiserte analyser ved bruk av mikroplater med flere brønner er fordelaktige tilnærminger for å identifisere veiregulatorer ved å tillate vurdering av en rekke forhold i et enkelt eksperiment. Her har vi tilpasset den veletablerte makropinosomavbildnings- og kvantifiseringsprotokollen til et 96-brønns mikroplateformat og gir en omfattende disposisjon for automatisering ved hjelp av en flermodusplateleser.
Abstract
Makropinocytose er en ikke-spesifikk væskefaseopptaksvei som gjør det mulig for celler å internalisere stor ekstracellulær last, som proteiner, patogener og celleavfall, gjennom bulk endokytose. Denne banen spiller en viktig rolle i en rekke cellulære prosesser, inkludert regulering av immunresponser og kreftcellemetabolisme. Gitt denne betydningen i biologisk funksjon, kan undersøkelse av cellekulturforhold gi verdifull informasjon ved å identifisere regulatorer for denne veien og optimalisere forholdene som skal brukes i oppdagelsen av nye terapeutiske tilnærminger. Studien beskriver en automatisert bilde- og analyseteknikk ved hjelp av standard laboratorieutstyr og en multimodusplateleser for celleavbildning for rask kvantifisering av makropinocytisk indeks i tilhengerceller. Den automatiserte metoden er basert på opptak av fluorescerende dekstran med høy molekylvekt og kan brukes på 96-brønns mikroplater for å lette vurderinger av flere forhold i ett eksperiment eller faste prøver montert på glassdeksler. Denne tilnærmingen tar sikte på å maksimere reproduserbarhet og redusere eksperimentell variasjon samtidig som den er både tidsbesparende og kostnadseffektiv.
Introduction
Den ikke-spesifikke endokytiske banen til makropinocytose gjør det mulig for celler å internalisere en rekke ekstracellulære komponenter, inkludert næringsstoffer, proteiner, antigener og patogener, gjennom bulkopptak av ekstracellulær væske og dens bestanddeler1. Selv om det er viktig for biologien til mange celletyper, er makropinocytosebanen i økende grad beskrevet for å spille en viktig rolle i tumorbiologien, hvor tumorceller gjennom makropinocytisk opptak er i stand til å overleve og spre seg i nærvær av et næringsfattig mikromiljø2,3. Opptaket av ekstracellulære makromolekyler, inkludert albumin og ekstracellulær matrise, og nekrotisk celleavfall, gir en alternativ næringskilde for biomasseproduksjon ved å lage aminosyrer, sukker, lipider og nukleotider gjennom makropinosom og lysosomet fusjonsmediert lastkaboisme4,5,6,7,8.
Induksjonen og reguleringen av makropinocytose er kompleks og kan variere avhengig av cellulær kontekst. Så langt har flere indusere av makropinocytose blitt identifisert og inkluderer ligander, for eksempel epidermal vekstfaktor (EGF), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), galectin-3 og Wnt3A9,10,11,12,13. I tillegg kan dyrkingsforhold som etterligner tumormikromiljøet utløse aktivering av banen. Bukspyttkjertelkanal adenokarsinom (PDAC) svulster er næringsfattige, spesielt for aminosyre glutamin, noe som fører til at både kreftceller og kreftrelaterte fibroblaster (CAFs) er avhengige av makropinocytose for overlevelse7,13,14,15. Videre kan tumorspenninger, som hypoksi og oksidativt stress, aktivere denne scavenging pathway16. I tillegg til de mange ekstrinsiske påvirkerne som kan indusere makropinocytose, kontrollerer en rekke intracellulære veier makropinosomdannelse. Onkogen Ras-mediert transformasjon er tilstrekkelig til å initiere det makropinocytiske maskineriet, og flere krefttyper utviser onkogen Ras-drevet konstituerende makropinocytose4,5,9,17. Alternativt er villtype Ras-aktivering og Ras-uavhengige veier identifisert for å aktivere makropinocytose i kreftceller og CAFs10,11,15,18. Bruken av ulike in vitro-modeller i kombinasjon med inhibitorbehandlinger har resultert i identifisering av flere makropinocytosemodulatorer, som inkluderer natrium-hydrogenvekslere, den lille GTPase Rac1, fosfoinositid 3-kinase (PI3K), p21-aktivert kinase (Pak) og AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) 4,13,15 . Men gitt mangfoldet av beskrevne faktorer og forhold som regulerer makropinocytose, er det tenkelig at mange flere modulatorer og stimuli forblir uoppdaget. Identifisering av nye modulatorer og stimuli kan lettes ved automatisert vurdering av en rekke forhold i et enkelt eksperiment. Denne metoden kan belyse faktorene som er involvert i makropinosomdannelse og kan tillate oppdagelsen av nye små molekyler eller biologer som retter seg mot denne veien.
Her har vi tilpasset vår tidligere etablerte protokoll for å bestemme omfanget av makropinocytose i kreftceller in vitro til et 96-brønns mikroplateformat og automatisert avbildning og kvantifisering19,20. Denne protokollen er basert på fluorescerende mikroskopi, som har blitt en standard i feltet for å bestemme makropinocytose in vitro og in vivo4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18, 19,20,21,22. Makropinosomer kan skille seg fra andre endokytiske veier gjennom deres evne til å internalisere store makromolekyler, som høymolekylær dextran (dvs. 70 kDa)2,3,4,20,21,22,23. Dermed kan makropinosomer defineres gjennom opptak av ekstracellulært administrert fluorofor-merket 70 kDa dextran. Som et resultat manifesterer makropinocytiske vesikler som intracellulære klynger av fluorescerende puncta med størrelser fra 0,2-5 μm. Disse puncta kan mikroskopisk avbildes og deretter kvantifiseres for å bestemme omfanget av makropinocytose i cellen - 'den makropinocytiske indeksen'.
I denne protokollen er de viktigste trinnene for å visualisere makropinosomer i adherentceller in vitro på en 96-brønns mikroplate og deksler ved hjelp av standard laboratorieutstyr beskrevet (figur 1). I tillegg er instruksjonene for å automatisere bildeanskaffelsen og kvantifiseringen av den makropinocytiske indeksen ved hjelp av en celleavbildningsplateleser i flere moduser gitt. Denne automatiseringen reduserer tid, kostnader og krefter sammenlignet med våre tidligere beskrevne protokoller19,20. I tillegg unngår den utilsiktet partisk bildeinnsamling og analyse og forbedrer dermed reproduserbarhet og pålitelighet. Denne metoden kan enkelt tilpasses ulike celletyper eller platelesere eller brukes til å bestemme alternative makropinosomfunksjoner, for eksempel størrelse, antall og plassering. Den heri beskrevne metoden er spesielt egnet for screening av cellekulturforhold som induserer makropinocytose, identifisering av nye modulatorer eller optimalisering av legemiddelkonsentrasjoner av kjente inhibitorer.
