Summary
يقدم البروتوكول الحالي طريقة سريعة وفعالة ولطيفة لعزل الخلايا المفردة المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من قاطع الماوس المتنامي باستمرار ، وضرس الماوس ، والأسنان البشرية.
Abstract
تمثل الأسنان الماوسة والبشرية أعضاء صعبة لعزل الخلايا بسرعة وكفاءة للنسخ أحادي الخلية أو التطبيقات الأخرى. أنسجة لب الأسنان، غنية في مصفوفة خارج الخلية، يتطلب عملية تفكك طويلة ومملة التي عادة ما تكون وراء الوقت المعقول لn transcriptomics خلية واحدة. لتجنب التغيرات الاصطناعية في التعبير الجيني ، انقضى الوقت من القتل الرحيم حتى تحليل الخلايا المفردة يحتاج إلى تقليل. يقدم هذا العمل بروتوكول سريع يمكن من الحصول على تعليق خلية واحدة من الماوس والأسنان البشرية في نوعية ممتازة مناسبة لscRNA-seq (RNA-تسلسل خلية واحدة). ويستند هذا البروتوكول على خطوات عزل الأنسجة المتسارعة، والهضم الأنزيمي، والتحضير اللاحق للتعليق النهائي للخلية الواحدة. وهذا يتيح المعالجة السريعة واللطيفة للأنسجة ويسمح باستخدام المزيد من العينات الحيوانية أو البشرية للحصول على تعليق الخلايا مع قابلية عالية للحياة والحد الأدنى من التغييرات النسخية. ومن المتوقع أن هذا البروتوكول قد توجه الباحثين المهتمين في أداء scRNA-seq ليس فقط على الماوس أو الأسنان البشرية ولكن أيضا على الأنسجة الأخرى الغنية بالمصفوفة خارج الخلية، بما في ذلك الغضاريف والأنسجة الضامة الكثيفة والأدمة.
Introduction
تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية هو أداة قوية لفك رموز في بنية سكان الخلية الحية، والتسلسل الهرمي، والتفاعلات، و homeostasis1،2. ومع ذلك ، تعتمد نتائجها بقوة على الخطوة الأولى من هذا التحليل المتقدم - إعداد تعليق خلية واحدة ذات جودة مثالية من الأنسجة المعقدة والمنظمة تنظيما جيدا. ويشمل ذلك إبقاء الخلايا على قيد الحياة ومنع التغيرات الاصطناعية غير المرغوب فيها في ملامح التعبير الجيني للخلايا3,4. وقد تؤدي هذه التغييرات إلى توصيف غير دقيق للهيكل السكاني وسوء تفسير البيانات المجمعة.
وقد وضعت بروتوكولات محددة لعزل مجموعة واسعة من الأنسجة 5,6,7,8. وعادة ما تستخدم التفكك الميكانيكي في تركيبة مع مزيد من الحضانة مع مختلف الإنزيمات البروتيوليك. وتشمل هذه عادة التريبسين، collagenases، dispases، papain6، 7،8،9، أو خليط الانزيم المتاحة تجاريا مثل أكوتاسي، تريبل، الخ.5. الجزء الأكثر أهمية التي تؤثر على جودة النسخ هو الهضم الأنزيمي. وتبين أن الحضانة المطولة بالإنزيمات عند 37 درجة مئوية تؤثر على التعبير الجيني وتسبب في تنظيم العديد من الجينات المرتبطة بالإجهاد10,11,12,13. المعلمة الحاسمة الأخرى لعملية العزل هي طولها الإجمالي ، حيث ثبت أن نسخ الخلايا تتغير بعد نقص التروية في الأنسجة14. يقدم هذا البروتوكول بروتوكولا فعالا للعزل اللطيف للخلايا المفردة عن الأسنان البشرية والفأرة ، أسرع من البروتوكولات الأخرى المستخدمة سابقا لعزل الخلايا عن الأنسجة المعقدة5،6،9،11،13،15،16.
