Este protocolo demuestra cómo usar la planta huésped para detectar proteínas salivales de saltahojas y proteínas virales vegetales liberadas por vectores saltahojas.
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Artículo de método
Detección de virus y proteínas salivales de un vector saltahojas en el huésped vegetal
En este artículo
Resumen
Resumen
Los insectos vectores transmiten horizontalmente muchos virus vegetales de importancia agrícola. Más de la mitad de los virus de las plantas son transmitidos por insectos hemípteros que tienen piezas bucales perforadoras y chupadoras. Durante la transmisión viral, la saliva del insecto une el virus-vector-huésped porque los vectores de saliva los virus, y las proteínas del insecto, desencadenan o suprimen la respuesta inmune de las plantas de los insectos a los huéspedes de las plantas. La identificación y el análisis funcional de las proteínas salivales se están convirtiendo en una nueva área de enfoque en el campo de investigación de las interacciones arbovirus-huésped. Este protocolo proporciona un sistema para detectar proteínas en la saliva de los saltahojas utilizando la planta huésped. El vector saltahojas Nephotettix cincticeps infectado con el virus enano del arroz (RDV) sirve como ejemplo. La vitelogenina y la principal proteína P8 de la cápside externa del RDV vectorizada por la saliva de N. cincticeps se pueden detectar simultáneamente en la planta de arroz de la que se alimenta N. cincticeps. Este método es aplicable para probar las proteínas salivales que se retienen transitoriamente en el huésped de la planta después de la alimentación de insectos. Se cree que este sistema de detección beneficiará el estudio de las interacciones hemíptero-virus-planta o hemíptero-planta.
Introducción
El modo de transmisión vector-huésped de los arbovirus, un problema fundamental, está en la frontera de la ciencia biológica. Muchos virus vegetales de importancia agrícola son transmitidos horizontalmente por insectos vectores1. Más de la mitad de los virus de las plantas son vectorizados por insectos hemípteros, incluidos pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips. Estos insectos tienen características distintivas que les permiten transmitir eficientemente los virus de las plantas1. Poseen piezas bucales perforadoras-chupadoras y se alimentan de la savia del floema y el xilema, y secretan su saliva
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Protocolo
Los saltahojas adultos no virulíferos se propagaron en el Centro de Investigación de Virus Transmitidos por Vectores en la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian, China.
1. Cría de insectos no virulíferos
- Críe a los adultos en plántulas de arroz en una jaula cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (largo x ancho x alto). Mantenga un lado de la jaula cubierto con una red a prueba de insectos para ventilación.
- Mantener las jaulas con saltahojas en una incubadora que contenga un controlador de humedad incorporado a 26 °C con una humedad relativa del 60-75% bajo un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.
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Resultados
La Figura 1 ilustra todos los pasos de este protocolo: la cría de insectos, la adquisición de virus, la recolección de proteínas salivales a través de la alimentación con arroz y el western blot. Los resultados de Western blots mostraron que se observaron bandas específicas y esperadas de aproximadamente 220 kDa en las muestras de arroz y glándulas salivales de alimentación de insectos en la membrana incubada con anticuerpos contra Vg. En contraste, no se observó ninguna banda en la.......