Figur 1: Skjematisk for den automatiserte analysen for å bestemme den 'makropinocytiske indeksen' i tilhengerceller. Opprettet ved hjelp av BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av materialer
- Løs opp 70 kDa dextran merket med FITC eller tetrametylrhodamin (TMR) i PBS for å få en 20 mg/ml oppløsning. Oppbevar aliquots ved -20 °C.
- Løs opp DAPI i ddH2O for å få en 1 mg/ml oppløsning. Oppbevar aliquots ved -20 °C.
FORSIKTIG: DAPI er et potensielt kreftfremkallende middel og bør håndteres med forsiktighet. - På fikseringsdagen, lag fersk 3,7% ACS-klasse formaldehyd i PBS.
FORSIKTIG: Formaldehyd er et fikseringsmiddel, kjent kreftfremkallende middel og er giftig ved innånding. Lag løsningen i en kjemisk avtrekkshette for å unngå innånding og håndtak med forsiktighet. - Forbered syrevaskede deksler.
- Bruk et 500 ml beger og vannbad til å varme opp 28 g borosilikatglassdeksler med en diameter på 12 mm og #1,5 tykkelse i 24 timer ved 56 °C i 100 ml 1 M HCl. Forsegle begeret med plastfolie for å unngå omfattende fordampning.
FORSIKTIG: HCl er en sterk syre som er svært korrosiv og bør derfor håndteres med forsiktighet og brukes i en kjemisk avtrekkshette for å unngå innånding. - Vask dekslene med destillert vann. Gjenta vasken 4 ganger. Vask deretter dekslene med 95% etanol. Gjenta vasken 4 ganger.
- Oppbevar de syrevaskede dekslene i en cellekulturfat ved romtemperatur for fremtidig bruk ved å opprettholde steriliteten gjennom nedsenking i 95% etanol. Forsegle parabolen med parafilm for å unngå omfattende fordampning.
- Bruk et 500 ml beger og vannbad til å varme opp 28 g borosilikatglassdeksler med en diameter på 12 mm og #1,5 tykkelse i 24 timer ved 56 °C i 100 ml 1 M HCl. Forsegle begeret med plastfolie for å unngå omfattende fordampning.
2. Forberedelse av celler
- Ved hjelp av en konfluent 10 cm vevskulturplate med de tilhørende cellene av interesse, aspirerer media og skyll cellene med 5 ml DPBS, forvarsel ved 37 °C.
- Løsne cellene fra platen ved å tilsette 1,5 ml forvarsel 0,25% trypsin og inkubere ved 37 °C.
MERK: Trypsininkubasjonstiden som kreves for å løsne cellene av interesse, bør bestemmes empirisk og kan bekreftes ved å observere løsrivelse under et konvensjonelt lysmikroskop. - Samle cellene i et 15 ml sentrifugerør og tilsett 4,5 ml komplette medier for å slukke trypsin.
- Pellet cellene ved sentrifugering i 3 min ved 200 x g og aspirer supernatanten.
- Resuspend cellepellet i et tilstrekkelig volum av forhåndsvarslet komplette medier for å oppnå en enkelt celle suspensjon for såing.
- Fortsett å frø cellene på en 24-brønns plate med deksler eller et 96-brønns mikroplateformat (figur 1).
MERK: Antall celler som skal såddes, bør bestemmes empirisk for hver cellelinje, da spredningshastigheten og størrelsen varierer mellom cellelinjene. Denne protokollen er optimalisert for adherent kreftceller med 80% cellesamfluens på dagen for makropinosom merking. Cellesamtid kan påvirke makropinocytisk kapasitet, og dette bør også bestemmes empirisk.- 24-brønns plate med deksler
- Legg til dekslerlips til en 24-brønns vevskulturplate, bruk tang for å gripe en enkelt dekslelip fra etanolbadet. Trykk på dekslene på innsiden av platen for å fjerne overflødig etanol og legg dekslene flatt på bunnen av en brønn.
- La etanol fordampe og vask dekslene 2 ganger med DPBS.
- Frø cellene på toppen av dekslet ved å legge 500 μL av celleopphenget til hver brønn. Plasser cellene i en 37 °C celleinkubator med 5 % CO2 til cellesamstrømningen når 60 %-80 % dagen før makropinosommerking.
- Dagen før makropinosommerking aspirerer du mediene fra brønnene og tilsetter 500 μL forhåndsvarslet serumfritt medium til hver brønn og plasserer cellene i en 37 ° C celleinkubator med 5% CO2 i 16-24 timer.
MERK: Avhengig av forholdene som skal studeres, anbefales serumfrie medier å redusere effekten av vekstfaktorer som kan indusere makropinocytose og som normalt er til stede i serum. Det bør imidlertid vurderes at serum sult kan påvirke andre cellulære prosesser, for eksempel spredning og autofagi. Siden gjenværende serum kan påvirke cellenes makropinocytiske kapasitet, samt hemmeraktivitet, kan fjerning av serum forbedres ved å skylle cellene forsiktig 1 eller 2 ganger med 500 μL forhåndsvarslet DPBS.
- 96-brønns mikroplateformat
- Overfør celleopphenget til et 25 ml reagensreservoar. Ved hjelp av en flerkanals pipette (8 eller 12 kanaler) frø 100 μL av cellefjæringen til hver brønn av en svart 96-brønns høyinnholdsscreeningmikroplate med optisk klar syklisk olefin eller glassbunn.
- Plasser cellene i en 37 °C celleinkubator med 5 % CO2 til cellesamstrømningen når 60 %-80 % dagen før makropinosommerking.
- Dagen før makropinosommerking fjerner og kaster du mediet fra hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette (8 eller 12 kanaler) eller en flerkanals aspirasjonsadapter for standardspisser festet til en vakuumpumpe.
- Bruk et reagensreservoar og flerkanals pipette (8 eller 12 kanaler), tilsett forsiktig 100 μL forhåndsvarslet serumfritt medium til hver brønn. Plasser cellene i en 37 °C celleinkubator med 5 % CO2 i 16–24 timer.
MERK: Avhengig av forholdene som skal studeres, anbefales serumfrie medier å redusere effekten av vekstfaktorer som kan indusere makropinocytose og som normalt er til stede i serum. Det bør imidlertid vurderes at serum sult kan påvirke andre cellulære prosesser, for eksempel spredning og autofagi. Siden gjenværende serum kan påvirke cellenes makropinocytiske kapasitet, samt hemmeraktivitet, kan fjerning av serum forbedres ved å forsiktig skylle cellene 1 eller 2 ganger med 100 μL forhåndsvarslet DPBS.
- 24-brønns plate med deksler
3. Makropinosom merking
- 24-brønns plate med deksler
- Aspirer brønnene og tilsett tilbake 200 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluorofor-merket høymolekylær vekt (70 kDa) dextran. Plasser cellene i en 37 °C celleinkubator i 30 minutter.