يقدم هذا البروتوكول كيفية تشريح الأنسجة الرخوة بسرعة من الأسنان الصلبة وإعداد تعليق خلية واحدة مناسبة لscRNA-seq. تستخدم هذه الطريقة خطوة واحدة فقط للطرد المركزي وتقلل من تأثير التغييرات النسخية غير المرغوب فيها عن طريق تقليل وقت التعامل مع الأنسجة والهضم والحفاظ على الأنسجة والخلايا عند 4 درجة مئوية معظم الوقت. يعرض الإجراء عزل الخلايا من قواطع الماوس والضرس وأسنان العقل البشري كمثال ، ولكن يجب أن يعمل بشكل أساسي لأسنان أخرى في كائنات حية مختلفة. يتم تصور البروتوكول الكامل تخطيطيا في الشكل 1. وقد استخدم هذا البروتوكول مؤخرا لتوليد أطلس نوع خلية الأسنان التي تم الحصول عليها من الماوس والأسنان البشرية1.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للأنظمة الدولية والمحلية ووافقت عليها وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية (MSMT-8360/2019-2؛ MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). تم اختبار هذا البروتوكول مع كل من الذكور والإناث البرية C57BL/6 والفئران CD-1 ومع الفئران Sox10 المعدلة وراثيا::iCreERT217 (جنبا إلى جنب مع مختلف أنظمة المراسل) على خلفية C57BL/6. وأجريت تجارب على عينات بشرية بموافقة لجان أخلاقيات كلية الطب، ومستشفى كلية جامعة ماساريك برنو وسانت آن في برنو، الجمهورية التشيكية.
1. الإعداد التجريبي وإعداد الحلول
- إعداد الأجهزة
- تبرد أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية.
- سخني غرفة الحضانة إلى 37 درجة مئوية.
- بدء تشغيل آلة فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) وتعيين جميع درجات حرارة المفرزة (بما في ذلك حامل أنبوب التجميع) إلى 4 درجات مئوية. أداء مراقبة جودة الصك، تعيين تأخير إسقاط.
- تعيين استراتيجية gating الأولية وتنفيذ الفرز الاختبار.
ملاحظة: عند استخدام FACS، استخدم فوهة 100 ميكرومتر.
- إعداد الحلول (الخطوات 1.2.1-1.2.3).
- محلول الغسيل: إعداد 2٪ FBS الطازجة (مصل الأبقار الجنينية) في HBSS (حل الملح المتوازن هانكس).
- خليط الهضم: إعداد الكولاجين الطازج P (3 U/mL) المذاب بالكامل في HBSS.
- اختياري: إعداد HBSS الطازج + BSA (0.04٪) والميثانول من الدرجة التحليلية الباردة في ثلاجة -20 درجة مئوية لتخزين تعليق الخلية الواحدة عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: الخطوة 1 يجب أن يتم تنفيذها قبل بدء التجربة. ويرد موجز لتكوين الحلول المستخدمة في الجدول التكميلي 1.
2. إعداد الحيوان التجريبي / ق والأسنان البشرية
- إعداد الحيوانات التجريبية (الماوس).
- القتل الرحيم الماوس وفقا للوائح المحلية؛ على سبيل المثال عن طريق جرعة زائدة من التخدير كما هو موضح سابقا1.
تنبيه: تختلف اللوائح الخاصة بالقتل الرحيم الإنساني للحيوانات التجريبية محليا. اتبع دائما اللوائح المحلية الصحيحة. - انتقل فورا إلى خطوة تشريح الأنسجة (الخطوة 3).
ملاحظة: إذا كان لا يمكن تشريح الأنسجة من الحيوانات التجريبية على الفور (على سبيل المثال، بسبب نقلها من منشأة سكن الحيوان)، ضع الحيوانات التجريبية على الجليد وأجر تشريح الأنسجة في أقرب وقت ممكن. للحصول على المزيد من الخلايا من لب ضرس الفأر، استخدم الحيوانات الأصغر سنا (6 أسابيع وأقل). مع زيادة العمر ، ينخفض حجم لب الأسنان. القواطع الماوس في الغالب الحفاظ على هيكلها مع زيادة العمر حتى الحيوانات من مختلف الأعمار يمكن استخدامها لتشريح الأنسجة.
- القتل الرحيم الماوس وفقا للوائح المحلية؛ على سبيل المثال عن طريق جرعة زائدة من التخدير كما هو موضح سابقا1.
- إعداد الأسنان البشرية
ملاحظة: تم استخراج الأسنان البشرية لسبب ذي صلة سريريا. تم علاج كل تشخيص بشكل فردي ، وكان جراح الأسنان ذو الخبرة يقوم دائما باستخراج الأسنان.- وضع الأسنان المستخرجة حديثا على الفور في أنبوب 50 مل مع HBSS الجليد الباردة والحفاظ على أنبوب على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: استخدام أسنان العقل المحتفظ بها من المرضى حتى سن 25-30 ينصح لأعلى إنتاجية الخلية.