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Discusión
La saliva secretada directamente por las glándulas salivales de los insectos perforadores-chupadores juega un papel fundamental porque predigiere y desintoxica los tejidos del huésped y los factores biológicos de los vectores en los huéspedes 1,3,4. Los factores biológicos entre reinos, incluyendo elicitores, efectores y ARN pequeño, son críticos para la comunicación insecto-huésped14,15,16
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31772124 y 31972239) y la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian (subvención KSYLX014).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| Tris base Roche | D609K69032 | para 5&veces; Tampón de tris-glicina y 10&veces; Preparación de tampón TBS | |
| glicina | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | para 5 veces; Preparación de tampón de tris-glicina |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | para 5 veces; Preparación de tampón de tris-glicina |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | para 10 veces; Preparación del tampón TBS |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | para 10 veces; Preparación de tampón TBS |
| ß-mercaptoetanol | Xiya Reactivo | B14492 | Para 4 y veces; preparación de tampón de muestra de proteínas |
| azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | para 4 veces; preparación de tampón de muestra de proteínas |
| glicerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 para 4 veces; preparación de tampón de muestra de proteínas | |
| metanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Para la preparación de tampones de transferencia |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | Para la preparación de TBST |
| leche en polvo descremada | Becton.Dickinso y compañía | 252038 | Para el bloqueo de membranas, dilución de anticuerpos |
| anti-conejo IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Reconocimiento de la esencia primaria y |
| del cuerpo ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Sustrato quimioluminiscente |
| nitrocelulosa membrana | Pall Corporation | 25312915 | Para la transferencia de proteínas |
| Tampones y soluciones | |||
| Tampón | Composición | Comentarios/Descripción | |
| 5&veces; Tampón de trisglicina | 15,1 g Tris base 94 g glycine 5 g de SDS en 1 L de agua | Solución de stock | |
| 1&veces; Tampón de tris-glicina | 200 mL de 5 veces; Tampón de trisglicina 800 mL de solución de trabajo de agua | para SDS-PAGE | |
| 10× Tampón de solución salina tamponada (TBS) | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl en 1 L de agua | Solución madre | |
| TBS con solución Tween 20 (TBST) | 100 mL 10 mL 10× TBS solución 3 mL Tween 20 900 mL de agua | Solución | |
| trabajo 4 veces; tampón de muestra de proteínas | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoetanol 0,02 g azul de bromofenol 40 mL glicerol en 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) | Para la extracción de proteínas | |
| Tampón de transferencia | 800 mL Tampón de trisglicina 200 mL de metanol | Para transferencia | |
| de proteínasInstrumentsAzul de | |||
| tampones de muestras de proteínas | |||
| 4x Incubadora de temperatura constante | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | Para la cría de saltahojas |
| Electroforesis Tanon | Science & Tecnología Co., Ltd. | Tanon EP300 | para SDS-PAGE |
| Módulo de núcleo de transferencia electroforética | BIO-RAD | 1703935 | para glicerol SDS-PAGE |
| Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Para 4 veces la preparación de tampón de muestra de proteínas | |
| glicina | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | Para 5 veces Preparación de tampón de tris-glicina |
| anti-conejo IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Reconocimiento del |
| instrumento de molienda de tejido de paso alto | primario y tibody Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | Para la molienda de tejidos vegetales |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | Para la preparación de tampones 10x TBS |
| metanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | Para la preparación de tampones de transferencia |
| Mini canal de transferencia de calor húmedo | BIO-RAD | 1703930 | para SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Para la preparación de tampón TBS 10x |
| membrana de nitrocelulosa | Pall Corporation | 25312915 | Para la transferencia de proteínas |
| leche en polvo descremada | Becton.Dickinso y compañía | 252038 | Para el bloqueo de membranas, dilución de anticuerpos |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Sustrato quimioluminiscente |
| Instrumento de color de proteínas | GE Biociencias de la salud AB | Amersham lmager 600 | Para la detección de proteínas |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | Para 5x Preparación de tampón de tris-glicina |
| Tris base | Roche | D609K69032 | Para 5x Tampón de tris-glicina y 10&veces; Preparación del tampón TBS |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY | CT30111220 | para la preparación de TBST |
| Tanque de electroforesis de placa vertical | BIO-RAD | 1658001 | para SDS-PAGE |
| Baño de agua | Shanghai Jinghong Equipo experimental Co., Ltd. | XMTD-8222 | Para hervir las muestras de proteínas |
| β-mercaptoetanol | Xiya Reactivo | B14492 | Para la preparación de tampones de muestras de proteínas 4x |
Referencias
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amste....
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Reimpresiones y permisos
