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Bioengineering

Une boîte à outils de transcription-traduction de streptomyces à haut rendement pour la biologie synthétique et les applications de produits naturels

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63012
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4,6,7, 5
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

Ce protocole détaille une méthode améliorée pour synthétiser des rendements élevés de protéines recombinantes à partir d’un système de transcription-traduction sans cellule (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .

Abstract

Streptomyces spp. sont une source majeure d’antibiotiques cliniques et de produits chimiques industriels. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 est une souche à croissance rapide et un producteur naturel de chloramphénicol, de jadomycine et de pikromycine, ce qui en fait un candidat attrayant en tant que châssis de biologie synthétique de nouvelle génération. Par conséquent, les outils génétiques qui accélèrent le développement de S. venezuelae ATCC 10712, ainsi que d’autres modèles Streptomyces spp., sont hautement souhaitables pour l’ingénierie et la découverte de produits naturels. À cette fin, un système dédié sans cellules S. venezuelae ATCC 10712 est fourni dans ce protocole pour permettre l’expression hétérologue à haut rendement des gènes G + C élevés (%) Ce protocole convient aux réactions par lots à petite échelle (10-100 μL) dans un format de plaque de 96 puits ou de 384 puits, tandis que les réactions sont potentiellement évolutives. Le système sans cellules est robuste et peut atteindre des rendements élevés (~ 5-10 μ M) pour une gamme de protéines recombinantes dans une configuration minimale. Ce travail intègre également un large ensemble d’outils plasmidiques pour la mesure en temps réel de la synthèse de l’ARNm et des protéines, ainsi que la coloration par fluorescence dans le gel des protéines marquées. Ce protocole peut également être intégré à des flux de travail de caractérisation de l’expression génique à haut débit ou à l’étude des voies enzymatiques des gènes G +C (%) élevés présents dans les génomes des Actinomycètes.

Introduction

Les systèmes de transcription-traduction sans cellule (TX-TL) fournissent une plate-forme de prototypage idéale pour la biologie synthétique afin de mettre en œuvre des cycles rapides de conception-construction-test-apprentissage, le cadre d’ingénierie conceptuelle pour la biologie synthétique1. En outre, les systèmes TX-TL suscitent un intérêt croissant pour la production de protéines recombinantes de grande valeur dans un environnement à réaction ouverte2, par exemple pour incorporer des acides aminés non standard dans des conjugués anticorps-médicament3. Plus précisément, TX-TL nécessite un extrait cellulaire, un plasmide ou un ADN linéaire et une solution énergétique pour catalyser la synthèse des protéines dans des réactions discontinues ou semi-continues. Alors qu’Escherichia coli TX-TL est le système dominant sans cellules, un certain nombre de systèmes TX-TL émergents non modèles ont attiré l’attention pour différentes applications4,5,6,7,8. Les principaux avantages du TX-TL incluent une évolutivité flexible (échelle nanolitre à litre)9,10, une forte reproductibilité et des flux de travail automatisés8,11,12. En particulier, l’automatisation du TX-TL permet la caractérisation accélérée des parties génétiques et des éléments régulateurs8,12,13.

En termes de configuration de la réaction, TX-TL nécessite des sources d’énergie primaires et secondaires, ainsi que des acides aminés, des cofacteurs, des additifs et une séquence d’ADN modèle. Les triphosphates nucléotidiques (NTP) fournissent la source d’énergie primaire pour piloter l’ARNm initial (ATP, GTP, CTP et UTP) et la synthèse des protéines (uniquement ATP et GTP). Pour augmenter les rendements TX-TL, les NTP sont régénérés par le catabolisme d’une source d’énergie secondaire, telle que le maltose14, la maltodextrine15, le glucose14, le 3-phosphoglycérate (3-PGA)16, le phosphoénolpyruvate17 et le L-glutamate18. Cette activité métabolique inhérente est étonnamment polyvalente, mais peu étudiée, en particulier dans les systèmes TX-TL émergents. Chaque source d’énergie a des propriétés et des avantages distincts en termes de rendement en ATP, de stabilité chimique et de coût, ce qui est une considération importante pour les réactions TX-TL à grande échelle. Jusqu’à présent, les protocoles actuels pour E. coli TX-TL ont atteint jusqu’à 4,0 mg/mL (~157 μM) pour la protéine fluorescente verte modèle (GFP), en utilisant un mélange de 3-PGA (30 mM), de maltodextrine (60 mM) et de D-ribose (30 mM) comme source d’énergie secondaire19.

Récemment, il y a eu un intérêt croissant pour l’étude des voies biosynthétiques des métabolites secondaires dans les systèmes TX-TL20,21,22. Plus précisément, les actinobactéries sont une source majeure de métabolites secondaires, y compris les antibiotiques et les produits chimiques agricoles23,24. Leurs génomes sont enrichis de groupes de gènes biosynthétiques (BGC), qui codent des voies enzymatiques pour la biosynthèse des métabolites secondaires. Pour l’étude des parties génétiques des actinobactéries et des voies biosynthétiques, une gamme de systèmes TX-TL à base de streptomyces a récemment été développée5,6,25,26. Ces systèmes spécialisés Streptomyces TX-TL sont potentiellement bénéfiques pour les raisons suivantes : [1] fourniture d’un environnement de repliement protéique natif pour les enzymes de Streptomyces spp.26 ; [2] accès à un pool d’ARNt optimal pour une expression génique G+C (%) élevée ; [3] métabolisme primaire actif, qui peut potentiellement être détourné pour la fourniture de précurseurs biosynthétiques; et [4] fourniture d’enzymes, de précurseurs ou de cofacteurs issus du métabolisme secondaire présents dans l’extrait de cellule native. Par conséquent, une boîte à outils S.venezuelae TX-TL à haut rendement a récemment été mise en place pour exploiter ces capacités uniques5.