- وضع الأسنان المستخرجة حديثا على الفور في أنبوب 50 مل مع HBSS الجليد الباردة والحفاظ على أنبوب على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
3. تشريح الأنسجة
- عقد الحيوان التجريبي وراء رأسه، وتبحث على الجانب البطني من رأسه بحيث يشير الذيل بعيدا.
- باستخدام مقص صغير وحاد ، قم بسرعة بإزالة الجلد من الفك السفلي لفضح القوس الفك السفلي ، والأنسجة الرخوة بين كل نصف الفك السفلي ، وعضلات الوجه المجاورة.
- جعل قطع عميق من كل جانب من الفك السفلي؛ أولا، من خلال مدلكة م على طول الجانب buccal من الفك السفلي حتى المفصل المؤقت، ومن ثم على طول الجزء الداخلي من كل نصف الفك السفلي من خلال قاعدة تجويف الفم (انظر الشكل التكميلي 1).
- قطع جميع العضلات والأربطة على طول الفك السفلي حتى المفصل المؤقت من خارج وداخل تجويف الفم.
ملاحظة: تجنب قطع العظام. هذا قد يضر الجزء الأكثر apical من القاطع. - فهم الفك السفلي باستخدام ملاقط طرف عازمة وإزالتها. ثم، تقسيم الفك السفلي تشريح إلى نصفين مع مقص عن طريق قطع من خلال البرمائيات الفك السفلي (انظر الشكل التكميلي 1).
- استخدام مسح الوبر منخفضة الصناعية لغضب الأنسجة الرخوة المتبقية من كل نصف الفك السفلي. بعد تنظيف كلا الجزءين من الفك السفلي ، ضعهما في طبق بيتري معد مسبقا مع HBSS بارد الجليد.
ملاحظة: من هذه النقطة إلى الأمام، والعمل على الجليد. يتم إجراء تشريح إضافي لقواطع الفئران والأضراس تحت منظار مجسم ذو خلفية سوداء. - قواطع رجوبة الماوس
- لتشريح القواطع الفك السفلي، وإزالة التلال السنفية مع جميع الأضراس الثلاثة والكراك عرضية قوس الفك السفلي في المكان المقابل للموضع بين الضرس الأول والثاني.
ملاحظة: يتم استخدام شفرة مشرط حادة رقم 11 وملاقط لتنفيذ هذه الخطوة (انظر جدول المواد). - سحب بعناية القاطع من بقية مقبس الأسنان.
ملاحظة: إذا نجحت، فإن القاطع المستخرج يحتوي على أجزاء apical سليمة، بما في ذلك الأنسجة الظهارية مع حلقات عنق الرحم كاملة. - إذا لزم الأمر، قم بإزالة الأجزاء المتبقية من العظام التي لا تزال متصلة بالقاطع بالملاقط والمشرط.
- ضع القواطع المتشرخة في HBSS الطازجة الباردة الجليدية وتشريح الأنسجة ذات الاهتمام: حلقة عنق الرحم ، لب الأسنان ، أو أجزاء أخرى من السن.
- ضع الأنسجة الرخوة المفرخة في قطرة من HBSS الطازجة الباردة الجليد في منتصف طبق بيتري 10 سم. ابق على الجليد.
- لتشريح القواطع الفك السفلي، وإزالة التلال السنفية مع جميع الأضراس الثلاثة والكراك عرضية قوس الفك السفلي في المكان المقابل للموضع بين الضرس الأول والثاني.
- الأضراس الفكية الماوس
- لتشريح الأضراس الفك السفلي، وإزالة تماما التلال الحويصلة من بقية الفك السفلي باستخدام شفرة مشرط.
- نقل قمة السنفات تشريح إلى الطازجة، والجليد الباردة HBSS في طبق بيتري وإزالة بعناية جميع الشظايا المتبقية من العظام السنفية تعلق على الجذور.
- ضع الأضراس المتشرذجة دون عظم السنفية في HBSS الطازجة الباردة الجليد. لفضح اللب، والبدء في إزالة أجزاء من دينتين من الجانب apical باستخدام ملاقط تلميح غرامة وحادة حتى تصل إلى تجويف اللب.
