Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En high-yield Streptomyces Transskription-Oversættelse Toolkit til syntetisk biologi og naturlige produktapplikationer

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63012
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4,6,7, 5
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

Summary

Denne protokol beskriver en forbedret metode til syntetisering af høje udbytter af rekombinante proteiner fra en Streptomyces venezuelae cellefri transskription-oversættelse (TX-TL) system.

Abstract

Streptomyces spp. er en vigtig kilde til klinisk antibiotika og industrielle kemikalier. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 er en hurtigt voksende stamme og en naturlig producent af chloramphenicol, jadomycin og pikromycin, hvilket gør det til en attraktiv kandidat som en næste generations syntetisk biologi chassis. Derfor er genetiske værktøjer, der fremskynder udviklingen af S. venezuelae ATCC 10712, samt andre Streptomyces spp. modeller, meget ønskelige for naturprodukt engineering og opdagelse. Med henblik herpå er et dedikeret S. venezuelae ATCC 10712 cellefrit system angivet i denne protokol for at muliggøre højtydende heterologt udtryk for høje G + C (%) gener. Denne protokol er velegnet til små (10-100 μL) batchreaktioner i enten 96-brønd eller 384-brønd pladeformat, mens reaktioner er potentielt skalerbare. Det cellefrie system er robust og kan opnå høje udbytter (~ 5-10 μ M) for en række rekombinante proteiner i en minimal opsætning. Dette arbejde indeholder også en bred plasmid værktøjssæt til real-time måling af mRNA og proteinsyntese, samt in-gel fluorescens farvning af mærkede proteiner. Denne protokol kan også integreres med high-throughput genekspression karakterisering arbejdsgange eller studiet af enzym veje fra høje G + C (%) gener til stede i Actinomycetes genomer.

Introduction

Cellefri transskription-oversættelse (TX-TL) systemer giver en ideel prototypeplatform for syntetisk biologi til at gennemføre hurtige design-build-test-learn cykler, den konceptuelle tekniske ramme for syntetisk biologi1. Derudover er der stigende interesse for TX-TL-systemer for rekombinant proteinproduktion af høj værdi i et åbent reaktionsmiljø2, for eksempel at indarbejde ikke-standardiserede aminosyrer i antistof-lægemiddelkonjugerer3. Specifikt kræver TX-TL et celleekstrakt, plasmid eller lineært DNA og en energiopløsning til katalysereproteinsyntese i batch- eller halvkontinentale reaktioner. Mens Escherichia coli TX-TL er det dominerende cellefrie system, har en række nye ikke-model TX-TL-systemer tiltrukket sig opmærksomhed til forskellige applikationer4,5,6,7,8. De vigtigste fordele ved TX-TL omfatter fleksibel skalerbarhed (nanoliter til liter skala)9,10, stærk reproducerbarhed og automatiserede arbejdsgange8,11,12. Automatisering af TX-TL muliggør især accelereret karakterisering af genetiske dele og regulatoriske elementer8,12,13.

Med hensyn til reaktion setup, TX-TL kræver både primære og sekundære energikilder, samt aminosyrer, cofaktorer, tilsætningsstoffer, og en skabelon DNA-sekvens. Nukleotid triphosphater (NTPs) giver den primære energikilde til at drive indledende mRNA (ATP, GTP, CTP, og UTP) og proteinsyntese (kun ATP og GTP). For at øge TX-TL udbytter, ntps regenereres gennem katabolisme af en sekundær energikilde, såsom maltose14, maltodextrin15, glukose14, 3-fosfoglycerat (3-PGA)16, fosfoenolpyruvat17, og L-glutamat18. Denne iboende metaboliske aktivitet er overraskende alsidig, men dårligt undersøgt, især i nye TX-TL-systemer. Hver energikilde har forskellige egenskaber og fordele med hensyn til ATP-udbytte, kemisk stabilitet og omkostninger, hvilket er en vigtig overvejelse for opskalerede TX-TL-reaktioner. Indtil videre har de nuværende protokoller for E. coli TX-TL nået op til 4,0 mg/mL (~157 μM) for modellen grønt fluorescerende protein (GFP), ved hjælp af en blanding af 3-PGA (30 mM), maltodextrin (60 mM) og D-ribose (30 mM) som den sekundære energikilde19.

For nylig har der været en stigende interesse for at studere sekundære metabolitbiosyntetiske veje i TX-TL-systemer20,21,22. Specifikt er Actinobacteria en vigtig kilde til sekundære metabolitter, herunder antibiotika og landbrugskemikalier23,24. Deres genomer er beriget med såkaldte biosyntetiske genklynger (BGCs), som koder enzymatiske veje for sekundær metabolitbiosyntese. Til undersøgelse af Actinobacteria genetiske dele og biosyntetiske veje, en række Streptomyces-baserede TX-TL-systemer er for nylig blevet udviklet5,6,25,26. Disse specialiserede Streptomyces TX-TL-systemer er potentielt gavnlige af følgende grunde: [1] levering af et indfødt proteinfoldemiljø for enzymer fra Streptomyces spp.26; [2] adgang til en optimal tRNA-pulje til højt G+C (%) genekspression; [3] aktivt primært stofskifte, som potentielt kan kapres til levering af biosyntetiske prækursorer; og [4] levering af enzymer, prækursorer eller cofaktorer fra sekundær metabolisme til stede i den indfødte celle ekstrakt. Derfor er en højtydende S.venezuelae TX-TL værktøjskasse for nylig blevet etableret for at udnytte disse unikke kapaciteter5.