Streptomyces venezuelae est un hôte émergent pour la biologie synthétique avec une riche histoire en biotechnologie industrielle5,27,28,29 et en tant que système modèle pour l’étude de la division cellulaire et de la régulation génétique chez les Actinobactéries30,31,32. La souche de type principal, S. venezuelae ATCC 10712, a un génome relativement grand de 8,22 Mb avec une teneur en G+C de 72,5% (%) (numéro d’acquisition: CP029197), qui code 7377 séquences codantes, 21 ARNr, 67 ARNt et 30 groupes de gènes biosynthétiques27. En biologie synthétique, S. venezuelae ATCC 10712 est un châssis attrayant pour l’expression hétérologue des voies biosynthétiques. Contrairement à la plupart des autres taches streptomyces, il offre plusieurs avantages clés, notamment un temps de doublement rapide (~ 40 min), une vaste gamme d’outils génétiques et expérimentaux5,28, l’absence d’agglutination mycélienne et la sporulation dans les milieux liquides28,33. Plusieurs études ont également démontré l’utilisation de S. venezuelae pour la production hétérologue d’un large éventail de métabolites secondaires, y compris les polycétides, les peptides ribosomiques et non ribosomaux34,35,36,37,38. Ces caractéristiques combinées font de cette souche un hôte microbien attrayant pour les applications de biologie synthétique et d’ingénierie métabolique. Bien que S. venezuelae ne soit pas le modèle dominant de Streptomyces pour l’expression des gènes hétérologues, avec d’autres développements, il est prêt pour une utilisation plus large dans la découverte de produits naturels.

Ce manuscrit présente un protocole détaillé (Figure 1) pour un système S. venezuelae TX-TL à haut rendement, qui a été mis à jour par rapport au protocole original précédemment publié26. Dans ce travail, la solution énergétique et les conditions de réaction ont été optimisées pour augmenter le rendement en protéines jusqu’à 260 μg/mL pour la protéine rapporteure mScarlet-I dans une réaction par lots de 4 h, 10 μL, en utilisant un plasmide standard, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Ce plasmide a été spécialement conçu pour permettre diverses méthodes de détection de l’expression des protéines. Le protocole est également rationalisé, tandis que le système énergétique a été optimisé pour réduire la complexité et le coût de la mise en place de réactions sans cellules sans compromettre le rendement. Parallèlement au système TX-TL optimisé, une bibliothèque de parties génétiques a été développée pour affiner l’expression des gènes et en tant qu’outils fluorescents pour surveiller TX-TL en temps réel, créant ainsi une plate-forme polyvalente pour le prototypage de l’expression génique et des voies biosynthétiques de produits naturels de Streptomyces spp. et d’Actinobactéries apparentées.

Dans ce travail, le plasmide standard recommandé (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) peut être utilisé pour établir le flux de travail S. venezuelae TX-TL dans un nouveau laboratoire et est disponible sur AddGene (voir le tableau supplémentaire S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I offre à l’utilisateur la flexibilité d’étudier d’autres cadres de lecture ouverts (ORF). L’ORF mScarlet-I est optimisé pour le codon pour l’expression du gène S. venezuelae. Le promoteur SP44 est un puissant promoteur constitutif qui est très actif chez E. coli et Streptomyces spp.39. Le plasmide possède deux sites enzymatiques de restriction uniques (NdeI, BamHI) pour permettre le sous-clonage de nouveaux ORF dans le cadre avec un marqueur FLAG C-terminal commun et un système d’étiquette de liant en épingle à cheveux arsenical de la fluorescéine (FlAsH). Alternativement, les deux étiquettes peuvent être retirées avec l’inclusion d’un codon stop après le sous-clonage d’un nouveau gène. Avec ce vecteur de base, l’expression à haut rendement d’une gamme de protéines a été démontrée, à savoir des protéines de la voie de biosynthèse de l’oxytétracycline et une peptide synthétase non ribosomale non caractérisée (NRPS) de Streptomyces rimosus (Figure 2). En termes de détection de l’ARNm, le plasmide standard pTU1-A-SP44-mScarlet-I contient un aptamère dBroccoli (dans la région 3'-non traduite) pour la détection avec la sonde 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidène imidazolinone (DFHBI). Pour une flexibilité accrue, un ensemble d’outils de pièces MoClo compatibles EcoFlex40 a également été mis à disposition sur AddGene, y compris un vecteur navette Streptomyces compatible EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) et une gamme de plasmides variants pTU1-A-SP44 exprimant la protéine de fluorescence verte superfolder (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I et β-glucuronidase (GUS). En particulier, le plasmide pSF1C-A est dérivé de pAV-gapdh28 et est guéri des sites BsaI/BsmBI pour l’assemblage MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP est équivalent à pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP d’EcoFlex40 mais contient des fonctionnalités supplémentaires pour la conjugaison et l’intégration chromosomique dans Streptomyces spp. en utilisant le système d’intégration phiC3128.

La première étape du protocole implique la croissance de la S. venezuelae ATCC 10712 ou d’une souche étroitement apparentée, la récolte de cellules à mi-exponentielle, les étapes de lavage des cellules et l’équilibrage dans les tampons S30A et S30B. Cette étape nécessite trois jours et le temps nécessaire à la croissance cellulaire peut être utilisé pour préparer les composants restants comme décrit ci-dessous. Les cellules récoltées sont ensuite lysées par sonication, clarifiées et subissent une réaction de ruissellement. À cette étape finale de la préparation, les extraits cellulaires peuvent être préparés pour un stockage à long terme à -80 ° C afin de minimiser la perte d’activité. Pour l’assemblage des réactions TX-TL à l’aide de ce protocole, un Streptomyces Master Mix (SMM) est présenté, avec l’option d’un format MES (Minimal Energy Solution) qui donne des rendements comparables. En outre, il est recommandé de strier une culture fraîche de S. venezuelae ATCC 10712 à partir d’un stock de glycérol de -80 °C sur une plaque de gélose GYM et d’incuber à 28 °C pendant au moins 48 à 72 h jusqu’à ce que des colonies uniques soient visibles. Seules les cultures fraîches doivent être utilisées pour les étapes suivantes.