MERK: Avhengig av forholdene som skal studeres, i stedet for å bruke ferske medier, kan gjenbruk av det betingede mediet for dekstranlasting foretrekkes, da det vil inneholde utskilte eller supplerede faktorer, for eksempel henholdsvis EGF- eller inhibitorforbindelser, som kan påvirke cellenes makropinocytiske kapasitet. - Aspirer media og vask cellene forsiktig, men vask cellene raskt 5 ganger med iskald PBS ved hjelp av en ferdigkjølt vaskeflaske. Rist platen godt for hånd under vask for å hjelpe til med å løsne dekstranaggregater som sitter fast i dekslene.
- Fest cellene ved å legge til 350 μL 3,7% formaldehyd og inkubere i 20 min. Deretter aspirerer du fikseringsløsningen og vasker cellene med PBS to ganger.
- Flekk kjernene med 350 μL 2 μg/ml DAPI i PBS. Etter 20 min aspirerer du DAPI-løsningen og vasker cellene med PBS-tre ganger.
- Fest silikonisolatorer side ved side på et mikroskopsklie for å oppnå jevn avstand og reproduserbar lokalisering av dekslene, som kreves for bildeautomatisering (figur 2A, B).
MERK: Hele mikroskopet kan fylles med totalt 3 isolatorer. - For hver coverlip legger du til en dråpe herding av fluorescensmonteringsmedier på mikroskopets lysbilde innenfor isolatorens åpne rom (figur 2C). Plukk opp en dekslelip ved hjelp av tang og fjern overflødig PBS ved å trykke forsiktig på siden av dekslene på en lofri klut.
- Plasser dekslene opp-ned på dråpen av monteringsmedier (figur 2D). Trykk forsiktig på dekslene med lukkede tang for å fjerne bobler fra monteringsmediet (figur 2E).
- Oppbevar lysbildene i et mørkt miljø og la monteringsmediene tørke ved romtemperatur, vanligvis i 16-24 timer. Lysbilder kan nå avbildes eller lagres ved -20 °C i opptil 2 uker.
- Fjern isolatorene fra mikroskoplyset før avbildning. La skliene likevekte til romtemperatur og rengjør dekslene ved hjelp av en bomullsspisset applikator fuktet med ammoniakkfri glassrenser. Bruk deretter en ren bomullsspisset applikator fuktet med 70% etanol for å rengjøre og la dekslene tørke.
- Aspirer brønnene og tilsett tilbake 200 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluorofor-merket høymolekylær vekt (70 kDa) dextran. Plasser cellene i en 37 °C celleinkubator i 30 minutter.
Figur 2: Plassering av deksler på et mikroskop med silikonisolatorer. (A) Silikonisolatorer presses og festes til et mikroskopsklie. (B) Hele mikroskopskredet kan fylles med totalt 3 isolatorer, noe som resulterer i jevn avstand og reproduserbar lokalisering av dekslene. (C) For hver deksleslip, tilsett en dråpe fluorescensmonteringsmedier på mikroskopets lysbilde innenfor isolatorens åpne rom. (D) Bruk tang til å plukke opp en deksleslip fra 24-brønnsplaten og plasser den opp ned på dråpen av monteringsmedier. (E) Når det er bobler mellom dekslene og mikroskopet, trykker du forsiktig på dekslene med lukkede tang for å fjerne bobler. Opprettet ved hjelp av BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- 96-brønns mikroplateformat
- Aspirer brønnene ved hjelp av en flerkanals aspirasjonsadapter festet til et vakuum og tilsett 40 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluorofor-merket høymolekylær vekt (70 kDa) dextran tilbake til brønnene. Inkuber cellene i en 37 °C celleinkubator i 30 min.
MERK: Avhengig av betingelsene som skal studeres, i stedet for å bruke ferske medier, kan gjenbruk av det betingede mediet for dekstranlasting foretrekkes, da det vil inneholde utskilte eller supplerede faktorer, for eksempel EGF- eller inhibitorforbindelser, som kan påvirke cellenes makropinocytiske kapasitet. - Kast mediet i mikroplaten ved å flikke platen opp ned manuelt i et tomt 5 L beger (figur 3A).
- Skyll cellene i mikroplaten ved å senke platen langsomt vertikalt i en liten vinkel inn i et 2 l beger fylt med iskald PBS (figur 3B) og kast deretter PBS i mikroplaten ved å flikke platen opp ned i 5 L-begeret (figur 3C). Gjenta 2 ganger.
MERK: Celler som er svakt festet til bildemikroplaten, kan løsne under denne prosessen. Om nødvendig kan brønner også aspireres med en flerkanals aspirasjonsadapter eller mer forsiktig vasket med PBS ved hjelp av en flerkanals pipette. Behandling av en 96-brønns mikroplate vil kreve ca. 2 L iskald PBS. Hvis flere plater skal analyseres, bruk et større beger, og tilsett 1 L iskald PBS for hver ekstra plate eller oppdater den iskalde PBS etter behov. - Etter avhending av PBS fra siste skylling, fest cellene i 20 min ved romtemperatur ved å tilsette 100 μL 3,7% formaldehyd i PBS til hver brønn ved hjelp av et 25 ml reagensreservoar og en flerkanals pipette (figur 3D).
- Fjern fikseringsløsningen og vask cellene med PBS to ganger ved hjelp av nedsenket og flikkingsteknikk. Flekk kjernene med 100 μL 2 μg/ml DAPI i PBS per brønn.
- Etter 20 min, skyll cellene tre ganger med iskald PBS ved hjelp av nedsenket og flikkingsteknikk som er beskrevet ovenfor (trinn 3.2.3). Fjern eventuell gjenværende PBS ved å tappe mikroplaten opp-ned på en lofri klut og tilsett 100 μL fersk PBS til hver brønn ved hjelp av et 25 ml reagensreservoar og flerkanals pipette. Bilde cellene nå eller lagre dem dekket av lys ved 4 °C i opptil en uke.
MERK: Alternativt kan en løsning av glyserol i PBS (i stedet for PBS) brukes til avbildning og lagring for bedre å stabilisere fluorescensen (figur 4A). - La platen likevekte til romtemperatur før avbildning. Tørk av mikroplaten med en lofri klut.
- Aspirer brønnene ved hjelp av en flerkanals aspirasjonsadapter festet til et vakuum og tilsett 40 μL serumfrie medier med 1 mg/ml fluorofor-merket høymolekylær vekt (70 kDa) dextran tilbake til brønnene. Inkuber cellene i en 37 °C celleinkubator i 30 min.