Streptomyces venezuelae er en spirende vært for syntetisk biologi med en rig historie inden for industriel bioteknologi5,27,28,29 og som et modelsystem til undersøgelse af celledeling og genetisk regulering i Actinobacteria30,31,32. Den vigtigste type stamme, S. venezuelae ATCC 10712, har et relativt stort genom på 8,22 Mb med 72,5% G + C indhold (%) (Tiltrædelsesnummer: CP029197), som koder 7377 kodning sekvenser, 21 rRNAs, 67 tRNAs, og 30 biosyntetiske gen klynger27. I syntetisk biologi er S. venezuelae ATCC 10712 et attraktivt chassis til det heterologe udtryk for biosyntetiske veje. I modsætning til de fleste andre Streptomyces pletter, det giver flere vigtige fordele, herunder en hurtig fordobling tid (~ 40 min), et omfattende udvalg af genetiske og eksperimentelle værktøjer5,28, mangel på mycelial klumpning, og sporulation i flydende medier28,33. Flere undersøgelser har også vist brugen af S. venezuelae til heterolog produktion af en bred vifte af sekundære metabolitter, herunder polyketider, ribosomale og nonribosomale peptider34,35,36,37,38. Disse kombinerede funktioner gør denne stamme til en attraktiv mikrobiel vært for syntetisk biologi og metaboliske tekniske applikationer. Mens S. venezuelae ikke er den dominerende Streptomyces model for heterologe genekspression, med yderligere udvikling, det er primet til bredere brug inden for naturlige produkt opdagelse.

Dette manuskript præsenterer en detaljeret protokol (figur 1) for et højtydende S. venezuelansk TX-TL-system, som er blevet opdateret fra den oprindelige tidligere offentliggjorte protokol26. I dette arbejde er energiopløsningen og reaktionsbetingelserne optimeret for at øge proteinudbyttet op til 260 μg/mL for mScarlet-I-reporterproteinet i en 4 timer, 10 μL batchreaktion ved hjælp af en standard plasmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Denne plasmid er specielt designet til at muliggøre forskellige metoder til påvisning af proteinudtryk. Protokollen er også strømlinet, mens energisystemet er blevet optimeret for at reducere kompleksiteten og omkostningerne ved at opsætte cellefrie reaktioner uden at gå på kompromis med udbyttet. Sammen med det optimerede TX-TL-system er der udviklet et bibliotek af genetiske dele til finjustering af genekspression og som fluorescerende værktøjer til overvågning af TX-TL i realtid og derved skabt en alsidig platform til prototype af genekspression og naturlige produktbiosyntetiske veje fra Streptomyces spp. og relaterede Actinobacteria.

I dette arbejde kan den anbefalede standard plasmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) bruges til at etablere S. venezuelae TX-TL-arbejdsgang i et nyt laboratorium og er tilgængelig på AddGene (se supplerende tabel S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I giver brugeren fleksibilitet til at studere andre åbne læserammer (ORF'er). MScarlet-I ORF er codon-optimeret til S. venezuelask genekspression. SP44 promotor er en stærk konstituerende promotor, der er meget aktiv i både E. coli og Streptomyces spp.39. Plasmid har to unikke begrænsning enzym sites (NDEI, BamHI) til at tillade sub-kloning af nye ORFs in-frame med en fælles C-terminal FLAG-tag og fluorescein arsenisk hårnål (FlAsH) bindemiddel tag system. Alternativt kan begge tags fjernes med inddragelse af en stop codon efter sub-kloning af et nyt gen. Med denne basevektor er det høje udbytte udtryk for en række proteiner blevet påvist, nemlig proteiner fra oxytetracyclin biosyntesevejen og en uhæmmet nonribosomal peptidsynetase (NRPS) fra Streptomyces rimosus (Figur 2). Med hensyn til mRNA-detektion indeholder pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid en dBroccoli aptamer (i 3'-uoversat region) til påvisning med 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinon (DFHBI) sonde. For øget fleksibilitet er der også stillet et værktøjssæt af EcoFlex40-kompatible MoClo-dele til rådighed på AddGene, herunder en EcoFlex-kompatibel Streptomyces shuttle vector (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) og en række pTU1-A-SP44 variant plasmider, der udtrykker superfolder grønt fluorescensprotein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I og β glucuronidase (GUS). Især pSF1C-A plasmid er afledt af pAV-gapdh28 og er helbredt for BsaI / BsmBI sites for MoClo samling. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP svarer til pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP fra EcoFlex40, men indeholder yderligere funktionalitet til bøjning og kromosomintegration i Streptomyces spp. ved hjælp af phiC31 integrase system28.

Den første fase af protokollen indebærer væksten af den s. venezuelanske ATCC 10712 eller en nært beslægtet stamme, cellehøst i midten af eksponentiel fase, cellevask trin, og ekvilibrering i S30A og S30B buffere. Denne fase kræver tre dage, og tiden for cellevækst kan bruges til at forberede de resterende komponenter som beskrevet nedenfor. De høstede celler lyser derefter ved sonikering, afklares og gennemgår en afstrømning. I denne sidste fase af forberedelsen kan celleekstrakterne forberedes til langtidsopbevaring ved -80 °C for at minimere tab af aktivitet. Til samling af TX-TL-reaktioner ved hjælp af denne protokol præsenteres en Streptomyces Master Mix (SMM) med mulighed for et MINIMAL Energy Solution-format (MES), der giver sammenlignelige udbytter. Desuden anbefales det at stribe en frisk kultur af S. venezuelae ATCC 10712 fra en -80 ° C glycerol lager på en GYM agar plade og inkubere ved 28 ° C i mindst 48-72 timer, indtil enkelte kolonier er synlige. Kun friske kulturer bør anvendes til følgende trin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Se tabel 1 og tabel 2 for opskrifter på GYM medium og agar plade og S30A og S30B vaske buffere.