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Protocol

REMARQUE: Voir le tableau 1 et le tableau 2 pour les recettes de gym medium et de plaque de gélose et de tampons de lavage S30A et S30B.

1. Préparation des solutions et orientations générales

  1. Conservez toutes les solutions, cellules (post-croissance) et extraits de cellules sur la glace après la préparation, sauf exception.
  2. Stocker les stocks de 1 M Mg-glutamate, 4 M K-glutamate, 40% (p / v) PEG 6000, 1 g / mL d’acide polyvinylsulfonique à température ambiante et tous les autres stocks à -80 ° C. Minimiser le nombre de cycles de gel-dégel pour éviter la dégradation chimique.
  3. Pour la préparation de stocks de solutions énergétiques (voir tableau 3) tels que le 3-PGA (nécessite un ajustement du pH), suivez les directives fournies dans le protocole E. coli TX-TL41.
    REMARQUE: Tous les composants sont entièrement solubles dans le ddH2O et stockés sous forme d’aliquotes dans le congélateur à -80 ° C.
  4. Dégivrer des stocks individuels ou des solutions énergétiques (décrites plus loin) sur de la glace. Chauffer le stock d’acides aminés à 42 °C avec un vortex pendant ~15-30 min pour solubiliser tous les acides aminés.
  5. Comme certains acides aminés (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) précipitent sur la glace, tout en minimisant le temps de repos, laissez cette solution à température ambiante et utilisez un vortex pour se dissoudre.
  6. Ajouter les volumes calculés (tableau 3) de solutions mères et d’eau et bien mélanger à l’aide d’un vortex.
  7. Aliquoter la solution énergétique sous forme d’aliquotes de 20 à 100 μL par tube ou, selon vos besoins, sur de la glace et conserver à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

2. Préparation des cellules S. venezuelae ATCC 10712

  1. Jour 1 - Préparation des milieux/tampons et pré-culture pendant la nuit
    1. Préparer 1 L de milieu liquide stérile GYM dans une fiole déconcertée de 2 L, comme décrit dans le tableau 1. Voir le tableau des matériaux pour connaître les sources d’équipement,de produits chimiques et de réactifs.
    2. Préparer 1 x 50 mL de milieu liquide stérile GYM dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL, comme décrit dans le tableau 1.
    3. Préparer 100 mL de 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 mL de 1 M MgCl2 et 500 mL de 4 M NH4Cl pour fabriquer 1 L de tampons de lavage S30A et 1 L de tampons de lavage S30B. Voir tableau 2 pour les recettes.
    4. Préparez la pré-culture du jour au lendemain. Préchauffer les 50 mL stériles du milieu liquide GYM dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL à 28 °C pendant 30 min.
    5. Inoculer une seule colonie de S. venezuelae ATCC 10712 (ou souche apparentée) à partir d’une plaque de gélose GYM dans 50 mL de milieu liquide GYM préavertissé et incuber à 28 °C, 200 tr/min pendant 16 h (pré-culture pendant la nuit).
  2. Jour 2- Préparer la pré-culture diurne et la culture de croissance principale.
    1. Préchauffer 50 mL de milieu liquide stérile GYM dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL à 28 °C pendant 30 min.
    2. Transférer 1 mL de pré-culture pendant la nuit dans 50 mL de milieu liquide GYM préchauffé et incuber à 28 °C, 200 tr/min pendant 8 h (pré-culture diurne).
    3. Après cette période de croissance, vérifiez l’OD600 dans un spectrophotomètre à l’aide d’une dilution 1:10 avec un milieu GYM stérile dans une cuvette en plastique de 1 mL (longueur de trajet de 1 cm).
      REMARQUE: L’OD600 doit avoir atteint au moins 3-4. S’il y a une mauvaise croissance, il est conseillé de répéter les étapes 2.2.1-2.2.2.
    4. Sous-culture 0,25 mL de pré-culture diurne dans 1 L de milieu liquide GYM dans des flacons déconcertés de 2 L.
    5. Agiter toute la nuit à 28 °C, 200 tr/min pendant 14 h.
  3. Jour 3- Récolter des cellules
    1. Après la période d’incubation précédente (14 h), enregistrez l’OD600 de la culture principale. Diluer la culture pendant la nuit 1:10 avec un milieu GYM frais pour la mesure de l’OD600 .
      REMARQUE: L’OD600 devrait avoir atteint 3.0-4.0 à ce stade.
    2. Si OD600<3.0, augmentez la vitesse de secousse à 250-300 tr/min et augmentez jusqu’à ce qu’un OD600 de 3.0 soit atteint. Ne pas cultiver plus de 2 h supplémentaires (16 h au total).
    3. Si OD600>3.0, transférer les cultures dans des récipients de centrifugation et refroidir rapidement sur de la glace humide pendant 30 min.
    4. En attendant que la culture cellulaire refroidisse sur la glace, préparez 4 mL de tampons frais de 1 M de dithiothréitol (TNT), S30A et S30B, comme décrit dans le tableau 1, et conservez-les sur la glace. Voir le tableau des matériaux pour la source chimique/réactif.
    5. Pré-peser un tube de centrifugeuse vide de 50 mL et pré-refroidir à -20 °C.
    6. Ajouter 2 mL de 1 M TNT à 1 L de tampon S30A sur glace et bien mélanger.
      REMARQUE: Ajoutez DTT aux tampons de lavage S30A et S30B uniquement avant de les utiliser.
    7. Centrifugez les cellules à 6 000 × g, 4 °C, 10 min, et jetez soigneusement le surnageant en un seul mouvement rapide.
      REMARQUE: Si la pastille est perturbée, maximiser la rétention cellulaire avec le milieu GYM résiduel et poursuivre le protocole.
    8. Ajouter 500 mL de tampon S30A et remettre en suspension les cellules en secouant vigoureusement les bouteilles de centrifugation jusqu’à ce que les amas cellulaires soient dispersés de manière homogène.
    9. Centrifugez les cellules à 6 000 × g, 4 °C, 6 min et jetez soigneusement le surnageant.
      REMARQUE : Bien que la pastille de cellule soit plus ferme à ce stade, certaines cellules resteront en suspension (voir la figure 1). Traiter comme décrit au point 2.3.7 et retenir autant de cellules que possible.
    10. Répétez les étapes 2.3.8 à 2.3.9.
    11. Ajouter 2 mL de 1 M TNT à 1 L de tampon S30B sur la glace et bien mélanger. Ajoutez 500 mL de tampon S30B aux cellules. Répétez l’étape 2.3.9.
    12. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de tampon S30B et la transférer dans le tube centrifugeur de 50 mL pré-pesé et pré-réfrigéré. Si nécessaire, transférez les cellules résiduelles avec 5 à 10 mL supplémentaires de tampon S30B. Remplir à 50 mL avec S30B.
    13. Centrifuger les cellules à 6 000 × g, 4 °C, 10 min, et éliminer soigneusement le surnageant.
    14. Répétez l’étape 2.3.13.
    15. Aspirer soigneusement le surnageant S30B restant avec une pipette de 100 à 200 μL.
    16. Peser la pastille de cellule humide.
      REMARQUE: Le poids typique des granulés de cellules humides pour 1 L de culture GYM pendant la nuit (OD600 = 3,0) est d’environ 4,5 g.
    17. Pour chaque 1 g de cellules humides, ajoutez 0,9 mL de tampon S30B. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’un vortex.
    18. Centrifuger brièvement (~10 s) jusqu’à 500 × g pour sédimenter les cellules.
      REMARQUE: Le protocole peut être suspendu à ce stade, et les cellules peuvent être congelées sur de l’azote liquide ou de la glace carbonique et stockées à -80 ° C. Pour des raisons de sécurité, portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous manipulez de l’azote liquide, y compris des écrans faciaux et des gants.