- بمجرد الوصول إلى تجويف اللب ، قم بتشريح لب الأسنان بعناية باستخدام زوج من ملاقط البقشيش الحادة ووضع الأنسجة الرخوة لب الأسنان في قطرة من HBSS الطازجة الباردة الجليد في منتصف طبق بيتري 10 سم المحفوظة على الجليد.
ملاحظة: منذ اللب الأضراس الماوس صغيرة للغاية، والتكيف التكبير على مجسم وفقا لذلك.
- سن الإنسان
- غسل الأسنان البشرية مرة أخرى في HBSS الجليد الباردة لإزالة الدم المتبقي.
- ضع السن في ثلاثة أكياس بلاستيكية معقمة سميكة الجدران واستخدم قناع مهندس من الحديد الزهر لكسر السن. استخدام الفكين vise مع سطح مستو لتجنب اختراق الحقائب.
- تشديد ببطء فيس حتى تسمع تكسير الأسنان. إزالته من الحقائب ووضعه في الطازجة، والجليد الباردة HBSS في طبق بيتري.
- باستخدام اثنين من ملاقط، والخروج من لب الأسنان، وتنظيفه من جميع بقايا الأنسجة الصلبة ووضعه في قطرة واحدة من HBSS الجليد الباردة في منتصف طبق بيتري 10 سم أبقى على الجليد.
تنبيه: قد تكون الأنسجة البشرية معدية. عند العمل مع الأنسجة البشرية، استخدم معدات الحماية لتجنب الاتصال المباشر مع الأنسجة.
4. إعداد تعليق خلية واحدة
- إعداد أنبوب 15 مل مع 2.5 مل من خليط الهضم تتألف من كولاجيناز P (3 U / مل) حل تماما في HBSS. الحفاظ على الحل على الجليد حتى الاستخدام.
ملاحظة: دائما استخدام كولاجيناز P الطازجة; لا تجميد aliquots. يختلف نشاط Collagenase P من دفعة إلى دفعة. تحقق من نشاط الدفعة قبل التخفيف. يتم تنشيط كولاجيناز P عن طريق الكالسيوم، الذي كمية كافية بالفعل في مسحوق الليوفيلي. لذلك، فإنه من غير الضروري لإثراء مزيج الانزيم مع الكالسيوم. Collagenase P لا يتم تعطيلها من قبل FBS ولكن يمكن تعطيلها من قبل وكلاء chelating (على سبيل المثال، الإيثيلينديامينتتراستيك - EDTA). يتم ضمان وقف عملية الانفصال عن طريق تمييع كولاجيناز P في محلول الغسيل (2٪ FBS في HBSS). وقد تبين أن إضافة FBS يزيد من صلاحية الخلية والعدد النهائي للخلايا بعد فرز18. - باستخدام شفرة مشرط مستديرة الشكل رقم 10 ، اقطع الأنسجة في جميع الاتجاهات إلى أصغر قطع ممكنة. إعادة تجميع قطع الأنسجة في منتصف القطيرات وقطع المجاميع الأنسجة مرارا وتكرارا باستخدام شفرة مشرط مستديرة الشكل (رقم 10). كرر هذه العملية عدة مرات حتى يتم فرم المواد بما فيه الكفاية.
- نقل قطع الأنسجة الممزقة باستخدام طرف ماصة 1 مل في خليط الهضم المعدة.
ملاحظة: في حالة وجود عدد أكبر من الحيوانات التي تتم معالجتها في وقت واحد، تقسيم الأنسجة إلى عدة أنابيب مع Collagenase P. الحد الأقصى للمبلغ لكل أنبوب هي اللب التي تم الحصول عليها من ما يقرب من 10 قواطع الماوس. في حالة الأضراس ، حيث اللب أصغر بكثير ، يمكن زيادة عدد اللب المعالج بشكل كاف. عند استخدام الأسنان البشرية، استخدم 2-3 لب في الأنبوب كحد أقصى، اعتمادا على حجم اللب. - ضع الأنبوب في حاضنة مسخنة بزاوية 37 درجة مئوية مع شاكر. إمالة الأنبوب داخل شاكر إلى زاوية 60 درجة وتعيين السرعة إلى 150-200 دورة في الدقيقة لضمان حركات التعليق المستمر داخل الأنبوب.
- triturate بقوة تعليق كل 3-4 دقيقة مع طرف ماصة 1 مل لتتفكك جميع الكتل.