1. Udarbejdelse af løsninger og generel vejledning

  1. Opbevar alle opløsninger, celler (postvækst) og celleekstrakter på is efter tilberedning, medmindre der er angivet en undtagelse.
  2. Opbevar lagre for 1 M Mg-glutamat, 4 M K-glutamat, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/mL polyvinylsulfonsyre ved stuetemperatur og alle andre lagre ved -80 °C. Minimer antallet af fryse-optøningscyklusser for at undgå kemisk nedbrydning.
  3. Ved udarbejdelse af lagre af energiopløsninger (se tabel 3) såsom 3-PGA (kræver pH-justering) skal du følge vejledningen i E. coli TX-TL-protokollen41.
    BEMÆRK: Alle komponenter er fuldt opløselige i ddH2O og opbevares som aliquots i -80 °C fryseren.
  4. Optø individuelle lagre eller energiløsninger (beskrevet senere) på is. Varm aminosyrerne bestanden ved 42 °C med hvirvlende i ~ 15-30 min at opløse alle aminosyrer.
  5. Som nogle aminosyrer (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) bundfald på is, samtidig minimere hviletid, forlade denne løsning ved stuetemperatur og bruge en vortex til at opløse.
  6. Tilsæt de beregnede mængder (tabel 3) af lageropløsninger og vand og bland godt ved hjælp af en vortex.
  7. Aliquot energiopløsningen som 20-100 μL aliquots pr. rør eller som ønsket på is og opbevares ved -80 °C indtil videre brug.

2. Forberedelse af S. venezuelanske ATCC 10712 celler

  1. Dag 1-Media/buffer forberedelse og natten før kultur
    1. 1 L sterilt GYM-væskemedium i en 2 L forvirret kolbe som beskrevet i tabel 1. Se materialetabellen for udstyr/kemiske/reagenskilder.
    2. Der fremstilles 1 x 50 mL sterilt GYM-væskemedium i en 250 mL Erlenmeyer-kolbe som beskrevet i tabel 1.
    3. Forbered 100 mL af 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 mL af 1 M MgCl2, og 500 mL af 4 M NH4Cl løsninger til at gøre 1 L af S30A og 1 L af S30B vask buffere. Se tabel 2 for opskrifterne.
    4. Forbered natten før kultur. Forvarm det sterile 50 mL GYM flydende medium i en 250 mL Erlenmeyer kolbe til 28 °C i 30 min.
    5. Pod en enkelt koloni af S. venezuelae ATCC 10712 (eller relaterede stamme) fra en GYM agar plade i forwarmed 50 mL gym flydende medium og inkubere ved 28 ° C, 200 rpm for 16 timer (overnight pre-kultur).
  2. Dag 2-Forbered dagtimerne førkultur og vigtigste vækstkultur.
    1. Forvarm 50 mL sterilt GYM væskemedium i en 250 mL Erlenmeyer kolbe ved 28 °C i 30 min.
    2. Overfør 1 mL natten før kultur i forvarmet 50 mL GYM flydende medium og inkubere ved 28 °C, 200 rpm for 8 timer (dagtimerne førkultur).
    3. Efter denne vækstperiode skal od600 kontrolleres i et spektrofotometer ved hjælp af en fortynding på 1:10 med sterilt GYM-medium i et 1 cm (1 cm stilængde) plastkuvette.
      BEMÆRK: OD600 skulle have nået mindst 3-4. Hvis der er dårlig vækst, er det tilrådeligt at gentage trin 2.2.1-2.2.2.
    4. Subkultur 0,25 mL af dagtimerne prækultur i 1 L flydende GYM medium i 2 L forvirrede kolber.
    5. Ryst natten over ved 28 °C, 200 omdr./min. i 14 timer.
  3. Dag 3-Høst celler
    1. Efter den foregående inkubationsperiode (14 timer) registreres OD600 i hovedkulturen. Fortynd nattens kultur 1:10 med frisk GYM medium til OD600 måling.
      BEMÆRK: OD600 skulle have nået 3.0-4.0 på nuværende tidspunkt.
    2. Hvis OD600<3,0, øge rystehastigheden til 250-300 rpm og vokse, indtil en OD600 på 3,0 er nået. Vokse i højst yderligere 2 timer (16 timer i alt).
    3. Hvis OD600>3.0, overføres kulturerne til centrifugationsbeholdere og afkøles hurtigt på vådis i 30 minutter.
    4. Mens du venter på, at cellekulturen afkøles på is, skal du forberede 4 mL friske 1 M dithiothreitol (DTT), S30A og S30B buffere, som beskrevet i tabel 1, og holde dem på is. Se materialetabellen for kemikalie-/reagenskilde.
    5. Forvej et tomt 50 mL centrifugerør og forkøling ved -20 °C.
    6. Tilsæt 2 mL 1 M DTT til 1 L S30A buffer på is og bland godt.
      BEMÆRK: Føj kun DTT til S30A- og S30B-vaskebuffere, før du bruger dem.
    7. Centrifugeceller ved 6.000 × g, 4 °C, 10 min, og kassér forsigtigt supernatanten i en hurtig og enkelt bevægelse.
      BEMÆRK: Hvis pellet forstyrres, maksimeres cellefastholdelsen med resterende GYM-medium og protokollen fortsættes.
    8. Tilsæt 500 mL S30A buffer og genbrug cellerne ved at ryste centrifugering flasker kraftigt, indtil cellen klumper er homogent spredt.
    9. Centrifugere cellerne ved 6.000 × g, 4 °C, 6 min, og kassér forsigtigt supernatanten.
      BEMÆRK: Selv om cellepillen vil være fastere på dette tidspunkt, vil nogle celler forblive i suspension (se figur 1). Behandl som beskrevet i 2.3.7 og bevar så mange celler som muligt.
    10. Gentag trin 2.3.8-2.3.9.
    11. Tilsæt 2 mL 1 M DTT til 1 L S30B buffer på is og bland godt. Føj 500 mL S30B-buffer til cellerne. Gentag trin 2.3.9.
    12. Resuspend celle pellet i 10 mL af S30B buffer og overføre til den forvejede, forkølede 50 mL centrifuge rør. Hvis det er nødvendigt, overføres restcellerne med yderligere 5-10 mL S30B-buffer. Fyld til 50 mL med S30B.
    13. Centrifugeceller ved 6.000 × g, 4 °C, 10 min, og kassér forsigtigt supernatanten.
    14. Gentag trin 2.3.13.
    15. Konspirer forsigtigt den resterende S30B supernatant med en 100-200 μL pipette.
    16. Afvej den våde cellepille.
      BEMÆRK: Typisk vådcelle pelletvægt for 1 L overnatning GYM kultur (OD600 = 3,0) er ~ 4,5 g.
    17. For hver 1 g våde celler tilsættes 0,9 mL S30B buffer. Genbrug cellerne ved hjælp af enten en Pasteur pipette eller vortex.
    18. Centrifuge kort (~ 10 s) op til 500 × g til sediment cellerne.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt, og celler kan fryses på enten flydende nitrogen eller tøris og opbevares ved -80 °C. Af sikkerhed skal du bære passende personlige værnemidler (PPE) ved håndtering af flydende nitrogen, herunder ansigtsskærme og handsker.