Figur 3: Skylle mikroplaten på 96 brønner for å klargjøre for fiksering. (A) Tøm mediets mikroplate i et 5 l beger ved å flikke manuelt. (B) Vertikalt og i en liten vinkel, senk mikroplaten langsomt ned i et 2 L beger fylt med iskald PBS. (C) Tøm mikroplaten til PBS i 5 L begeret ved å flikke manuelt. Gjenta vasketrinnene som beskrevet i B to ganger. (D) Etter tømming av PBS i mikroplaten for siste gang, tilsett 100 μL 3,7% formaldehyd til brønnene ved hjelp av en flerkanals pipette. Opprettet ved hjelp av BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Automatisert makropinosomavbildning
Bilder av makropinosomer kan fanges ved hjelp av et standard fluorescerende mikroskop, som tidligere beskrevet19,20. En slik prosedyre kan imidlertid forbedres når det gjelder effektivitet gjennom automatisering, spesielt når man vurderer mange forskjellige cellekulturforhold. Automatisering av bildeanskaffelse kan oppnås via en celleavbildning av flermodusplateleser, noe som reduserer innsatsen ved å redusere håndteringsprosedyrene og, viktigst, øker datareroduserbarheten og påliteligheten ved å skaffe bilder på en objektiv måte. Flere bildesystemer er kommersielt tilgjengelige, og retningene vil variere mellom instrumentene. Her beskrives henting av bilder ved hjelp av en Cytation 5. Protokollen nedenfor kan imidlertid skreddersys til hvert enkelt instrument ved å følge følgende retningslinjer:
- Lag en automatiseringsprotokoll for å skaffe bildene med et 40x luftmål i bølgelengdekanalen til dextran fluorophore (FITC / TMR) og DAPI.
MERK: Den ofte brukte makropinocytosehemmeren EIPA utviser autofluorescens i FITC-kanalen, spesielt når den tidligere var spent i DAPI-kanalen. Andre forbindelser som testes kan også vise autofluorescence. Hvis du vil omgå dette problemet, bidrar det å angi at bildeanskaffelsen skal skje først i kanalen med den høyeste eksitasjonsbølgelengden (FITC/TMR) og den andre i DAPI-kanalen, for å unngå denne forekomsten. - Optimaliser eksponeringsinnstillingene ved hjelp av en prøve som forutses å ha det høyeste nivået av makropinocytose for å unngå overeksponering, noe som kan føre til metning av signalet og tap av intensitetsdata. Bruk fokusinnstillinger som lett og konsekvent finner eksemplet for å produsere bilder av høy kvalitet.
- Skaff deg flere bilder på tvers av hver brønn eller coverlip for å ta høyde for prøvevariabilitet og få en nøyaktig representasjon av prøven.
- Når bildeinnstillingene er bestemt, bruker du de samme innstillingene for hvert eksempel i eksperimentet.
- Følg disse instruksjonene for makropinosom bildeinnhenting når du bruker en Cytation 5- og Gen5-programvare:
- 24-brønns plate med deksler
- Start plateleseren og sett inn mikroskopet glir opp ned ved hjelp av skyveholderen.
- Åpne mikroplateleseren og bildebehandlingsprogramvaren, opprett en ny protokoll ved å klikke protokoller og Opprett ny. Dobbeltklikk på Prosedyre og velg platetype.
MERK: Hvis platetypen ikke er tilgjengelig, legger du til platetypen i programvaren ved å klikke på System > Platetyper > Legg til plate, og bruk platedimensjonene som leveres av produsenten. For brukervennlighet er malen for to mikroskoplysbilder med tre deksler fordelt ved hjelp av silikonisolatorene gitt i tilleggsfil 1. - Hvis du vil ha tilgang til bildeinnstillingene, velger du Handlinger > Bilde > Invertert imager og klikker OK. Bruk målet for 40x, PL FL-fase med Wide FOV og Autofocus Binning.
- For den første kanalen velger du LED-kuben som tilsvarer dekstran fluoroforetiketten (GFP eller RFP). Fjern merket for Automatisk eksponering , og klikk på mikroskopikonknappen for å optimalisere eksponeringsinnstillingene. Når de riktige eksponeringsinnstillingene er bestemt, klikker du på Lagre innstillinger.
MERK: Juster eksponeringsinnstillingene ved hjelp av en prøve som forutses å ha det høyeste nivået av makropinocytose for å unngå overeksponerte bilder, noe som kan føre til metning av signalet og tap av intensitetsdata. - Gjenta det forrige trinnet for den andre kanalen ved hjelp av DAPI LED-kuben.
- Angi autofokusinnstillingene for hver fluorescenskanal, og velg Fokusalternativer. Fjern merket for standard fokusmetode, og bruk Autofokus med valgfri skanning og autofokus uten valgfri skanning for henholdsvis dekstran-fluorofor- og DAPI-kanalen. Klikk OK for å lagre innstillingene.
MERK: Skanneavstanden kan reduseres til 200 μm og økningen til 20 μm for å øke autofokuseffektiviteten. Den valgfrie skanningen er nødvendig for tilstrekkelig autofokus på prøver som har lav fluorescens. Dette skjer normalt når du analyserer forhold med lav makropinocytose, for eksempel når makropinocytose hemmes eller ikke medfødt tilstede. - Bruk alternativet Definer beacons til å automatisere anskaffelsen av bilder i forskjellige områder av omslagsslipet. Klikk på mikroskopikonet og legg til beacons ved å klikke i bildevinduet og flytte scenen til neste region. Når riktig antall områder er valgt, flytter du til neste omslag og gjentar prosessen. For å fullføre, klikk på Lagre innstillinger.
MERK: For å få en god representasjon av makropinocytose på tvers av prøven, velg ca. 20 beacons som er jevnt fordelt over dekslene (figur 4B). Mindre beacons kan brukes, men noen bilder må kanskje utelukkes fra bildeanalyse etter oppkjøp på grunn av kvalitetsavvik, for eksempel når bildet er ute av fokus eller inneholder bobler eller fluorescerende flekker og flekker. - Klikk OK for å fullføre justeringen av bildebehandlingsinnstillingene. Hvis du vil se for deg omslagstegnene, velger du Opprett et nytt eksperiment og Les nå fra protokollverktøyene. Lagre protokollen og eksperimentet når du blir bedt om det.
- 24-brønns plate med deksler
Figur 4: Optimalisering av betingelser for bildeanskaffelse. (A) Økning av glyserolkonsentrasjonen øker TMR-dekstranfluorescens, som bestemt i AsPC-1-celler behandlet med EGF. (B) Eksempelkoordinater for bilde beacons for automatisk bildeinnhenting ved bruk av 24-brønnsplaten med coverlips format. Stolpegrafen viser gjennomsnittlig relativ fluorescens med SEM på 5 eksperimenter. Statistisk signifikans ble bestemt av toveis ANOVA, i forhold til PBS. ** p < 0,01; p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- 96-brønns mikroplateformat
- Start plateleseren og sett inn mikroplaten.
- Åpne mikroplateleseren og bildebehandlingsprogramvaren, opprett en ny protokoll ved å klikke protokoller og Opprett ny. Dobbeltklikk på Prosedyre og velg platetype.
MERK: Hvis platetypen ikke er tilgjengelig, legger du til platetypen i programvaren ved å klikke på System > Platetyper > Legg til plate, og bruk platedimensjonene som følger med produsenten. For brukervennlighet er malen for CellCarrier-96 Ultra Microplates fra PerkinElmer gitt i Supplementary File 2. - Hvis du vil ha tilgang til bildeinnstillingene, velger du Handlinger > Bilde > Invertert bilde og klikker OK. Bruk 40x PL FL-fasemålet med Wide FOV og Autofocus Binning.