3. Lyse cellulaire par sonication pour obtenir l’extrait cellulaire brut

REMARQUE: À ce stade, l’utilisateur peut choisir de perturber les cellules par sonication soit en fractions de 1 mL (option 1), soit en suspension cellulaire plus grande (5 mL) dans un tube de 50 mL (option 2). Les deux options ont été détaillées ci-dessous pour assurer la reproductibilité, car le volume final de la suspension cellulaire peut changer en raison de la perte de cellules lors des étapes précédentes de récolte et de lavage. Un nouvel utilisateur doit d’abord essayer l’option 2.1 pour établir le protocole.

  1. Lyse cellulaire par sonication en fractions de 1 mL
    1. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL (couper l’extrémité de la pointe pour augmenter la taille de l’alésage), transférer 1 mL de la suspension de la cellule dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL.
      REMARQUE: Si les cellules sont congelées, décongeler rapidement le tube de 50 mL contenant la pastille dans de l’eau tiède avant la lyse cellulaire. Transférer le tube sur de la glace humide dès que la pastille a commencé à décongeler et refroidir pendant 10 minutes.
    2. Placez chaque tube de microcentrifugation dans un bécher d’eau glacée, en utilisant un support à tubes en plastique pour maintenir le tube pour la sonication.
      REMARQUE: En raison de la sensibilité de l’extrait cellulaire à la surchauffe, il est essentiel de s’assurer que les tubes ne se réchauffent pas pour empêcher la précipitation des protéines et réduire l’activité enzymatique.
    3. Utilisez une sonde sonique avec une pointe de 3 mm de diamètre et nettoyez-la avec de l’éthanol à 70% (v / v) et de l’eau distillée en double (ddH2O). Abaissez la pointe du sonicateur dans la suspension de la cellule jusqu’à ce qu’elle soit à environ 1 cm sous la surface du liquide.
    4. Entrez les paramètres suivants dans le sonicator: fréquence 20 kHz, amplitude 65%, temps ON d’impulsion de 10 s, temps d’arrêt d’impulsion de 10 s, temps de sonication total de 1 min.
    5. Exécutez le protocole de sonication. Déplacez le tube vers le haut / vers le bas et latéralement pendant les deux premiers cycles de repos pour vous assurer que les cellules sont soniquées uniformément. Enregistrez l’apport d’énergie.
      REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, portez une protection auditive appropriée pendant la sonication. La viscosité diminuera à mesure que les cellules seront perturbées, et la pastille de cellule humide crème pâle devrait se transformer en un fluide brun homogène. L’apport énergétique recommandé est de 240 J par mL de cellules humides. Si les cellules ne sont que partiellement lysées, la suspension apparaîtra toujours de couleur crème avec des amas visqueux de cellules, en particulier sur les côtés du tube.
    6. Inverser le tube 2-3 fois et répéter la sonication pendant un ou deux cycles supplémentaires de 10 s, en mélangeant fréquemment jusqu’à ce que les cellules soient complètement perturbées.
  2. Lyse cellulaire par sonication d’une suspension cellulaire de 5 mL
    1. Si les cellules sont congelées, décongeler rapidement le tube de 50 mL contenant la pastille dans de l’eau tiède en agitant avant la lyse cellulaire. Transférer le tube sur de la glace humide dès que la pastille a commencé à décongeler et refroidir pendant 10 minutes.
    2. Faites tourner brièvement le tube à 500 x g pour sédimenter les cellules.
    3. Placez le tube de 50 mL dans un bécher d’eau glacée pour la sonication.
      REMARQUE: En raison de la sensibilité de l’extrait cellulaire à la surchauffe, il est essentiel de s’assurer que les tubes ne se réchauffent pas pour empêcher la précipitation des protéines et réduire l’activité enzymatique.
    4. Utilisez une sonde sonique avec une pointe de 6 mm de diamètre et nettoyez-la avec de l’éthanol à 70 % (v/v) et du ddH2O (voir le schéma visuel de la sonde de 6 mm à la figure 1). Abaissez la pointe du sonicateur dans la suspension de la cellule (~5 mL) jusqu’à ce qu’elle soit à ~1 cm sous la surface du liquide.
    5. Entrez les paramètres suivants dans le sonicator : fréquence 20 kHz, amplitude 65 %, temps ON d’impulsion de 10 s, temps d’arrêt d’impulsion de 10 s, temps de sonication total de 1 min par mL de cellules humides (5 min au total).
    6. Exécutez le protocole de sonication. Déplacez le tube vers le haut / vers le bas et latéralement pendant les deux premiers cycles de repos pour vous assurer que les cellules sont soniquées uniformément.
      REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, portez une protection auditive appropriée pendant la sonication. La viscosité diminuera à mesure que les cellules seront perturbées et que la pastille de cellule humide crème pâle devrait se transformer en un fluide brun homogène. Enregistrez l’apport d’énergie. Un apport énergétique optimal de 240 J par mL de cellules humides (~1200 J au total à partir de 5 min de sonication) est recommandé.
    7. Si certaines cellules restent intactes, suivez les instructions de l’étape 3.1.5.
    8. Transférer les extraits cellulaires dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL.