3. Celle lysis ved sonikering for at opnå den rå celle ekstrakt

BEMÆRK: På dette stadium kan brugeren vælge at forstyrre cellerne ved sonikering enten i 1 mL brøker (mulighed 1) eller som en større celleaffjedring (5 mL) i et 50 mL rør (mulighed 2). Begge muligheder er blevet beskrevet nedenfor for at sikre reproducerbarhed, da den endelige volumen af celleaffjedringen kan ændre sig på grund af tab af celler under tidligere høst- og vasketrin. En ny bruger skal først forsøge at oprette protokollen.

  1. Cell Lysis ved sonikering i 1 ML brøker
    1. Brug en 1 mL pipettespids (afskåret enden af spidsen for at øge borestørrelsen) overføres 1 mL af celleaffjedringen til 2 mL mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Hvis cellerne fryses, optøs hurtigt det 50 ML-rør, der indeholder pelleten, i lunkent vand før cellelyset. Overfør røret til våd is, så snart pellet er begyndt at afrimne, og chill i 10 min.
    2. Placer hver mikrocentrifuge rør i et bæger af isvand, ved hjælp af en plastik rør rack til at holde røret til sonikering.
      BEMÆRK: På grund af celleekstraktets følsomhed over for overophedning er det afgørende at sikre, at rørene ikke opvarmes for at forhindre proteinudfældning og reduceret enzymatisk aktivitet.
    3. Brug en sonikersonde med en tip med en diameter på 3 mm, og rengør den med 70 % (v/v) ethanol og dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Sænk sonikerspidsen ned i celleaffjedringen, indtil den er ~1 cm under væskeoverfladen.
    4. Indtast følgende indstillinger i sonicator: 20 kHz frekvens, 65% amplitud, 10 s puls til tiden, 10 s pulser OFF tid, 1 min samlede sonikering tid.
    5. Kør sonikeringsprotokollen. Flyt røret op /ned og sidelæns i løbet af de første to hvilecyklusser for at sikre, at cellerne er jævnt sonikeret. Optag energitilførslen.
      BEMÆRK: Af sikkerhedsmæssige årsager skal du bære passende høreværn under sonikering. Viskositeten vil falde, efterhånden som cellerne forstyrres, og den blege creme våde celle pellet skal blive til en homogen brun væske. Den anbefalede energitilførsel er 240 J pr. minut vådceller. Hvis cellerne kun er delvist lysed, suspensionen vil stadig synes creme-farvet med tyktflydende klumper af celler, især på siderne af røret.
    6. Inverter røret 2-3 gange og gentag sonikering for en yderligere en eller to 10 s cyklusser, blande ofte, indtil cellerne er fuldt forstyrret.
  2. Cell Lysis ved at sonikere en 5 ML celle suspension
    1. Hvis cellerne er frosne, hurtigt optø 50 mL rør, der indeholder pellet i lunkent vand med rysten før celle lysis. Overfør røret til våd is, så snart pellet er begyndt at afrimne, og chill i 10 min.
    2. Drej kortvarigt røret ved 500 x g for at sedimenter cellerne.
    3. Placer 50 mL-røret i et bæger isvand til sonikering.
      BEMÆRK: På grund af celleekstraktets følsomhed over for overophedning er det afgørende at sikre, at rørene ikke opvarmes for at forhindre proteinudfældning og reduceret enzymatisk aktivitet.
    4. Brug en sonikersonde med en tip med en diameter på 6 mm, og rengør den med 70 % (v/v) ethanol og ddH2O (se det visuelle skema på 6 mm sonde i figur 1). Sænk sonikerspidsen ned i celleaffjedringen (~5 mL), indtil den er ~1 cm under væskeoverfladen.
    5. Indtast følgende indstillinger i sonicator: 20 kHz frekvens, 65% amplitud, 10 s puls TIL tiden, 10 s pulser OFF tid, 1 min samlede sonikering tid pr mL af våde celler (5 min i alt).
    6. Kør sonikeringsprotokollen. Flyt røret op /ned og sidelæns i løbet af de første to hvilecyklusser for at sikre, at cellerne er jævnt sonikeret.
      BEMÆRK: Af sikkerhedsmæssige årsager skal du bære passende høreværn under sonikering. Viskositeten vil falde, efterhånden som cellerne forstyrres, og den blege creme våde cellepille skal blive til en homogen brun væske. Optag energitilførslen. En optimal energitilførsel på 240 J pr. minut vådceller (~1200 J i alt fra 5 min sonikering) anbefales.
    7. Hvis nogle celler forbliver intakte, skal du følge vejledningen fra trin 3.1.5.
    8. Cellekstrakterne overføres til 2 mL mikrocentrifugrør.