ملاحظة: مع مرور الوقت، سوف تصبح كتل أصغر وأكثر ليونة حتى تختفي تقريبا. - في المجموع، حضانة لمدة 15-20 دقيقة. في نهاية الحضانة، triturate للمرة الأخيرة، ومن ثم إضافة ببطء الجليد الباردة غسل الحل إلى حجم النهائي من 12 مل.
- إزالة الكتل المتبقية أو قطعة من الأنسجة المتكلسة عن طريق تصفية تعليق باستخدام مصفاة الخلية 50 ميكرومتر.
- خذ 10-20 ميكرولتر من تعليق الخلية المصفاة واحص الخلايا أثناء الطرد المركزي باستخدام غرفة عد الخلايا (مقياس الدم). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × ز عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant باستخدام ماصة المصلية 10 مل.
ملاحظة: إذا كان عدد الخلايا محدودا ولا يمكن احتسابه في التعليق المخفف، فتخطى عد الخلايا واستخدم كافة الخلايا للمعالجة الإضافية. - اختياري: تابع التثبيت والتخزين21.
- إعادة تعليق الكريات (ما يصل إلى 107 خلايا) في 100 uL من HBSS + BSA (0.04٪).
- أضف 400 ميكرولتر من الميثانول المبرد واخلط ببطء.
- احتضان تعليق الخلية لمدة 15 دقيقة على الجليد.
- يخزن عند -80 درجة مئوية حتى تتم معالجته (لا يزيد عن شهر واحد).
- Resuspend بيليه في محلول غسل. الهدف ل700-1200 الخلايا / μL من محلول غسل.
- إبقاء الأنبوب على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بإجراء التثبيت والتخزين عند -80 درجة مئوية. ومع ذلك، ينصح المعالجة الفورية للتعليق الخلية لscRNA-seq. وسوف تعتمد خطوات أخرى على أساس بروتوكول RNA seq أحادي الخلية. عندما يستخدم بروتوكول scRNA-seq نظام microfluidic (تقوم به بعض شركات sc-RNA-seq) ، قم بتحميل الخلايا استنادا إلى إرشادات الشركة المصنعة إما مباشرة أو بعد فرز الخلايا. - بالنسبة إلى FACS، انتقل إلى الخطوة 5.
5. تفلورسينس تنشيط فرز الخلايا (FACS)
- قبل الفرز، قم بإعداد أداة فرز الخلية.
- تهدئة النظام بأكمله إلى 4 درجة مئوية، أداء مراقبة جودة الصك، تعيين تأخير انخفاض والجهد من لوحات انحراف. وضع أنابيب جمع في حامل أنبوب جمع.
ملاحظة: لتجنب خطوات الطرد المركزي الإضافية التي تؤدي إلى فقدان خلية حتمي، قم بفرز الخلايا إلى ميكروتوب (1.5 مل) مع كمية صغيرة (25-50 ميكرولتر) من محلول الغسيل.
- تهدئة النظام بأكمله إلى 4 درجة مئوية، أداء مراقبة جودة الصك، تعيين تأخير انخفاض والجهد من لوحات انحراف. وضع أنابيب جمع في حامل أنبوب جمع.
- اختياري: أداء تلطيخ قابلية البقاء قبل FACS.
- إضافة يوديد البروبيديوم إلى تعليق الخلية قبل FACS إلى تركيز نهائي 0.5 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- تحميل العينة في مفرز الخلية. وضع استراتيجية صارمة لgating لإزالة حطام الخلية ، doublets ، والخلايا الميتة. فرز الخلايا في أنبوب معد أو لوحات متعددة الآبار. 10- ويظهر مثال على استراتيجية النذيرية في الشكل 2.
ملاحظة: لتقليل خطوات المعالجة وتسريع البروتوكول، ينصح بتطبيق استراتيجية صارمة للغاتينج (المقترحة في الشكل 2) بدلا من استخدام تلطيخ صلاحية. لفصل الخلايا المناعية عن السكان المعزولين ، يمكن إجراء تلطيخ الأجسام المضادة CD45. لتنفيذ هذا، تعليق الخلية resuspend في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ (PBS + 2٪ FBS + المضادة CD45-APC الأجسام المضادة المترافقة 1/100 التخفيف). حضانة لمدة 15 دقيقة على الجليد المحمية من الضوء وأداء FACS مباشرة.