- For den første kanalen velger du LED-kuben som tilsvarer dekstran fluoroforetiketten (GFP eller RFP). Fjern merket for Automatisk eksponering , og klikk på mikroskopikonknappen for å optimalisere eksponeringsinnstillingene. Når de riktige eksponeringsinnstillingene er bestemt, klikker du på Lagre innstillinger.
MERK: Under optimaliseringen av eksponeringsinnstillingene kan det oppstå betydelig fluorescensbleking. Dette kan føre til innstillinger som forårsaker overeksponering når et nytt felt bildes. Valider derfor eksponeringsinnstillingene ved å kontrollere et felt som ennå ikke er eksponert, og sikre at det ikke oppstår metning av signalet ved de valgte innstillingene. Ikke ta med brønnene som brukes til optimalisering av eksponeringsinnstillingen i makropinosom kvantifiseringen, da fluorescensen har gått ned som følge av bleking under optimaliseringen. Juster eksponeringsinnstillingene ved hjelp av en prøve som er spådd å ha det høyeste nivået av makropinocytose for å unngå overeksponerte bilder, noe som kan føre til metning av signalet og tap av intensitetsdata. - Gjenta det forrige trinnet for den andre kanalen ved hjelp av DAPI LED-kuben.
- Angi autofokusinnstillingene for hver fluorescenskanal, og velg Fokusalternativer. Fjern merket for standard fokusmetode, og bruk autofokus for laser. Ta opp en referanseskanning etter å ha bestemt fokusplanet for optimal visualisering av makropinosomer og kjerner. Klikk OK for å lagre innstillingene.
MERK: Skanneavstanden kan reduseres til 400 μm og økningen til 3 μm for å øke autofokuseffektiviteten. For at laserens autofokusalternativ skal fungere skikkelig, rengjør bunnen av platen, tørk og tørk platen med en lofri klut før bildebehandling. Laser autofokus er en overlegen metode for fokus, da det krever minimal tid å finne fokusplanet. Andre fokusmetoder kan brukes, men siden det ikke er lagt til anti-fade til brønnene, kan disse metodene forårsake betydelig bleking av prøvene som vil påvirke innsamlingen av data negativt. - Sett den vannrette og loddrette forskyvningen til null, og velg Montasje under Enkeltbilde, og bruk 3 x 3 bilder, avhengig av hvor mange celler som er ønsket å bli inkludert i analysen.
MERK: Avhengig av størrelsen og tettheten til cellene, kan flere eller færre bilder tas for å få en representativ vurdering av makropinocytose gjennom hele prøven. Vurdering av makropinocytose i AsPC-1- eller MIA PaCa-2-celler under varierende forhold, ingen forskjeller i datatolkning mellom en fotoramme på 2 x 2 eller 4 x 4 observeres, selv om variasjonen mellom replikeringsprøver kan øke når du tar færre bilder (figur 5A, B). Hvis du øker eller reduserer størrelsen på rammen, vil det påvirke tiden det tar å skanne platen. Avhengig av eksponeringstiden vil en full mikroplate på 96 brønner ta rundt 1-1,5 timer å skanne helt ved hjelp av en 3 x 3 ramme. En ramme på henholdsvis 2 x 2 og 4 x 4 vil halvere eller doble den tiden. - Klikk OK for å fullføre justeringen av bildebehandlingsinnstillingene.
- Hvis du vil avbilde platen, velger du Opprett et nytt eksperiment og Les nå fra protokollverktøyene. Lagre protokollen og eksperimentet når du blir bedt om det.
Figur 5: Kontrollforhold for å vurdere makropinocytose i PDAC-celler. (A) AsPC-1-celler viser makropinocytose som svar på 100 ng/ml EGF-stimulering i 5 min eller glutaminmangel i 24 timer. For bildeinnhenting ble det tatt bilderammer på 4 x 4, 3 x 3, 2 x 3 eller 2 x 2 for å bestemme påvirkningen av antall bilder på datakvalitet. (B) MIA PaCa-2 celler viser konstituerende makropinocytose som hemmes av 30-min behandling med 75 μM EIPA eller 2-timers behandling med 10 μM EHop-016. Bilderammer ble tatt som i A. Skalastang = 25 μm. Stolpediagrammer viser den gjennomsnittlige relative makropinocytiske indeksen med SD på 1 eksperiment med 4 replikeringer. Statistisk signifikans ble bestemt av toveis ANOVA i forhold til +Q eller kjøretøyets tilstand. p < 0.001 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Bestemme den makropinocytiske indeksen
Den 'makropinocytiske indeksen' er omfanget av cellulær makropinocytose som bestemmes ved å kvantifisere fluorescerende dekstranopptak per celle ved hjelp av mikroskopisk avbildning19. For dette formål brukes de oppkjøpte bildene til å bestemme mengden internalisert dextran ved å måle den totale fluorescensintensiteten eller fluorescenspositive området og det totale antall celler som bestemmes av DAPI-farging. Denne analysen kan utføres med åpen kildekode-bildebehandlings- og analyseprogramvare, for eksempel Cell Profiler eller FIJI / ImageJ, som tidligere beskrevet19,20. Når du arbeider med en plateleser med flere moduser, kan imidlertid programvaren som følger med instrumentet, inkludere innebygde analyseprogrammer som kan brukes til å beregne den makropinocytiske indeksen. I noen tilfeller kan det hende at det innebygde datasamlebåndet for programvareanalyse ikke er helt tydelig for brukeren. Det anbefales derfor å validere programvaren på et tidlig stadium ved å sammenligne med en ikke-automatisert prosedyre, for eksempel Cell Profiler eller FIJI / ImageJ. Denne protokollen kan tilpasses andre programvareverktøy for bildebehandling og analyse ved å følge følgende generelle instruksjoner:
- For DAPI og tilsvarende dekstranbilde trekker du fra bakgrunnen ved å bruke riktig funksjon, ofte kalt rullende kulefunksjon. Juster innstillingene slik at bakgrunnsstøyen minimeres, og det er minimal til ingen subtraksjonseffekt på DAPI- og dekstransignalet.
- Bruk et felt med høyt dekstransignal, bestem intensitetssignalinnstillingene, ofte kalt terskelfunksjonen, for å velge kjernene og bestemme minimumsintensitetssignalinnstillingen som kreves for å velge bare makropinosomene.
- For dextran-bildet beregner du den totale fluorescensen innenfor det opprettede makropinosomvalget eller bruker markeringen til å bestemme det totale arealet positivt for dekstran.
- For DAPI-bildet bruker du markeringen til å bestemme antall kjerner i bildet for å gjenspeile antall celler som finnes.
- For å bestemme den makropinocytiske indeksen, del den totale dekstranfluorescensen eller området med antall celler bestemt av DAPI.
- Gjenta disse analysetrinnene for alle de anskaffede bildene som bruker de samme numeriske innstillingene gjennom hele.
- Følg disse instruksjonene for å bestemme den makropinocytiske indeksen når du bruker Gen5-programvare:
MERK: Den innebygde analysepipeline ble validert og oppdaget ingen forskjeller i beregning i forhold til Fiji/ImageJ (Figur 6A).- Når avbildningen er fullført, velger du et bilde med et høyt nivå av makropinocytose. Fjern bakgrunnssignalet, klikk Prosess (tilleggsfigur 1A) og velg alternativet Forhåndsbehandling av bilde .
- For dekstrankanalen fjerner du merket for Auto og bruker en rullende kulediameter på 5 μm, prioriterer fine resultater og glatter ut bildet med 1 syklus.
- For DAPI-kanalen bruker du Automatisk forhåndsbehandling og 1 jevn syklus. Klikk på OK og legg til forhåndsbehandlingstrinnet for bildet i protokollen; klikker du PÅ LEGG TIL TRINN. Deretter velger du det behandlede bildet under bildeutrullingen (tilleggsfigur 1B) og klikker på Analyser-knappen (tilleggsfigur 1C).
- Sett typen til Mobilanalyse under ANALYSEINNSTILLINGER. Velg DAPI-kanalen og klikk på Alternativer (Tilleggs figur 2A).
- For primærmasken oppretter du en maske ved hjelp av det behandlede DAPI-bildet for å velge enkle kjerner. Bruk den mørke bakgrunnen og alternativet Automatisk . I tillegg bestemmer du hvilke innstillinger som tillater maskevalg av enkle kjerner, og når du er ferdig, klikker du på Bruk-knappen for å finne ut om masken brukes riktig.
MERK: Aktivering av alternativene Split Touching Objects og Fill Holes in Masks kan fungere best for å velge enkeltkjerner. Minimum og maksimum objektstørrelser må kanskje justeres avhengig av cellelinjen og angis vanligvis i området 5-40 μm. Primær kantobjekter kan inkluderes, og hele bildet bør analyseres. Glidebryteren kan brukes til å justere maskevalget til signalintensiteten. - Deretter bruker du en sekundær maske for å optimalisere innstillingene for å velge makropinosom fluorescta fluorescta. Bruk mål i en sekundær maskefunksjon og utvid primærmasken med 40 μm avhengig av størrelsen på cellene.
- Bruk Terskelverdi-funksjonen og Terskelverdi i maske -metoden til å velge de positive dekstranområdene. Klikk Bruk for å finne ut om innstillingene brukes riktig.
MERK: For å bestemme terskelverdien, bruk vis linjeprofilverktøyet (tilleggsfigur 2B) og tegn en linje over et dekstranpositivt område (tilleggsfigur 2C). Bruk den målte intensiteten til å bestemme den beste innstillingen for å opprette en maske som velger makropinosomer og utelater bakgrunnssignal (Tilleggs figur 2D). - Når du har opprettet passende masker for å velge kjerner og makropinosomer, klikker du på Beregnede beregninger-fanen og velger Velg eller Opprett målinger på objektnivå av interesse.
- Fjern alle beregninger som finnes, og legg til integral- og områdemålingene for analyse av sekundærmasken. Klikk på OK og velg Beregn og vis for de nye beregningene. Når du er ferdig, klikker du på OK og velger ADD STEP for å legge til analysen og beregningene i protokollen.
- Lagre den ferdigstilte protokollen for fremtidig bruk, og klikk Fil og lagre protokoll som.
- Når dataanalysen er fullført, velger du interessemålingene og eksporterer dataene for å bestemme den makropinocytiske indeksen. Bestem den makropinocytiske indeksen på følgende måte:
Dekstran fluorescens per celle = Objekt Int_2[Dextran fluorofor]
Dextran område per celle = Objekt Area_2[Dextran fluorofor]
MERK: For 24-brønnsplaten med coverlips-format gjenspeiler beregningene gjennomsnittet av den gjennomsnittlige makropinocytiske indeksen per bilde. Alternativt kan den makropinocytiske indeksen beregnes manuelt for hele utvalget ved å dele summen av 'Area' eller 'Integral' for alle bilder med totalen 'Celleantall'. Forskjellen mellom disse metodene ved beregning av makropinocytisk indeks er minimal i de fleste innstillinger. For mikroplateformatet på 96 brønner beregnes den makropinocytiske indeksen som gjennomsnittet for hele utvalget. - Lagre protokollen for avbildning og den påfølgende automatiserte analysen. Gjenbruk protokollen for fremtidige eksperimenter med de samme fluoroforene.
MERK: Når du bruker laser autofokusfunksjonen, må en ny referanseskanning tas når en annen cellelinje skal analyseres siden kjerner og makropinosomer muligens er lokalisert til et annet plan. Hver gang et nytt eksperiment utføres ved hjelp av en tidligere bestemt protokoll, må eksponeringsinnstillingene for eksperimentet optimaliseres.
6. Tillegg av behandlinger
Cellebehandlinger (små molekyler, biologer, vekstfaktorer, metabolitter etc.) kan innlemmes når som helst i protokollen, og den nøyaktige timingen vil avhenge av studiens mål og mål.
- Klargjør cellene som i avsnitt 2.
- Like før du legger til behandlinger av interesse, forberede behandlinger og passende kontroller på dobbelt så stor endelige konsentrasjoner i serumfrie medier. Forbered behandlingene i et volum som tilsvarer volumet av antall replikeringsbrønner som vurderes.
MERK: Gitt rollen som utskilte faktorer kan spille i å kontrollere cellulære funksjoner, kan det foretrekkes å fortynne behandlinger av interesse for betingede medier. For disse formål kan det være nyttig å frø flere plater, for eksempel 6 cm eller 10 cm cellekulturretter, når du forbereder celler som beskrevet i avsnitt 2 for å generere de betingede mediene for fremstilling av behandlingsløsningene. - Uten å fjerne media fra brønnen, legg til ett godt volum behandlingsløsning til hver brønn. Rist platen for å sikre riktig blanding. Inkuber cellene i ønsket tid.
- Fortsett med avsnitt 3.
MERK: Når du legger til dextran, forårsaker bruk av friske medier fjerning av de tilsatte behandlingene, noe som kan påvirke nivået av makropinocytose. Derfor kan det foretrekkes å legge dextran direkte til brønnene uten å aspirere eller alternativt legge til behandlingene eller gjenbruke de betingede mediene for å forberede dekstranløsningen.
Figur 6: Utføre en doseresponskurve for makropinocytosehemmere. Eksempeldata innhentet ved testing av kjente makropinocytosehemmere i en ny cellelinje. PATU8998T-celler ble brukt til 96-brønns mikroplateformat og behandlet i henholdsvis 2 t og 30 min med de angitte konsentrasjonene av (A) EHop-16 og (B) EIPA. Sammenligning av resultater oppnådd gjennom bildeanalyse av Gen5-programvaren eller ImageJ viser ingen signifikante forskjeller mellom de to tilnærmingene som angitt av ns in (A). Skalastang = 25 μm. Stolpediagrammer viser gjennomsnittet og SD for et enkelt eksperiment med 4 replikeringer. Statistisk signifikans ble bestemt av en- eller toveis ANOVA, sammenlignet med ubehandlede forhold. * p < 0,05; p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når trinnene og justeringen av den ovenfor beskrevne protokollen følges tilsvarende, bør de endelige eksperimentelle resultatene gi informasjon om de studerte cellekulturforholdene eller inhibitorene induserer eller reduserer makropinocytose i cellelinjen av interesse. For å styrke gyldigheten av disse funnene, vil inkludering av kontrollforhold tillate gransking av resultatene for å avgjøre om eksperimentet er fullført. Makropinocytoseinduksjonskontroller vil gi informasjon om det relative nivået av makropinocytose. Til dette formål er ligand EGF mest brukt13. I AsPC-1 PDAC-celler aktiveres makropinocytose (figur 5A) ved å tilsette EGF ved 100 ng/ml. Videre kan autocrine EGF-aktivering av makropinocytose induseres ved å frata cellene av glutamin i 16-24 timer (figur 5A). Alternativt kan andre indusere innlemmes avhengig av celletype og tilgjengelig litteratur; Disse kan omfatte PDGF eller Wnt3A10,11,12. Ikke alle celler oppfører seg på samme måte, og KRAS mutantceller kan vise konstituerende makropinocytose13. Et eksempel er MIA PaCa-2 PDAC-cellelinjen, som ikke reagerer på EGF-behandling. Her vil tilsetningen av kjente makropinocytosehemmere validere at den observerte og kvantifiserte fluorescta faktisk er makropinosomer. De hemmende kontrollene som oftest brukes inkluderer natrium-hydrogenvekslerhemmeren EIPA, som er en spesifikk makropinocytosehemmer (figur 5B)4. Andre kontroller kan også inkluderes, for eksempel Rac1-hemmeren EHop-016 (figur 5B), Pak-hemmeren FRAX597 eller PI3K-hemmeren LY294002; Imidlertid kan deres effekt på makropinocytose være modellspesifikk13.
For cellelinjer som tidligere ikke er vurdert for makropinocytose og hemmere, er doseresponskurver en utmerket tilnærming for å bekrefte makropinocytose og for å bestemme optimal legemiddelkonsentrasjon for fremtidig bruk. For disse formål ble 96-brønns mikroplateformatprotokollen brukt til å bestemme konstituerende makropinocytose i en cellelinje som tidligere ikke ble vurdert i laboratoriet, PATU8998T PDAC-cellene. For å avgjøre om disse cellene viser makropinocytose, ble effekten av to kjente hemmere av dekstranopptak (EHop-016 og EIPA) studert. Som illustrert reduserte doseresponseksperimentet gradvis den makropinocytiske indeksen ved høyere legemiddelkonsentrasjoner (figur 6A,B), og bekreftet dermed eksistensen av konstituerende Rac1-avhengig makropinocytose i disse cellene. I tillegg gir resultatene informasjon for optimale legemiddelkonsentrasjoner som skal brukes til fremtidige eksperimenter når du studerer makropinocytose i denne cellelinjen.
Figur 7: Feilsøkingsforhold som kan oppstå. (A) Bildet er overeksponert, som angitt i rosa. (B) Bildet er ute av fokus. (C) Bildet inneholder dextran flekker eller flekker. (D) Bildet inneholder rester. (E) Bildet inneholder en boble. (F) Cellene viser legemiddelindusert autofluorescens. Skalalinje = 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Skjermbilde av forhåndsbehandling av bilder. (A) Prosess-knappen . (B) Bildeutrulling . (C) Analyser-knappen . Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Skjermbilde av innstillinger for bilde kvantifisering. (A) ANALYSEINNSTILLINGER. (B) Vis linjeprofilverktøy. (C) Linje over dekstran positivt område. (D) Vis linjeprofilresultater Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvaliteten på forsøkene og datainnsamlingen avhenger sterkt av kvaliteten på reagensene, optimaliseringen av innstillingene og rensligheten av dekslene og mikroplaten. De endelige resultatene skal gi minimal variasjon mellom replikeringer; Biologiske variasjoner forekommer imidlertid naturlig eller kan på annen måte være forårsaket av en rekke faktorer. Celletetthet kan føre til at celler reagerer mer eller mindre på makropinocytoseindusere eller hemmere. Det er derfor avgjørende å følge 80% samløp som foreslått her i protokollen. Alternativt er det godt dokumentert av mikroplateprodusenter at mediefordampning skjer på en 96-brønns mikroplate. Her er de ytre brønnene utsatt for mer fordampning i forhold til de indre brønnene og kan dermed påvirke makropinocytose. Valget kan derfor tas for ikke å inkludere de ytre brønnene i analysen og i stedet fylle disse brønnene med PBS for å bygge en "buffervegg" for å beskytte de indre brønnene mot omfattende fordampning.
Det anbefales på det sterkeste å visuelt inspisere bilder for hver betingelse for å avgjøre om anskaffelsen ble fullført. Dette kan gjøres under avbildningen av det første settet med betingelser for å fastslå at de anvendte innstillingene faktisk er riktige og tillater intervensjon om nødvendig. Spesifikke problemer som kan oppstå er som følger; bildene er overeksponert (figur 7A), bildene er ute av fokus (figur 7B), bildene inneholder flekker av fluorescerende dextran (figur 7C) eller rester (figur 7D), bildene inneholder bobler (figur 7E) eller autofluorescence er synlig i dextran- eller DAPI-kanalen (figur 7F). For de to første problemene må innstillingene for bildeanskaffelse justeres, og anskaffelsen må gjentas. I tillegg bør platen og dekslene rengjøres for at autofokusen skal fungere ordentlig. Hvis bare noen få bilder er ute av fokus, kan de spesifikke bildene eller hele brønnen også utelukkes fra analysen ved hjelp av bildefunksjonen Maske. Den samme funksjonen kan brukes til å utelate bilder som inneholder flekker i dekstrankanalen (figur 7C), urenheter (figur 7D) eller bobler (figur 7E). I tillegg må du sørge for at prøvene er vasket godt, dextranen er helt oppløst, noe som kan forbedres ved å varme opp dekstranoppløsningen ved 37 °C og virveling, og at eksperimentet utføres med nylagde og rene reagenser. Til slutt kan legemiddelindusert autofluorescens forekomme og er ganske vanlig for makropinocytosehemmeren EIPA som fluoresces i FITC- og DAPI-kanalen, spesielt når den tidligere er begeistret i DAPI-kanalen. En løsning er anskaffelsen av FITC-kanalen før DAPI. Alternativt kan TMR-dextran brukes i stedet for FITC-dextran, eller for eksponeringsinnstillingene kan lysintensiteten og eksponeringstiden senkes samtidig som økningen økes.