4. Celleudtræk afklaring og afstrøm afstrøm reaktion

  1. Centrifugere de lyserede celler ved 16.000 × g i 10 min ved 4 °C for at fjerne celleaffaldet. Supernatanten overføres til 1,5 mL mikrocentrifugerør som 1 mL aliquots.
  2. Udfør afstrømningen af reaktionen for celleekstrakterne. Inkuberes de 1,5 ML-rør, der indeholder celleekstrakterne, ved 30 °C i 60 min på en varmeblok eller inkubator uden at ryste.
  3. Centrifuge cellen ekstraherer ved 16.000 × g i 10 min ved 4 °C. Pool supernatanterne i et 15 mL centrifugerør. Bland supernatanten ved at vende røret fem gange, indtil det er homogent, og opbevar det derefter på is. Vend forsigtigt for at undgå dannelse af luftbobler.
  4. Fortynd 10 μL af celleekstraktet 100 gange med S30B-buffer og mål den samlede proteinkoncentration ved hjælp af en Bradford-analyse med tre tekniske gentagelser (se Supplerende materiale S2 til Bradford-analysevejledning).
  5. Hvis proteinkoncentrationen er 20-25 mg/mL, overføres celleekstrakterne til 100 μL aliquots til nye 1,5 mL-rør, flash-fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Af sikkerhedsmæssige årsager skal du bære passende pv ved håndtering af flydende nitrogen, herunder ansigtsskærme og handsker.
  6. Hvis proteinkoncentrationen er <20 mg/mL, gentages de rå ekstraktpræparater for at sikre, at celleekstrakt af høj kvalitet og TX-TL-udbytter kan sammenlignes med det tidligere offentliggjorte værk5.

5. Udarbejdelse af plasmid DNA-skabelon

  1. Rense pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid (pUC19 oprindelse) fra en frisk forvandlet E. coli plasmid stamme (DH10β, JM109) dyrket i 50 mL af LB kultur (med 100 mg/ mL carbenicillin) ved hjælp af en passende plasmid DNA rensning kit som pr fabrikantens anvisninger.
  2. Eluter plasmiden i 2 x 300 μL nucleasefrit vand og kombiner fraktioner.
  3. Der tilsættes 0,1 volumener (66 μL) af 3 M natriumacetat (pH 5.2).
  4. Der tilsættes 0,7 volumener (462 μL) isopropanol.
  5. Inkuberes DNA ved -20 °C i 30 min.
  6. Centrifuge ved 16.000 × g i 30 min ved 4 °C og kassér supernatanten.
  7. Dna-pelleten tilsættes 2 mL af 70 % (v/v).
  8. Vend røret 3-4 gange for at genbruge plasmid-DNA-pelleten.
  9. Centrifuge ved 16.000 × g i 5 min ved 4 °C og kassér supernatanten.
  10. Gentag trin 5.7-5.9, og fjern al synlig væske.
  11. Lufttørre DNA-pellet i 10-30 min eller tør i 5 min med et vakuum centrifuge.
  12. Den tørrede pellet genbruges med 600 μL nucleasefri ddH2O.
  13. Mål DNA-koncentrationen og renheden ved hjælp af et spektrofotometer.
  14. 50-100 μL aliquots og opbevares ved -20 °C.
    BEMÆRK: En høj DNA-koncentration i området 500-1000 ng/μL anbefales på grund af de stramme volumenbegrænsninger af cellefrie reaktioner. Fortynd plasmid-DNA-bestanden til 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid svarer til 80 nM.

6. Forberedelse af Streptomyces Master Mix (SMM) opløsning

  1. Aminosyreopløsning
    1. Brug aminosyre sampler kit for at undgå manuelle fejl og reducere forberedelsestiden, efter producentens anvisninger online.
    2. Fortynd 20x aminosyrelageropløsningen ved hjælp af ddH2O til en endelig koncentration på 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Yderligere fortyndes til 2,4 mM (2 mM L-Leu) i 2,4 x SMM-opløsningen (se tabel 3).
      BEMÆRK: Den endelige koncentration i TX-TL-reaktionen er 1 mM 19x aminosyrer og 0,83 mM L-Leu.
  2. Energiløsning og tilsætningsstoffer
    1. Forbered de andre komponenter i 2,4 x SMM-opløsningen ved at følge opskriften i tabel 3.
    2. Alternativt kan du forberede en 2,4 x minimal energiløsning (MES) efter opskriften beskrevet i tabel 3.