Representative Results
تم إجراء العزل المثالي للخلايا المفردة من قواطع الفك السفلي من ذكر فأر C57BL/6 يبلغ من العمر 6 أسابيع. وبعد هذا البروتوكول، تم إعداد تعليق وحيد الخلية، وبعد ذلك، تم إجراء تسلسل وحيد الخلية. تم تحليل التعليق المعد أحادي الخلية وفرزه باستخدام FACS (الشكل 2). أولا، تم تطبيق رسم FSC-A (مبعثر أمامي، منطقة) وSSC-A (مبعثر جانبي، منطقة)، وتم استخدام استراتيجية مناسبة لتحديد مجموعة سكانية ذات حجم وحبيبة متوقعين لتصفية حطام خلايانا ومزدوجات الخلايا أو مجاميعها (الشكل 2A). وقد استخدم هذا العدد المحدد من السكان (P1)، الذي يعد 38 في المائة من جميع الأحداث، وطبقت معلمات FSC-A و FSC-H (مبعثر إلى الأمام، الارتفاع) لإزالة مزدوجات الخلية المتبقية (الشكل 2B). السكان دون doublets الخلية (P2) عد 95٪ من P1 يمكن استخدامها في وقت لاحق لscRNA-seq. بدلا من ذلك، يمكن استخدام غاغينج إضافية لاختيار السكان من الفائدة (على سبيل المثال، التعبير عن البروتينات الفلورية أو تلطيخ حية / ميتة). للتحقق من عدد الخلايا الحية / الميتة في التعليق النهائي ، تم إجراء تلطيخ PI (يوديد البروبيديوم) (الشكل 2C). وكان عدد السكان P3 التي تحتوي على PI- (المعيشة) الخلايا 98.4٪ من السكان P2 الأم و 35.5٪ من مجموع الأحداث. كان العدد الإجمالي للخلايا المصفاة والميتة (PI+) 1887.
العدد النهائي من الخلايا التي تم الحصول عليها دون تلطيخ صلاحية مناسبة لرنا-seq (P2) عد 118,199 خلايا من اثنين من اللب قاطعة الماوس. وهذا يعني أن عدد الخلايا الحية ما يقرب من 60،000 من قاطع الفك السفلي واحد.
لتوضيح عدد الخلايا المناعية في التعليق النهائي للخلية الواحدة ، تم استخدام نهجين. أولا، تم استخدام تلطيخ الأجسام المضادة CD45 وتحليل FACS اللاحق. كطريقة تكميلية، تم تحليل العدد الإجمالي للخلايا المناعية (CD45+) في بيانات scRNA-seq. وأظهر تحليل FACS 14.44٪ من خلايا CD45 + (13.20٪ على قيد الحياة و 1.24٪ ميتة) (الشكل 3A). أظهر تحليل بيانات scRNA-seq 10.90٪ من الخلايا المعبرة عن CD45 (الشكل 3B). يمكن أن يكون سبب انخفاض خلايا CD45+ في بيانات scRNA-seq عن طريق عتبات إضافية أثناء تحليل scRNA-seq.
هذه البيانات التمثيلية على سبيل المثال من قاطع الماوس تبين أن بروتوكول معين في تركيبة مع استراتيجية صارمة gating فعالة في الحصول على عدد كبير من الخلايا من سن الماوس واحد دون الحاجة إلى استخدام إضافي للتلطيخ الجدوى. كانت نسبة الخلايا المناعية (CD45+) طفيفة (13.2٪). وعلاوة على ذلك، كان من الواضح سابقا أن الخلايا المناعية ضرورية في الحفاظ على التوازن الأسنان، لذلك إزالتها من تحليل scRNA-seq خلال FACS سيكون له نتائج عكسية في بعض التطبيقات.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول. يتم تمثيل خطوات مختلفة ، بما في ذلك ظروف درجة الحرارة والوقت المتوقع ، لإعداد تعليق خلية واحدة من الماوس والأسنان البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على استراتيجية الصياغة. تم استخدام FSC-A و SSC-A gating لإنتاج بوابة P1 ، مما يعكس عدد الخلايا مع الحجم المتوقع والحبيبة وتصفية حطام الخلية والمصفوفة خارج الخلية ومعظم الأحداث الكبيرة (A). وفي وقت لاحق، تم رسم السكان P1 في FSC-H و FCS-A المؤامرة، والتي تصفية doublets الخلية (B). ثم تم تحليل هذه السكان P2 لوجود