For å beregne den makropinocytiske indeksen brukes kjernefysisk DAPI-farging til å bestemme cellenummeret i hvert bilde. Denne fargingsprosedyren er enkel å påføre og er en pålitelig avlesning for antall celler og dermed for beregning av det relative dekstranopptaket per celle. En advarsel til denne tilnærmingen er at den ikke vurderer forskjeller i cellestørrelse, noe som kan oppstå når man sammenligner forskjellige cellelinjer eller som svar på farmakologiske behandlinger. I disse tilfellene, der cellestørrelsen mistenkes å påvirke den makropinocytiske indeksen, kan celleområdet brukes til normalisering av dekstranopptak, som tidligere beskrevet4. Dette kan oppnås ved å endre protokollen litt slik at den inkluderer en cellemaskeflekk etter fiksering eller inkorporering av fasekontrast eller lysfeltavbildning. Det anbefales også på det sterkeste å følge opp eventuelle funn ved hjelp av den beskrevne analysen for å vurdere om makropinocytose er en næringsforsyningsrute som bidrar til cellulær kondisjon i det aktuelle cellebaserte systemet som brukes. Dette kan oppnås ved å vurdere proliferativ kapasitet, overlevelse eller levedyktighet i næringsutarmede forhold med og uten tilsetning av ekstracellulær albumin4,7. I tillegg kan en DQ-BSA pulsjaktanalyse gi bevis for om endringene i makropinocytose oversettes til endringer i albuminforringelse i lysosomer. Som høymolekylær dextran, DQ-BSA er internalisert gjennom makropinocytose og leveres til lysosomer, hvor det fluoresces etter proteolytisk fordøyelse4. Gitt likhetene med fluorescerende dekstranopptak, kan den beskrevne metoden tilpasses for å vurdere DQ-BSA-opptak. På samme måte kan denne protokollen brukes til å evaluere opptaket av annen fluorescerende merket last, for eksempel albumin, lipider eller nekrotisk celleavfall kjent for å komme inn i celler gjennom makropinocytose. Ved alle anledninger bør disse tilpasningene være i tråd med produsentens protokoller, og eksperimentelle kontroller bør brukes til å validere analysen.
Mikroskopisk bildeanalyse og kvantifisering er en favorisert tilnærming for å vurdere makropinocytose og har blitt standarden i feltet4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20 ,21,22. Det tillater visuell inspeksjon av prøvene og kan gi tilleggsinformasjon om makropinosomtall, størrelse og plassering. Videre tillater muligheten til å visuelt inspisere bilder vurdering av celletrening og levedyktighet og identifisering av artefakter og / eller autofluorescens forårsaket av legemiddeladministrasjon. Sammenlignet med andre foreslåtte kvantifiseringsmetoder, for eksempel strømningscytometri, kan disse dataene ellers gå tapt eller oversett og kan forårsake falske positiver eller negativer23. Avbildning er imidlertid mer arbeidskrevende og mer utsatt for partisk datainnsamling som strømningscytometri. Her har vi overvunnet disse hindringene gjennom automatisering av protokollen, og dermed redusere skjevheter, arbeidskraft, kostnader og tid.
Mange modulatorer av makropinocytose forblir mest sannsynlig uoppdaget, og gitt betydningen av den makropinocytiske banen i visse patologier, som kreft, kan deres oppdagelse potensielt være av stor betydning for utviklingen av nye terapeutiske tilnærminger2,3. Identifiseringen av disse modulatorene kan oppnås gjennom høyinnholdsscreening av forbindelser, som den foreslåtte metoden heretter kan fungere som en hjørnestein. Den skisserte protokollen er rettet mot å utføre forsøkene med standard laboratorieutstyr. Imidlertid kan 96-brønns plateformatet optimaliseres og tilpasses for screening av høyt innhold. Hvis du øker brønnformatet til 384 eller 1536 brønnmikroplater, kan brukeren øke antall forbindelser som kan testes på én plate. Videre vil robotisering av cellesåing, platevask, sammensatt og dextran administrasjon redusere manuell håndtering og brønn-til-brønn variasjon, og dermed forbedre skalerbarheten. Til syvende og sist vil en tilpasning av denne protokollen til screening av høyt innhold i stor grad lette å identifisere nye faktorer som regulerer makropinocytose.
Til sammen er den foreslåtte metoden en utmerket tilnærming for å bestemme nivået av makropinocytose i celler av interesse, identifisering av regulatorer i prosessen og optimalisering av legemiddelkonsentrasjoner for kjente inhibitorer. Protokollen kan også fungere som utgangspunkt for å vurdere makropinocytisk opptak av annen last i tillegg til dextran, og screening av høyt innhold med sikte på å identifisere blyforbindelser som potensielt kan føre til utvikling av nye terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.C. er en oppfinner på et utstedt patent med tittelen ''Kreftdiagnostikk, terapeutiske og narkotikafunn forbundet med makropinocytose,'' Patent Nr.: 9,983,194.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NCI grants (R01CA207189, R21CA243701) til C.C. KMO.G. er mottaker av en TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). BioTek Cytation 5 er en del av Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core, som mottar økonomisk støtte fra NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). Figur 1-3 ble opprettet ved hjelp av BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
References
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21 (2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Zhang, Y. J., Commisso, C. Macropinocytosis in cancer: a complex signaling network. Trends in Cancer. 5 (6), 332-334 (2019).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
- Olivares, O., et al. Collagen-derived proline promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell survival under nutrient limited conditions. Nature Communications. 8, (2017).
- Seguin, L., et al. Galectin-3, a druggable vulnerability for KRAS-addicted cancers. Cancer Discovery. 7 (12), 1464-1479 (2017).
- Redelman-Sidi, G., et al. The canonical Wnt pathway drives macropinocytosis in cancer. Cancer Research. 78 (16), 4658-4670 (2018).
- Tejeda-Munoz, N., Albrecht, L. V., Bui, M. H., De Robertis, E. M. Wnt canonical pathway activates macropinocytosis and lysosomal degradation of extracellular proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (21), 10402-10411 (2019).
- Schmees, C., et al. Macropinocytosis of the PDGF beta-receptor promotes fibroblast transformation by H-RasG12V. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2571-2582 (2012).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50 (3), 381-392 (2019).
- Recouvreux, M. V., et al. Glutamine depletion regulates Slug to promote EMT and metastasis in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), (2020).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. 11 (7), 1808-1825 (2021).
- Su, H., et al. Cancer cells escape autophagy inhibition via NRF2-induced macropinocytosis. Cancer Cell. 39 (5), 678-693 (2021).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), New York, N.Y. 1061-1068 (1986).
- Mishra, R., et al. Stromal epigenetic alterations drive metabolic and neuroendocrine prostate cancer reprogramming. Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4472-4484 (2018).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton, N.J. 113-123 (2019).
- Wang, J. T. H., Teasdale, R. D., Liebl, D. Macropinosome quantitation assay. MethodsX. 1, 36-41 (2014).
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton, N.J. 171-181 (2019).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