7. Opsætning af en standard S. venezuelae TX-TL reaktion

  1. Optø celleekstraktet, SMM (eller MES) opløsningen og plasmid-DNA'et på is. Førkøl en 384-brønd plade ved -20 °C.
  2. Konfigurer TX-TL-reaktioner, hvor 25% af volumen er plasmid-DNA, 33,33% er celleekstrakt, og 41,67% er SMM-opløsning ; holde dem på is for at undgå starttidspunkt bias.
    BEMÆRK: Der er angivet en standard TX-TL-skabelon (tabel 4) til beregning af mængden af reagenser, der er nødvendige, baseret på antallet af reaktioner. Standardvolumenet for en 33 μL-reaktion er som følger: 11 μL celleekstrakt, 13,75 μL SMM og 8,25 μL plasmid-DNA.
  3. Hvirv forsigtigt blandingen til ~ 5 s ved en lav hastighed indstilling for at sikre, at opløsningen er homogen. Undgå skumdannelse/bobledannelse.
  4. Overfør 10 μL aliquots i tre brønde af en 384-brønd plade som en teknisk trelicat uden at indføre luftbobler. Forsegl pladen med et gennemsigtigt dæksel og drej ved 400 × g i 5 s.
  5. Inkuberes ved 28 °C enten i en inkubator (til slutpunktsaflæsninger) eller en pladelæser uden at ryste.
    BEMÆRK: Reaktioner kræver typisk 3-4 timer for at nå færdiggørelsen. Se Supplerende materiale S2 for vejledning på en pladelæser og mScarlet-I standardmålinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne detaljerede protokol er et eksempel til at hjælpe brugeren med at etablere en Streptomyces TX-TL system baseret på S. venezuelae ATCC 10712 model stamme (Figur 1). Brugeren kan forsøge at studere andre Streptomyces stammer; Vækst/høst af andre stammer med længere fordoblingstider eller særskilte vækstpræferencer skal dog specialoptimeres for at opnå topresultater. For det repræsentative resultat blev mScarlet-I fluorescerende protein fra pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid (figur 2 og figur 3) optimeret til at give højtydende udtryk i S. venezuelae TX-TL med en række detektionsmetoder (SDS-PAGE, fluorescens). Desuden blev denne standardplasmid modificeret for at demonstrere syntesen af en række sekundære metabolitenzymer fra S. rimosus (figur 2)5. Endelig vises en potentiel arbejdsgang for opskaleret biosyntese for naturprodukt som et skema for brug af en modelvej fra de tidlige stadier af hemebiosyntese. Arbejdsgangen kan potentielt tilpasses andre sekundære metabolitbiosyntetiske veje. Som retningslinje bør denne protokol give et minimumsudbytte på 2,8 μM for sfGFP og 3,5 μM for mScarlet-I/mVenus fra udtrykket plasmider på AddGene. Disse tal giver mulighed for typisk batchvariation (op til 28 %) observeret i tidligere data5, selv om der er opnået et udbytte på over 10 μM mScarlet-I med optimale partier (ikke-offentliggjorte data).

Måling af S. venezuelae TX-TL af mScarlet-I-genet ved hjælp af fem forskellige metoder
Udtrykket af pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid er vist, med måling af mScarlet-I udtryk ved hjælp af fem forskellige metoder: 1. real-time fluorescens måling af mRNA ved hjælp af dBroccoli aptamer, 2. real-time fluorescens måling af umodne mScarlet-I protein ved hjælp af FlAsH tag system, 3. real-time fluorescens måling af modne mScarlet-I protein, 4. in-fluor gelescens farvning af mScarlet-I ved hjælp af FlAsH tag, og 5. Coomassie blå farvning af samlede cellefrie proteiner. For disse data blev reaktionerne sat op i 2 mL mikrocentrifugerør som 33 μL-reaktioner (for slutpunktsprøver) eller som en 10 μL teknisk trelicat i 384-brøndsplader i en pladelæser. En triple-tagged (N-terminal His6, C-terminal Flag og C-terminal FlAsH) mScarlet-I protein blev separat renset for at skabe en kalibrering standard for målinger, ved hjælp af pET15b-mScarlet-I plasmid, som er beskrevet yderligere i supplerende materiale S2. Dataene for disse eksperimenter er vist i figur 3. Yderligere oplysninger om in-gel fluorescens farvning metode er tilgængelige i supplerende materiale S3.