الخلايا الميتة من قبل يوديد البروبيديوم (C). يتم تمثيل عدد الأحداث/الخلايا لكل بوابة في (D). (FSC-A - مبعثر إلى الأمام، منطقة؛ SSC-A - مبعثر الجانب، المنطقة؛ FSC-H - مبعثر إلى الأمام، وارتفاع؛ PI - يوديد البروبيديوم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد كمية الخلايا المناعية. تم إجراء القياس الكمي للخلايا المناعية من خلال تحليل FACS للخلايا الملطخة بالأجسام المضادة للCD45 وتحليل Live/Dead باستخدام تلطيخ يوديد البروبيديوم (A). تم إجراء مزيد من القياس الكمي للخلايا المناعية أثناء تحليل scRNA-seq (B). (CD45-APC - المضادة CD45 الفيزيقيون الأجسام المضادة المترافقة; PI - يوديد البروبيديوم؛ t-SNE - t-وزعت التضمين جارة stochastic). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: نظرة عامة على عملية تشريح الفك السفلي. توضح الخطوط المتقطعة التخفيضات المقترحة. TMJ - المفصل المؤقت، م مدلك - مدلك العضلات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: تكوينات الحلول المستخدمة في الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Discussion
دراسة الأسنان والعظام على المستوى الخلوي أو الجزيئي هو التحدي عموما منذ الخلايا التي تشكل هذه الأنسجة محاطة أنواع مختلفة من المصفوفات الصلبة19. واحدة من الأهداف الرئيسية لأداء RNA-seq خلية واحدة على أنسجة الأسنان هو الحاجة إلى الحصول على خلايا ذات أهمية سريعة ودون أي تغييرات مصطنعة في النسخ الخاصة بهم. ولتحقيق ذلك، تم تطوير بروتوكول عالي الكفاءة مناسب لعزل الخلايا عن لب الأسنان البشرية والفأرة، والذي يسمح بالتوليد السريع للتعليق أحادي الخلية لجميع التطبيقات النسخية. وقد تم ضمان ذلك عن طريق عزل الأنسجة بسرعة، وتقليل خطوات التلاعب بالأنسجة والخلايا، وتبسيط الهضم الميكانيكي والانزيمي.
أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي المعالجة السريعة للأنسجة وإعداد تعليق الخلايا المفردة الكافي8,9. يتم استخدام نهج يدوي للحصول على لب الأسنان دون استخدام مثقاب الأسنان أو غيرها من الأجهزة المولدة للحرارة. قد يسبب ارتفاع درجة الحرارة تعبيرا اصطناعيا عن بروتينات الصدمة الحرارية والجينات الأخرى ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى أن تكون أنماط التعبير الجينية التي تم تحليلها غير تمثيلية للأنسجة الأصلية20. قد يكون الحصاد اليدوي للأنسجة خطوة صعبة من المرجح أن تحتاج إلى بعض التدريب مسبقا. ثم يقطع اللب إلى قطع صغيرة ويهضم بشكل أنزيمي عند 37 درجة مئوية. باستثناء 15-20 دقيقة من الهضم الأنزيمي ، يتم تنفيذ البروتوكول بأكمله عند 4 درجات مئوية. تم تقليل معالجة الأنسجة وخاصة الهضم الأنزيمي إلى أقصر وقت ممكن لأن الحضانة الأكثر طولا عند 37 درجة مئوية يمكن أن تسبب تغييرات في أنماط التعبير الجيني10. يوصى بإزالة الدنتين ميكانيكيا قبل الهضم الأنزيمي. يحتوي دينتين والبردينتين المرفق بالب على كمية كبيرة من الكولاجين ، وقد يقلل وجوده المفرط من فعالية محلول الهضم. بعد إزالتها من الجسم (أو موت الكائنات الحية) ، تبين أن الخلايا تبدأ في تعديل أنماط التعبير الجيني بسرعة12. لذلك، يجب إجراء عزل الخلايا ومعالجتها في أسرع وقت ممكن. البروتوكول الحالي يقلل من وقت المعالجة إلى 35-45 دقيقة من عزل الأنسجة (القتل الرحيم الحيوان) لإعداد تعليق خلية واحدة.
تعديل بديل واحد من هذه التقنية هو الحفاظ على الخلية لاستخدامها في وقت لاحق. ويتحقق ذلك عن طريق تثبيت الميثانول. يمكن تخزين تعليق الخلية الثابتة الميثانول لمدة تصل إلى 1 شهر في -80 درجة مئوية، كما هو موضح في protocol21. ومع ذلك، كلما كان ذلك ممكنا، أداء scRNA-seq مباشرة، حيث تبين أن البيانات ذات الخلية الواحدة من تعليق خلية واحدة ثابتة الميثانول قد تعاني من زيادة التعبير عن الجينات المرتبطة بالإجهاد والتلوث مع الحمض النووي الريبي المحيط 22. قد تحتاج هذه الخطوة إلى تعديل إضافي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
قبل التطبيق الأول من هذا البروتوكول، ينصح بإجراء عدة خطوات التحقق من الصحة لاختبار هذه التقنية. ومن تجربتنا، نقترح اختبار الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه للبروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، نقترح اختبار فعالية محلول Collagenase P واختبار التعامل مع خطوة تفكك الأنسجة. على وجه التحديد، حول أول 5 دقائق بعد بدء حضانة كولاجيناز P، يجب أن تتجمع قطع الأنسجة معا. وهذا وضع شائع. تتفكك المجاميع كل 3-4 دقائق باستخدام ماصة 1 مل ، ومع زيادة الوقت ، يجب أن تصبح أصغر حتى بالكاد مرئية.
وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن إجراء عد الخلايا في غرفة عد الخلايا قبل الطرد المركزي وقبل وبعد التصفية للكشف عن الخسائر المحتملة في الخلايا بسبب إزالة الخلايا الفائقة دون المستوى الأمثل. إذا كان التعليق النهائي أحادي الخلية يحتاج إلى تنقية، يمكن استخدام FACS. فرز الخلية لا تمكن فقط لإزالة الحطام أو الخلايا الميتة ولكن الأهم من ذلك تمكن من إثراء التعليق النهائي مع الخلايا المسمى fluorescently13,19. لتجنب إجهاد القص أو انسداد مفرز الخلية، يتم استخدام فوهة واسعة (85 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر). وهذا من شأنه أن يزيد من تحسين صلاحية الخلايا المفرزة.
تم تصميم هذه التقنية واختبارها على كل من الماوس والأسنان البشرية. العامل الرئيسي المقيد هو العدد الصغير من الخلايا في لب الأسنان المنخفض لأسنان الفئران الأكبر سنا (الأضراس) والبشر. لنفترض أن هناك عدد أكبر من الخلايا التي تحتاج إلى الحصول عليها أو الخلايا من أسنان المرضى الأكبر سنا هي التي يتعين الحصول عليها. أحد الحلول الممكنة هو معالجة عدد أكبر من الأسنان ودمجها في دفعة واحدة ، تتم معالجتها لاحقا كعينة واحدة.
تم عزل الخلايا الحية من لب الأسنان البشري لأول مرة منذ أكثر من عشرين عاما باستخدام خليط إنزيم من الكولاجيناز الأول وdispase23. ومنذ ذلك الحين، أصبحت عزلات خلايا لب الأسنان تستخدم على نطاق واسع، واستخدمت عدة تقنيات 5،6،7،8. الأهمية الحاسمة للطريقة المعروضة هنا هو التكيف من جميع خطوات العزل لجعل العزلة سريعة ولطيفة لضمان جودة عالية من تعليق الخلية النهائي لscRNA-seq. يمكن الحصول على زيادة غلة الخلايا عن طريق الحضانة لفترات أطول مع الإنزيمات. يوفر هذا البروتوكول حلا فعالا للحصول بسرعة على خلايا واحدة من الماوس والأسنان البشرية ذات جودة مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. ومن المتوقع أن تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع للأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى مع تعديلات تقنية طفيفة فقط.
Disclosures
ولا يعلن المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
حصل ج. ك. على دعم وكالة المنح بجامعة ماساريك (MUNI/H/1615/2018) وبأموال من كلية الطب إلى باحث مبتدئ. وقد تم دعم J.L. من قبل وكالة المنح في جامعة ماساريك ( MUNI / IGA / 1532/2020) وهو حاصل على منحة Brno Phd. Talent - بتمويل من بلدية مدينة برنو. T.B. كان مدعوما من قبل صندوق العلوم النمساوي (منحة ليز ميتنر: M2688-B28). نشكر ليدي إيزاكوفيتشوفا هولا وفيرونيكا كوفار ماتيوفا على مساعدتهما في الحصول على أسنان بشرية. وأخيرا، نشكر راديك فيدر وكاريل سوسيك على مساعدتهما الرقيقة في فرز ال FACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