4. Clarification de l’extrait cellulaire et réaction de ruissellement

  1. Centrifuger les cellules lysées à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL sous forme d’aliquotes de 1 mL.
  2. Effectuer la réaction de ruissellement pour les extraits de cellules. Incuber les tubes de 1,5 mL contenant les extraits cellulaires à 30 °C pendant 60 min sur un bloc thermique ou un incubateur sans secousse.
  3. Centrifuger les extraits de cellules à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Regrouper les surnageants dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Mélangez le surnageant en inversant le tube cinq fois jusqu’à ce qu’il soit homogène, puis conservez-le sur la glace. Inverser doucement pour éviter la formation de bulles d’air.
  4. Diluer 10 μL de l’extrait cellulaire 100 fois avec un tampon S30B et mesurer la concentration totale en protéines à l’aide d’un test de Bradford avec trois répétitions techniques (voir Le matériau supplémentaire S2 pour les conseils de test de Bradford).
  5. Si la concentration en protéines est de 20 à 25 mg/mL, transférer les extraits cellulaires sous forme de aliquotes de 100 μL dans de nouveaux tubes de 1,5 mL, congeler dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.
    REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, portez un EPI approprié lorsque vous manipulez de l’azote liquide, y compris des écrans faciaux et des gants.
  6. Si la concentration en protéines est de <20 mg/mL, répétez les étapes de préparation de l’extrait brut pour vous assurer que les rendements en extrait cellulaire et en TX-TL de haute qualité sont comparables aux travaux publiés précédemment5.

5. Préparation du gabarit d’ADN plasmidique

  1. Purifier le plasmide pTU1-A-SP44-mScarlet-I (origine pUC19) d’une souche de plasmide E. coli fraîchement transformée (DH10β, JM109) cultivée dans 50 mL de culture LB (avec 100 mg/mL de carbenicilline) à l’aide d’un kit de purification de l’ADN plasmidique approprié conformément aux instructions du fabricant.
  2. Éluez le plasmide dans 2 x 300 μL d’eau sans nucléase et combinez les fractions.
  3. Ajouter 0,1 volume (66 μL) d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2).
  4. Ajouter 0,7 volume (462 μL) d’isopropanol.
  5. Incuber l’ADN à -20 °C pendant 30 min.
  6. Centrifuger à 16 000 × g pendant 30 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  7. Ajouter 2 mL d’éthanol à 70 % (v/v) à la pastille d’ADN.
  8. Inverser le tube 3-4 fois pour remettre en suspension la pastille d’ADN plasmidique.
  9. Centrifuger à 16 000 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  10. Répétez les étapes 5.7 à 5.9 et retirez tout le liquide visible.
  11. Sécher à l’air libre la pastille d’ADN pendant 10-30 min ou sécher pendant 5 min avec une centrifugeuse à vide.
  12. Remettre en suspension la pastille séchée avec 600 μL de ddH2O sans nucléase.
  13. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
  14. Préparer des aliquotes de 50 à 100 μL et les conserver à -20 °C.
    REMARQUE: Une concentration élevée d’ADN dans la gamme de 500-1000 ng / μL est recommandée en raison des contraintes de volume serrées des réactions sans cellules. Diluer le stock d’ADN plasmidique à 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmide équivaut à 80 nM.

6. Préparation de la solution Streptomyces Master Mix (SMM)

  1. Solution d’acides aminés
    1. Utilisez le kit d’échantillonneur d’acides aminés pour éviter les erreurs manuelles et réduire le temps de préparation, en suivant les instructions du fabricant fournies en ligne.
    2. Diluer la solution mère d’acides aminés 20x en utilisant ddH2O à une concentration finale de 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Diluer davantage à 2,4 mM (2 mM L-Leu) dans la solution 2,4x SMM (voir tableau 3).
      REMARQUE: La concentration finale dans la réaction TX-TL est de 1 mM 19x d’acides aminés et de 0,83 mM de L-Leu.
  2. Solution énergétique et additifs
    1. Préparez les autres composants de la solution SMM 2,4x en suivant la recette décrite dans le tableau 3.
    2. Vous pouvez également préparer une solution énergétique minimale (MES) 2,4x, en suivant la recette décrite dans le tableau 3.

7. Mise en place d’une réaction S. venezuelae TX-TL standard

  1. Décongeler l’extrait cellulaire, la solution SMM (ou MES) et l’ADN plasmidique sur la glace. Pré-refroidir une plaque de 384 puits à -20 °C.
  2. Mettre en place des réactions TX-TL où 25% du volume est de l’ADN plasmidique, 33,33% est de l’extrait de cellule et 41,67% est une solution de SMM ; gardez-les sur la glace pour éviter le biais de l’heure de début.
    REMARQUE : Un modèle TX-TL standard a été fourni (tableau 4) pour calculer le volume de réactifs nécessaires en fonction du nombre de réactions. Le volume standard pour une réaction de 33 μL est le suivant : 11 μL d’extrait cellulaire, 13,75 μL de SMM et 8,25 μL d’ADN plasmidique.
  3. Vaporisez doucement le mélange pendant environ 5 s à basse vitesse pour vous assurer que la solution est homogène. Évitez la formation de mousse ou de bulles.
  4. Transférer des aliquotes de 10 μL dans trois puits d’une plaque de 384 puits en tant que triplicate technique sans introduire de bulles d’air. Scellez la plaque avec un couvercle transparent et faites tourner à 400 × g pendant 5 s.
  5. Incuber la réaction à 28 °C soit dans un incubateur (pour les lectures de point final) ou dans un lecteur de plaques sans secousse.
    REMARQUE: Les réactions nécessitent généralement 3-4 h pour atteindre leur achèvement. Voir Matériau supplémentaire S2 pour obtenir des conseils sur un lecteur de plaques et les mesures standard mScarlet-I.

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Representative Results

Ce protocole détaillé est fourni à titre d’exemple pour aider l’utilisateur à établir un système Streptomyces TX-TL basé sur la souche modèle S. venezuelae ATCC 10712 (Figure 1). L’utilisateur peut chercher à étudier d’autres souches de Streptomyces; cependant, les étapes de croissance/récolte d’autres souches avec des temps de doublement plus longs ou des préférences de croissance distinctes devront être optimisées sur mesure pour obtenir des résultats optimaux. Pour le résultat représentatif, la protéine fluorescente mScarlet-I du plasmide standard pTU1-A-SP44-mScarlet-I (Figure 2 et Figure 3) a été optimisée pour fournir une expression à haut rendement dans S. venezuelae TX-TL avec une gamme de méthodes de détection (SDS-PAGE, fluorescence). De plus, ce plasmide étalon a été modifié pour démontrer la synthèse d’une gamme d’enzymes métabolites secondaires de S. rimosus (Figure 2)5. Enfin, un flux de travail potentiel pour la biosynthèse de produits naturels à grande échelle est présenté comme un schéma pour l’utilisation d’une voie de modèle dès les premiers stades de la biosynthèse de l’hème. Le flux de travail est potentiellement adaptable à d’autres voies biosynthétiques de métabolites secondaires. À titre indicatif, ce protocole devrait fournir un rendement minimum de 2,8 μM pour le sfGFP et de 3,5 μM pour mScarlet-I/mVenus à partir des plasmides d’expression fournis sur AddGene. Ces chiffres tiennent compte de la variation typique des lots (jusqu’à 28 %) observée dans les données précédentes5, bien que des rendements supérieurs à 10 μM mScarlet-I aient été obtenus avec des lots optimaux (données non publiées).

Mesure de S. venezuelae TX-TL du gène mScarlet-I à l’aide de cinq méthodes distinctes
L’expression du plasmide standard pTU1-A-SP44-mScarlet-I est montrée, avec la mesure de l’expression de mScarlet-I à l’aide de cinq méthodes différentes: 1. mesure de fluorescence en temps réel de l’ARNm à l’aide de l’aptamère dBroccoli, 2. mesure de fluorescence en temps réel de la protéine mScarlet-I immature à l’aide du système de marquage FlAsH, 3. mesure de fluorescence en temps réel de la protéine mScarlet-I mature, 4. coloration de fluorescence en gel de mScarlet-I à l’aide de la balise FlAsH, et 5. Coloration bleu de Coomassie des protéines totales sans cellules. Pour ces données, les réactions ont été mises en place dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL sous forme de réactions de 33 μL (pour les échantillons de point final) ou sous forme de triplet technique de 10 μL dans des plaques de 384 puits dans un lecteur de plaques. Une protéine mScarlet-I triple marquée (N-terminal His6, C-terminal Flag et C-terminal FlAsH) a été purifiée séparément pour créer un étalon d’étalonnage pour les mesures, en utilisant le plasmide pET15b-mScarlet-I, qui est décrit plus en détail dans le matériau supplémentaire S2. Les données de ces expériences sont présentées à la figure 3. De plus amples détails sur la méthode de coloration par fluorescence dans le gel sont disponibles dans le matériau supplémentaire S3.

S. venezuelae TX-TL de la biosynthèse de l’hème à un stade précoce
Pour servir de voie biosynthétique de produit naturel modèle, la biosynthèse « à un pot » de l’uroporphyrinogène III (uro’gen III) a été réalisée à l’aide du plasmide d’expression pTU1-A-SP44-hemC-hemD/cysGA-hemB5. Cette voie biosynthétique modèle a été choisie car l’uro’gen III est très sensible à l’oxygène et s’oxyde rapidement (perte de six électrons) en uroporphyrine III, qui présente une forte fluorescence rouge. Cela permet de détecter facilement la réaction en temps réel à l’aide de mesures de fluorescence et/ou de HPLC-MS (Figure 4), comme décrit précédemment5. De plus, ces réactions ont été étudiées à l’aide d’une méthode par lots ou semi-continue. Une réaction semi-continue est une stratégie qui utilise un dispositif de microdialyse42,43 qui fournit de l’énergie supplémentaire (NTP, source d’énergie secondaire) et des acides aminés pour prolonger le temps de réaction et augmenter les rendements de synthèse des protéines. Ici, la méthode semi-continue est utilisée pour mettre à l’échelle la réaction du modèle hémique et séparer les protéines TX-TL du produit de réaction afin de faciliter la purification et l’analyse par HPLC-MS. De plus amples détails sur les méthodes sont disponibles dans le document supplémentaire S4 ou, pour les données, voir les travaux précédents5. Des réactions semi-continues sans cellules sont également décrites dans des travaux antérieurs42,43. L’exemple de flux de travail schématique illustré ici (Figure 4) est potentiellement adaptable à d’autres voies biosynthétiques de produits naturels.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole TX-TL de Streptomyces venezuelae. Un résumé du protocole est illustré, y compris un délai recommandé de trois jours. Le protocole est décomposé en étapes distinctes de croissance cellulaire, de récolte cellulaire, de lavage cellulaire, de lyse cellulaire par sonication, de clarification, de réaction de ruissellement, de préparation du mélange maître (SMM), de préparation de l’ADN plasmidique et de l’assemblage de réaction TX-TL. Le protocole complet est décrit en détail dans le texte, ainsi que des conseils et des conseils pratiques. Abréviations : SMM = Streptomyces Master Mix ; TX-TL = transcription-traduction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Synthèse de protéines à haut rendement à partir de gènes G+C (%) élevés. (A) Synthèse de protéines fluorescentes sfGFP, mVenus-I et mScarlet-I. (B) Synthèse d’enzymes biosynthétiques de Streptomyces rimosus. Abréviation: EV = Vecteur vide; NRPS = peptide synthétase non ribosomale. Le chiffre est modifié à partir de 5. Veuillez consulter le protocole et les fichiers supplémentaires pour la configuration et la méthodologie de la réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Mesure des cinq voies TX-TL avec le plasmide pTU1-A-SP44-mScarlet-I. (A) Conception plasmidique comprenant les caractéristiques suivantes: SP44 est un puissant promoteur constitutif actif chez Streptomyces spp. et E. coli; pET-RBS est dérivé des plasmides d’expression de pET et est très actif dans Streptomyces spp. et E. coli5,40; Streptomyces codon-optimisé mScarlet-I gène, qui code pour un dérivé de protéine fluorescente rouge44; Marqueur FLAG C-terminal pour la purification par chromatographie d’affinité ou la détection par transfert western; Étiquette FlAsH C-terminale pour le marquage fluorescent pour la coloration dans le gel ou la mesure en temps réel de la synthèse naissante des protéines; aptamère dBroccoli pour la mesure de l’ARNm en temps réel à l’aide de la sonde DFHBI; Bba_B0015 terminateur de transcription, qui sont très efficaces dans S. venezuelae ATCC 107125; marqueur de résistance à l’ampicilline; et l’origine pUC19 de la réplication. (B) Expression de l’ARNm en temps réel, détectée avec l’aptamère dBroccoli et la sonde DFHBI (excitation 483-14 nm, émission 530-30 nm). (C) Détection en temps réel de la synthèse des protéines naissantes avec sonde fluorescente FlAsH-EDT2 (excitation 500-10 nm, émission 535-10 nm). (D) Mesure de fluorescence en temps réel de la synthèse mScarlet-I (excitation 565-10 nm, émission 600-10 nm). (E) Coloration dans le gel avec la sonde fluorescente FlAsH-EDT2. (F) Coloration bleu de Coomassie des protéines TX-TL totales avec la norme His6-mScarlet-I purifiée à des fins de comparaison. Les réactions ont été exécutées dans les conditions décrites dans le protocole avec 40 nM de gabarit d’ADN plasmidique. Toutes les données de fluorescence sont représentées sous forme de RFU, et les barres d’erreur (écart type de trois répétitions techniques) sont représentées dans une zone grisée. Abréviations : TX-TL = transcription-traduction ; FlAsH = fluorescein arsenical hairpin; DFHBI = 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidène imidazolinone; RFU = unités de fluorescence relatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Flux de travail schématique pour la réaction semi-continue S. venezuelae TX-TL. Un exemple de flux de travail pour le produit naturel TX-TL, utilisant l’opéron biosynthétique de l’hème à un stade précoce et l’analyse en aval par HPLC-MS. Les réactions et l’analyse sont détaillées dans le matériel supplémentaire. Le chiffre est modifié à partir de 5. Abréviations : SMM = Streptomyces Master Mix ; TX-TL = transcription-traduction; ALA = acide 5-aminolévulinique; SPE = extraction en phase solide; ESI-MS = spectrométrie de masse par ionisation par pulvérisation d’électrons; HPLC-MS = chromatographie liquide haute performance-spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Recette du milieu de croissance bactérienne GYM et de la plaque de gélose GYM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Réactifs pour la préparation des tampons de lavage S30A et S30B. Cette information a été adaptée de Kieser et al. 45 Abréviation : TNT = dithiothréitol. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Recette pour fabriquer les solutions MES et SMM de S. venezuelae. Abréviations : MES = Solution énergétique minimale; SMM = Streptomyces Master Mix; NTP = nucléoside triphosphate; PEG 6000 = polyéthylène glycol 6000; 3-PGA = 3-phosphoglycérate; G6P = glucose-6-phosphate; PVSA = acide polyvinylsulfonique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Recette de la réaction TX-TL de S. venezuelae. Abréviations : MES = Solution énergétique minimale; SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transcription-traduction. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S1 : Plasmides pour le flux de travail S. venezuelae TX-TL. Abréviation : TX-TL = transcription-traduction. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Matériau supplémentaire S2: préparation standard d’étalonnage mScarlet-I et mesures du lecteur de plaques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Matériau supplémentaire S3: Méthodes d’étiquette FlAsH. Abréviation : FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Matériau supplémentaire S4 : Réaction semi-continue, purification et HPLC-MS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Dans ce manuscrit, un protocole S. venezuelae TX-TL à haut rendement a été décrit avec des étapes détaillées qui sont simples à mener pour les utilisateurs expérimentés et nouveaux des systèmes TX-TL. Plusieurs caractéristiques des protocoles Streptomyces45 et E. coli TX-TL41 existants ont été supprimées pour établir un protocole minimal, mais à haut rendement pour S. venezuelae TX-TL5,26. Le flux de travail recommandé ici est de s’assurer que S. venezuelae se développe rapidement dans le milieu riche choisi, pour pouvoir inoculer la culture finale le soir. Cela permet la récolte cellulaire au pic de croissance le lendemain matin et permet à l’utilisateur de récolter et de préparer l’extrait cellulaire actif le même jour. En suivant ce protocole simplifié, on s’attend à ce qu’un seul chercheur puisse compléter le protocole facilement dans un cadre de trois jours. Une boîte à outils plasmidique complémentaire a également été fournie pour le système S. venezuelae TX-TL, y compris un système plasmidique d’expression forte (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), qui offre de vastes fonctionnalités pour l’analyse de l’ARNm / protéine. Ce plasmide standard est alimenté par le promoteur constitutif SP44 qui est très actif dans une gamme de Streptomyces spp. et dans E. coli39. Pour démontrer le potentiel initial de la boîte à outils S. venezuelae TX-TL, les résultats représentatifs montrent la synthèse à haut rendement d’une gamme de protéines fluorescentes, d’enzymes métabolites secondaires et la biosynthèse d’une voie de produit naturel modèle (à partir de la biosynthèse de l’hème).

Dans l’ensemble, le protocole contient une description détaillée du système S. venezuelae TX-TL, ainsi que des conseils pratiques pour préparer les trois composants essentiels de la réaction TX-TL: (1) extrait cellulaire, (2) solution Streptomyces Master Mix (SMM) et (3) ADN plasmidique. Ce protocole ne nécessite pas d’équipement spécialisé et ne nécessite que des compétences de routine en microbiologie et en biochimie; par conséquent, il est accessible à la plupart des laboratoires. Le protocole est adapté aux réactions à petite échelle (10-100 μL) et à plus grande échelle (~ 2,5 mL), bien qu’une certaine optimisation de la taille / aération de la réaction puisse influencer le rendement en protéines. Le volume de réaction recommandé est de 33 μL dans un tube de 2 mL ou de 10 μL dans une plaque de 384 puits. L’extrait brut prend cinq jours à préparer par une seule personne à partir d’un stock de glycérol. Chaque litre (L) de culture donne au moins 5 mL d’extrait cellulaire (équivalent à ~ 1500 x 10 μL de réactions TX-TL) - il s’agit d’une estimation prudente et tient compte de la perte d’échantillon pendant les étapes de lavage et de clarification de l’extrait cellulaire. Chaque étape du protocole est indépendante et peut être optimisée par l’utilisateur pour répondre à ses besoins. Une limitation majeure pour tous les systèmes sans cellules est la variation par lots46,47. Les facteurs génériques incluent l’erreur de pipetage, l’expérience utilisateur, la variation des lots de supports et les différences d’équipement. Nous introduisons spécifiquement un mélange maître pour minimiser les erreurs de pipetage et fournissons des instructions détaillées qui couvrent l’utilisation des supports et de l’équipement. À ce jour, le protocole est reproductible par un éventail d’utilisateurs dans au moins cinq groupes de recherche britanniques. Cependant, on ne sait pas quel rôle la variation biologique contribue à la variabilité des lots sans cellules. Parallèlement aux différences mondiales de régulation de l’expression génique, la plasticité du génome chez Streptomyces spp. est largement rapportée et constitue un contributeur potentiel48. Pour étudier la variation des lots, il est recommandé de cultiver jusqu’à quatre cultures distinctes de 1 L dérivées de quatre colonies uniques cultivées pendant la nuit. Auparavant, jusqu’à 28 % de variation (en termes d’écart-type) a été observée entre quatre lots biologiques (4 L par lot fourni ~20 mL d’extrait cellulaire)5. Sur la base de ces données, une cible minimale raisonnable pour un nouvel utilisateur est de 2,8 μM pour sfGFP et de 3,5 μM mScarlet-I/mVenus-I en utilisant les plasmides disponibles sur AddGene - ces cibles sont 30% inférieures à la moyenne observée dans les données précédentes. Si une analyse HPLC-MS en aval est souhaitée, le PEG 6000 peut être retiré des mélanges maîtres, bien qu’une diminution du rendement global tx-TL puisse être attendue jusqu’à 50%.

En ce qui concerne le potentiel des systèmes spécialisés sans cellules Streptomyces5,6, il existe un désir croissant de développer de nouveaux outils de laboratoire humide pour des applications de bioprospection telles que les produits naturels. Le genre Streptomyces est imprégné de l’histoire de la découverte de produits naturels, y compris les antibiotiques, les herbicides et les médicaments pharmaceutiques49. Les connaissances croissantes acquises grâce aux projets de séquençage du génome entier et aux derniers outils bioinformatiques50,51,52 ont révélé un niveau sans précédent de produits naturels codés par les BGC dans les génomes microbiens53. Le déverrouillage de cette information génétique , qui devrait contenir de nouveaux médicaments/produits chimiques et enzymes utiles à la biotechnologie - nécessitera le développement de nouvelles stratégies de biologie synthétique, y compris de nouveaux systèmes d’expression et une gamme d’outils d’ingénierie métabolique54. Les systèmes TX-TL spécialisés à base de streptomyces sont avantageux pour étudier les gènes et les éléments régulateurs des actinobactéries et des génomes apparentés pour les raisons suivantes : [1] disponibilité d’un environnement de repliement des protéines natives26, [2] accès à un pool d’ARNt optimal pour une expression génique G+C (%) élevée, et [3] un métabolisme primaire actif pour l’approvisionnement potentiel en précurseurs biosynthétiques. En outre, l’un des principaux avantages des systèmes sans cellules est la caractérisation à haut débit des parties génétiques et de l’expression des gènes, à l’aide du séquençage de nouvelle génération13 et de la robotique acoustique de manipulation des liquides8,11,12. En résumé, la boîte à outils S. venezuelae TX-TL5 fournit un outil complémentaire dans le domaine de la biologie synthétique pour les produits naturels. La boîte à outils S. venezuelae TX-TL soutiendra le développement ultérieur de S. venezuelae en tant que système modèle et fournira une méthode pour concevoir de nouvelles pièces / outils de biologie synthétique et explorer les voies biosynthétiques et les enzymes des métabolites secondaires.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à souligner le soutien à la recherche suivant : EPSRC [EP/K038648/1] pour SJM en tant que PDRA avec PSF; Wellcome Trust a parrainé une bourse ISSF pour SJM avec PSF à l’Imperial College de Londres; Subvention de recherche de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Prix Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] pour SJM à l’Université du Kent; et bourse de doctorat du Global Challenges Research Fund (GCRF) pour KC à l’Université du Kent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% - HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Une boîte à outils de transcription-traduction <em>de streptomyces</em> à haut rendement pour la biologie synthétique et les applications de produits naturels
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Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).

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