S. venezuelae TX-TL af tidlig heme biosyntese
For at tjene som en model biosyntetisk model blev 'one-pot' biosyntesen af uroporphyrinogen III (uro'gen III) udført ved hjælp af pTU1-A-SP44-hemC-hemD/cysGA-hemB udtryk plasmid5. Denne model biosyntetiske vej blev valgt som uro'gen III er meget ilt-følsomme og hurtigt oxiderer (tab af seks elektroner) til uroporphyrin III, som viser stærk rød fluorescens. Dette gør det nemt at registrere reaktionen i realtid ved hjælp af fluorescensmålinger og/eller HPLC-MS (figur 4), som tidligere beskrevet5. Derudover blev disse reaktioner undersøgt ved hjælp af enten en batch eller semikontinent metode. En halvkontinent reaktion er en strategi, der bruger en mikrodialyseenhed42,43, der giver ekstra energi (NTPs, sekundær energikilde) og aminosyrer til at forlænge reaktionstiden og øge proteinsynteseudbyttet. Her bruges den halvkontinentale metode til at opskalere hememodelreaktionen og adskille TX-TL-proteinerne fra reaktionsproduktet for at lette rensning og analyse af HPLC-MS. Yderligere oplysninger om metoder er tilgængelige i supplerende materiale S4 eller for data, se tidligere arbejde5. Semikontinentale cellefrie reaktioner er også beskrevet i tidligere arbejde42,43. Den skematiske arbejdsproces, der demonstreres her (figur 4), kan muligvis tilpasses andre biosyntetiske veje til naturprodukt.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over Streptomyces venezuelae TX-TL-protokollen. En protokoloversigt er illustreret, herunder en anbefalet tidsramme på tre dage. Protokollen er opdelt i forskellige stadier af cellevækst, cellehøst, cellevask, celle lysis ved sonikering, afklaring, afstrømning reaktion, master mix (SMM) forberedelse, plasmid DNA-forberedelse, og TX-TL reaktion samling. Den fulde protokol er beskrevet i detaljer i teksten sammen med vejledning og praktiske tips. Forkortelser: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transskription-oversættelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Højtydende proteinsyntese fra høje G+C (%) gener. (A) Syntese af sfGFP, mVenus-I og mScarlet-I fluorescerende proteiner. (B) Syntese af biosyntetiske enzymer fra Streptomyces rimosus. Forkortelse: EV = Tom vektor; NRPS = nonribosomal peptid synthetase. Tallet ændres fra 5. Se protokollen og supplerende filer til reaktionsopsætning og -metode. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Måling af TX-TL fem-måder med pTU1-A-SP44-mScarlet-I plasmid. A) Plasmid-design, herunder følgende funktioner: SP44 er en stærk konstituerende promotor, der er aktiv i Streptomyces spp. og E. coli; pET-RBS er afledt af pET-udtryk plasmiderne og er meget aktiv i både Streptomyces spp. og E. coli5,40; Streptomyces codon-optimeret mScarlet-I gen, som koder en rød-fluorescerende protein derivative44; C-terminal FLAG-tag til affinitet kromatografi rensning eller vestlige blotting detektion; C-terminal FlAsH-tag til fluorescerende mærkning til farvning i gel eller realtidsmåling af spirende proteinsyntese; dBroccoli aptamer til mRNA-måling i realtid ved hjælp af DFHBI-sonden Bba_B0015 transskription terminator, som er meget effektiv i S. venezuelanske ATCC 107125; ampicillinresistensmarkør; og pUC19 oprindelsen af replikation. (B) MRNA-udtryk i realtid, detekteret med dBroccoli aptamer og DFHBI-sonden (excitation 483-14 nm, emission 530-30 nm). (C) Realtidseksesevisning af spirende proteinsyntese med FlAsH-EDT2 fluorescerende sonde (excitation 500-10 nm, emission 535-10 nm). (D) Fluorescensmåling i realtid af mScarlet-I syntese (excitation 565-10 nm, emission 600-10 nm). (E) In-gel farvning med FlAsH-EDT2 fluorescerende sonde. (F) Coomassie blå farvning af samlede TX-TL proteiner med renset His6-mScarlet-I standard til sammenligning. Reaktionerne blev kørt under de betingelser, der er beskrevet i protokollen med 40 nM plasmid DNA-skabelon. Alle fluorescensdata er repræsenteret som RFU, og fejllinjer (standardafvigelse for tre tekniske gentagelser) er repræsenteret i et gråt skravet område. Forkortelser: TX-TL = transskription-oversættelse; FlAsH = fluorescein arsenical hairpin; DFHBI = 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone; RFU = relative fluorescensenheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Skematisk arbejdsgang for den s. venezuelanske TX-TL-semikontinentale reaktion. Et eksempel på arbejdsgang for naturprodukt TX-TL, ved hjælp af den tidlige fase heme biosyntetiske operon og downstream analyse af HPLC-MS. Reaktioner og analyse er beskrevet i det supplerende materiale. Tallet ændres fra 5. Forkortelser: SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transskription-oversættelse; ALA = 5-aminolevulinsyre; SPE = udvinding af fast fase; ESI-MS = elektron sprayionisering-massespektrometri; HPLC-MS = højtydende flydende kromatografi-massespektrometri. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Opskrift på GYM bakterievækst medium og GYM agar plade. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Reagenser til klargøring af S30A- og S30B-vaskebuffere. Disse oplysninger er blevet tilpasset fra Kieser et al. 45 Forkortelse: DTT = dithiothreitol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Opskrift på at lave S . venezuelaske MES- og SMM-løsninger. Forkortelser: MES = Minimal Energiløsning; SMM = Streptomyces Master Mix; NTP = nucleoside triphosphat; PEG 6000 = polyethylenglycol 6000; 3-PGA = 3-fosfoglycerate; G6P = glukose-6-fosfat; PVSA = polyvinylsulfonsyre. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Opskrift på S. venezuelae TX-TL reaktion. Forkortelser: MES = Minimal Energiløsning; SMM = Streptomyces Master Mix; TX-TL = transskription-oversættelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S1: Plasmid for S. venezuelae TX-TL workflow. Forkortelse: TX-TL = transskription-oversættelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende materiale S2: mScarlet-I kalibrering standard forberedelse og pladelæser målinger. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende materiale S3: FlAsH-tag metoder. Forkortelse: FlAsH = fluorescein arsenical hairpin. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende materiale S4: Halvkontinent reaktion, rensning og HPLC-MS. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskript er en højtydende S. venezuelae TX-TL-protokol blevet beskrevet med detaljerede trin, der er ligetil at udføre for både erfarne og nye brugere af TX-TL-systemer. Flere funktioner fra eksisterende Streptomyces45 og E. coli TX-TL41 protokoller er blevet fjernet for at etablere en minimal, men højtydende protokol for S. venezuelae TX-TL5,26. Den arbejdsgang, der anbefales her, er at sikre, at S. venezuelae vokser hurtigt i det valgte rige medie for at kunne vaccinere den endelige kultur om aftenen. Dette gør det muligt for cellehøst ved spidsvækst den følgende morgen og giver brugeren mulighed for at høste og forberede det aktive celleekstrakt på samme dag. Ved at følge denne strømlinede protokol forventes det, at en enkelt forsker kan fuldføre protokollen bekvemt i en tre-dages ramme. Der er også stillet et supplerende plasmidværktøjssæt til rådighed for det s. venezuelanske TX-TL-system, herunder et stærkt udtryk plasmidsystem (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), som giver bred funktionalitet til mRNA / proteinanalyse. Denne standard plasmid er drevet af den konstituerende SP44 promotor, der er meget aktiv i en række Streptomyces spp. og i E. coli39. For at demonstrere det oprindelige potentiale i den S. venezuelae TX-TL-værktøjskasse viser de repræsentative resultater højtydende syntese af en række fluorescerende proteiner, sekundære metabolitenzymer og biosyntesen af en model naturlig produktvej (fra heme biosyntese).

