Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Summary

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

Abstract

Die weibliche Fruchtbarkeit und die reproduktive Lebensdauer hängen von der Qualität und Quantität der Eierstock-Eizellreserve ab. Schätzungsweise 80% der weiblichen Keimzellen, die in die meiotische Prophase I eintreten, werden während der fetalen Eizellabnutzung (FOA) und der ersten Woche des postnatalen Lebens eliminiert. Drei Hauptmechanismen regulieren die Anzahl der Eizellen, die während der Entwicklung überleben, und etablieren die Eierstockreserve bei Frauen, die in die Pubertät eintreten. In der ersten Welle des Eizellverlustes werden 30-50% der Eizellen während der frühen FOA eliminiert, ein Phänomen, das auf eine hohe lange eingestreute Kernelement-1 (LINE-1) -Expression zurückzuführen ist. Die zweite Welle des Eizellverlustes ist die Beseitigung von Eizellen mit meiotischen Defekten durch einen meiotischen Qualitätskontrollpunkt. Die dritte Welle des Eizellverlustes tritt perinatal während der primordialen Follikelbildung auf, wenn einige Eizellen keine Follikel bilden. Es bleibt unklar, was jede dieser drei Wellen des Eizellverlustes reguliert und wie sie die Eierstockreserve bei Mäusen oder Menschen formen.

Immunfluoreszenz und 3D-Visualisierung haben einen neuen Weg eröffnet, um die Entwicklung von Eizellen im Kontext des gesamten Eierstocks abzubilden und zu analysieren, anstatt in weniger informativen 2D-Schnitten. Dieser Artikel bietet ein umfassendes Protokoll für die Immunfärbung des gesamten Eierstocks und die optische Reinigung, das Vorbereitungen für die Bildgebung mittels Multiphotonenmikroskopie und 3D-Modellierung mit kommerziell verfügbarer Software liefert. Es zeigt, wie diese Methode verwendet werden kann, um die Dynamik der Eizellabnutzung während der Eierstockentwicklung bei C57BL/6J-Mäusen zu zeigen und den Eizellverlust während der drei Wellen der Eizellelimination zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auf pränatale und frühe postnatale Eierstöcke zur Visualisierung und Quantifizierung von Eizellen sowie auf andere quantitative Ansätze angewendet werden. Wichtig ist, dass das Protokoll strategisch entwickelt wurde, um eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz zu ermöglichen, die die Anforderungen in der Toxikologie, klinischen Diagnostik und genomischen Assays der Eierstockfunktion erfüllen kann.

Introduction

Die meisten weiblichen Säugetiere werden mit einer endlichen Anzahl von meiotisch stillgelegten Eizellen geboren, die in den Urfollikeln gespeichert sind und die Eierstockreserve (OR) ^bilden1,2. Der OP bestimmt die gesamte weibliche reproduktive Lebenserwartung und Gesundheit³. Der OP nimmt normalerweise mit zunehmendem Alter ab und kann bei Exposition gegenüber bestimmten genotoxischen Wirkstoffen (Bestrahlung / Chemotherapie) und Umweltbelastungen (Unterernährung) vorzeitig erschöpft sein, was zu Unfruchtbarkeit führt ^4,5,6

Protocol

Alle verwendeten Mäuse gehörten dem genetischen Stamm C57BL/6J an (siehe Materialtabelle). Dieser Stamm wurde vollständig sequenziert und ist Standard für viele Studien zur Struktur und Funktion der Eierstöcke. Mäuse wurden gemäß den NIH-Richtlinien untergebracht, und die durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Jackson Laboratory genehmigt. Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Zusammensetzungen sind in der Materialtabelle bzw. in der Tabelle 1 aufgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Fixativ: Bereiten Sie 4% Paraformaldehy....

Results

Die Immunfärbung und Bildgebung des gesamten Eierstocks ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Eizell- oder Proteinexpression in Eierstöcken in verschiedenen Entwicklungsstadien mit derselben Technik und denselben Markern (Abbildung 3). Dieses Protokoll wurde für ein Großprojekt entwickelt, in dem die Analyse von Eierstöcken in mehreren Stadien und aus mehreren Mausstämmen erforderlich war. Hier präsentieren wir Daten, die für den Stamm C57BL6/J, einen Standardstamm für die ge.......

Discussion

Dieser Artikel stellt ein detailliertes 3D-Immunfärbungs- und Bildgebungsprotokoll für pränatale und postnatale Eierstöcke für Hochdurchsatz- und Vergleichsstudien zur Keimzellquantifizierung und Proteinlokalisierung vor. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um die Anzahl der Eizellen in den Eierstöcken (N = 6-12) an sechs Entwicklungszeitpunkten in 10-16 verschiedenen Stämmen zu analysieren, wobei typischerweise 2-4 24-Well-Platten gleichzeitig verarbeitet werden. Diese Methode kann für andere Organe oder zelluläre Ma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tisch-Inkubator	Benchmark	Scientific H2200-H	37 ° C-Inkubator
Rinderserumalbumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	Maus-Inzuchtstamm
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Gefahrgut
D-Sorbit	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Pinzette	FST	91150-20
FastWells Reagenzienbarrieren	GraceBio	664113	Klebrige und flexible Silikondichtung (Haftwanne)
Feine Schere	FST	91460-11
Glycerin	Sigma-Aldrich	G2025
Glycin	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Verdünnung 1:1000
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Verdünnung 1:1000
Ziegenserum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Bildvisualisierungs- und Analysesoftware
Insight X3	Spectra-Physics	InSight  X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX Software	Leica	Version 3.5.6	Bilderfassungssoftware
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton
Imaging Masterflex Pump Controller	SPW Industriemodell	: 7553-50	Schlauchpumpe für Perfusion
Mayo Schere	FST	14010-17	5" – 7" stumpfe/stumpfe Schere zum Enthaupten
Micro Cover Brille, quadratisch, Nr. 1,5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	Schüttler/Nutator für 37 > C Inkubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	Stereomikroskop
Paraformaldehyd 16% (wässrige Formaldehydlösung)	Elektronenmikroskopie Sciences	15710	Gefahrstoff
PBS-Tabletten, phosphatgepufferte Kochsalzlösung	ThermoFisher Scientific	BP2944100	In Milli-Q-Wasser auflösen
Penicillin-Streptomycin, 200x, Duale Antibiotikalösung	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinylalkohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylendiamin)	Sigma-Aldrich	122262
Kaninchen anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Verdünnung 1:500
Kaninchen anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Verdünnung 1:500
Ratte anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Verdünnung 1:500
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002	Gefahrstoff
Natriumborhydrid	Sigma-Aldrich	452882	Gefahrstoff
Saccharose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	Shaker für Raumtemperatur
Triethanolamin	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusionsset	MYCO Medical	7001-23	Nadeln für die Perfusion
Harnstoff	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	LED-Leuchtstofflampe mit geringer Leistung