Samlet set indeholder protokollen en detaljeret beskrivelse af S. venezuelae TX-TL-system samt praktiske tips til forberedelse af de tre væsentlige komponenter i TX-TL-reaktionen: (1) celleekstrakt, (2) Streptomyces Master Mix (SMM) opløsning og (3) plasmid DNA. Denne protokol kræver ikke specialiseret udstyr og kræver kun rutinemæssige mikrobiologi og biokemi færdigheder; derfor er det tilgængeligt for de fleste laboratorier. Protokollen er velegnet til små (10-100 μL) og større reaktioner (~ 2,5 mL), selv om en vis optimering af reaktionsstørrelse / befrugtning kan påvirke proteinudbyttet. Det anbefalede reaktionsvolumen er 33 μL i et 2 mL rør eller 10 μL i en 384-brønds plade. Den rå ekstrakt tager fem dage at forberede ved en enkelt person, der starter fra en glycerol lager. Hver liter (L) af kultur giver mindst 5 mL celleekstrakt (svarende til ~ 1500 x 10 μL TX-TL reaktioner)-dette er en konservativ skøn og tegner sig for prøve tab under vask trin og celle ekstrakt afklaring. Hvert trin i protokollen er uafhængigt og kan optimeres af brugeren for at imødekomme deres behov. En væsentlig begrænsning for alle cellefrie systemer er batchvariation46,47. Generiske faktorer omfatter pipetteringsfejl, brugeroplevelse, variation i mediebatch og udstyrsforskelle. Vi introducerer specifikt en master mix for at minimere pipetteringsfejl og give detaljerede instruktioner, der dækker brug af medier og udstyr. Til dato er protokollen reproducerbar af en række brugere i mindst fem britiske forskningsgrupper. Det er dog uvist, hvilken rolle biologisk variation bidrager til cellefri batchvariation. Sammen med globale genekspression regulering forskelle, genom plasticitet i Streptomyces spp er bredt rapporteret og er en potentiel bidragyder48. For at undersøge batchvariation anbefales det at vokse op til fire separate 1 L-kulturer afledt af fire enkeltkolonier dyrket natten over. Tidligere blev der observeret op til 28% variation (med hensyn til standardafvigelse) mellem fire biologiske partier (4 L pr. parti forudsat ~ 20 mL celleekstrakt)5. Baseret på disse data er et rimeligt minimalt mål for en ny bruger 2,8 μM for sfGFP og 3,5 μM mScarlet-I/mVenus-I ved hjælp af de plasmider, der er tilgængelige på AddGene-disse mål er 30% lavere end gennemsnittet observeret i tidligere data. Hvis downstream HPLC-MS-analyse ønskes, kan PEG 6000 fjernes fra masterblandingerne, selv om et fald i det samlede TX-TL-udbytte kan forventes med op til 50%.

Med hensyn til potentialet i specialiserede Streptomyces cellefrie systemer5,6, er der et voksende ønske om at udvikle nye vådlaboratorieværktøjer til bioprospecting applikationer såsom naturlige produkter. Den Streptomyces slægten er gennemsyret af historien om naturlige produkt opdagelse, herunder antibiotika, herbicider, og farmaceutiske lægemidler49. Den stigende viden fra helgenom sekventering projekter og de nyeste bioinformatiske værktøjer50,51,52 har afsløret et hidtil uset niveau af naturlige produkter kodet af BGCs inden for mikrobielle genomer53. Frigørelse af denne genetiske information, som forventes at holde nye lægemidler / kemikalier og enzymer nyttige for bioteknologi-vil kræve udvikling af nye syntetiske biologi strategier, herunder nye udtrykssystemer og en række metaboliske engineering værktøjer54. Specialiserede Streptomyces-baserede TX-TL-systemer er fordelagtige at studere gener og regulatoriske elementer fra Actinobacteria og relaterede genomer af følgende grunde: [1] tilgængelighed af et indfødt proteinfoldningsmiljø26, [2] adgang til en optimal tRNA-pulje til høj G +C (%) genekspression og [3] et aktivt primært stofskifte til potentiel forsyning af biosyntetiske prækursorer. Derudover er en vigtig fordel ved cellefrie systemer den høje gennemløbskarakterisering af genetiske dele og genekspression ved hjælp af næste generations sekventering13 og akustisk væskehåndteringsrobotteknologi8,11,12. Sammenfattende giver S. venezuelae TX-TL toolkit5 et supplerende værktøj inden for syntetisk biologi til naturlige produkter. Den S. venezuelae TX-TL værktøjskasse vil støtte den videre udvikling af S. venezuelae som et modelsystem og give en metode til at konstruere nye syntetiske biologi dele / værktøjer og udforske sekundære metabolit biosyntetiske veje og enzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende følgende forskningsstøtte: EPSRC [EP/K038648/1] for SJM som PDRA hos PSF; Wellcome Trust sponsoreret ISSF stipendium for SJM med PSF på Imperial College London; Royal Society forskningstilskud [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED-prisen [217528/Z/19/Z] for SJM ved University of Kent; og Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. stipendium til KC ved University of Kent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 L UltraYield Flask Thomson 931136-B
3-PGA (>93%) Sigma P8877
384 Well Black/Clear Bottom Plate ThermoFisher 10692202
Ammonium chloride (98%) Fluorochem 44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) ThermoFisher R0481
Carbenicillin (contact supplier for purity) Melford C46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) Melford G32040
DFHBI (≥98% - HPLC) Sigma SML1627
DTT (contact supplier for purity) Melford MB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) Santa Cruz Biotech sc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%) Sigma G7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) Melford B2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) Sigma 49605
Magnesium chloride (98%) Fluorochem 494356
Malt extract Sigma 70167-500G
PEG-6000 Sigma 807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO ThermoFisher 88260
Poly(vinyl sulfate) potassium salt Sigma 271969
Potassium glutamate (>99%) Sigma G1149
RTS amino acid sampler 5 Prime 2401530
Sodium chloride (99%) Fluorochem 94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) Sigma 505471
Yeast Extract Melford Y1333
Equipment
Platereader BMG Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Tags

Bioengineering Udgave 175 Cellefri proteinsyntese in vitro transskription-oversættelse Streptomyces syntetisk biologi systembiologi cellefri systemer biosyntese
En high-yield <em>Streptomyces</em> Transskription-Oversættelse Toolkit til syntetisk biologi og naturlige produktapplikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T.,… More

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications. J. Vis. Exp. (175), e63012, doi:10.3791/63012 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter