Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Frakturen an erwachsenen Mäusen durchzuführen und den Heilungsprozess zu überwachen.
Abstract
Die Frakturreparatur ist eine wesentliche Funktion des Skeletts, die in vitro nicht zuverlässig modelliert werden kann. Ein Mausverletzungsmodell ist ein effizienter Ansatz, um zu testen, ob ein Gen, ein Genprodukt oder ein Medikament die Knochenreparatur beeinflusst, da murine Knochen die während der menschlichen Frakturheilung beobachteten Stadien rekapitulieren. Wenn eine Maus oder ein Mensch einen Knochen bricht, wird eine Entzündungsreaktion ausgelöst, und das Periost, eine Stammzellnische, die den Knochen selbst umgibt, wird aktiviert und expandiert. Zellen, die sich im Periost befinden, differenzieren sich dann zu einem vaskularisierten weichen Kallus. Der Übergang vom weichen Kallus zu einem harten Kallus erfolgt, wenn sich die rekrutierten Skelettvorläuferzellen in mineralisierende Zellen differenzieren und die Überbrückung der gebrochenen Enden zur Knochenvereinigung führt. Der mineralisierte Kallus wird dann umgebaut, um die ursprüngliche Form und Struktur des geheilten Knochens wiederherzustellen. Die Frakturheilung wurde an Mäusen mit verschiedenen Verletzungsmodellen untersucht. Dennoch ist der beste Weg, diesen gesamten biologischen Prozess zu rekapitulieren, den Querschnitt eines langen Knochens zu durchbrechen, der beide Kortexe umfasst. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine stabilisierte, transversale Femurfraktur sicher durchgeführt werden kann, um die Heilung bei erwachsenen Mäusen zu beurteilen. Ein chirurgisches Protokoll mit detaillierten Ernte- und Bildgebungstechniken zur Charakterisierung der verschiedenen Stadien der Frakturheilung wird ebenfalls bereitgestellt.
Introduction
Frakturen, Brüche in der Kontinuität der Knochenoberfläche, treten in allen Segmenten der Bevölkerung auf. Sie werden bei Menschen, die aufgrund von Alterung oder Krankheit zerbrechliche Knochen haben, schwer, und die Gesundheitskosten von Fragilitätsfrakturen werden in 5 Jahren voraussichtlich 25 Milliarden US-Dollar übersteigen 1,2,3,4,5. Das Verständnis der biologischen Mechanismen, die an der Frakturreparatur beteiligt sind, wäre ein Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Therapien, die darauf abzielen, den Heilungsprozess zu verbessern. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass bei einer Fraktur vier signifikante Schritte auftreten, die es dem Knochen ermöglichen, zu heilen: (1) Bildung des Hämatoms; (2) Bildung eines fibroknorpeligen Kallus; (3) Mineralisierung des weichen Kallus zur Bildung von Knochen; und (4) Umbau des verheilten Knochens 6,7. Viele biologische Prozesse werden aktiviert, um die Fraktur erfolgreich zu heilen. Zunächst wird unmittelbar nach einer Fraktur eine akute entzündungsfördernde Reaktion eingeleitet 6,7. Dann wird das Periost aktiviert und dehnt sich aus, und periostale Zellen differenzieren sich in Chondrozyten, um einen Knorpelkallus zu bilden, der wächst, um die Lücke zu füllen, die die gestörten Knochensegmente hinterlassen 6,7,8,9. Nerven- und Gefäßzellen dringen in den neu gebildeten Kallus ein, um zusätzliche Zellen und Signalmoleküle bereitzustellen, die zur Erleichterung der Reparaturbenötigt werden 6,7,8,9,10. Periostatale Zellen tragen nicht nur zur Bildung von Kallusen bei, sondern differenzieren sich auch zu Osteoblasten, die gewebten Knochen im überbrückenden Kallus ablegen. Schließlich bauen Osteoklasten den neu gebildeten Knochen um, um zu seiner ursprünglichen Form und lamellären Strukturzurückzukehren 7,8,9,10,11. Viele Gruppen entwickelten Mausmodelle zur Frakturreparatur. Eines der früheren und am häufigsten verwendeten Frakturmodelle bei Mäusen ist der Einhorn-Ansatz, bei dem ein Gewicht ab einer bestimmten Höhe12 auf das Bein fällt. Die mangelnde Kontrolle über den Winkel und die Kraft, die angewendet wird, um die Fraktur zu induzieren, erzeugt eine große Variabilität in der Lage und Größe der Knochendiskontinuität. Anschließend führt dies zu Variationen in der beobachteten spezifischen Frakturheilungsreaktion. Andere beliebte Ansätze sind chirurgische Eingriffe zur Erzeugung eines tibialen monokortikalen Defekts oder Stressfrakturen, Verfahren, die vergleichsweise mildere Heilungsreaktionen induzieren10,13. Die Variabilität in diesen Modellen ist in erster Linie auf die Person zurückzuführen, die das Verfahren durchführt14.
Hier ermöglicht ein detailliertes Maus-Femurverletzungsmodell die Kontrolle über den Bruch, um eine reproduzierbare Verletzung zu ermöglichen und eine quantitative und qualitative Bewertung der Femurfrakturreparatur zu ermöglichen. Insbesondere wird ein vollständiger Durchbruch in den Oberschenkelknochen erwachsener Mäuse eingeführt und stabilisiert die Frakturenden, um die Rolle der körperlichen Belastung bei der Knochenheilung zu berücksichtigen. Die Methoden zur Gewebeentnahme und Bildgebung der verschiedenen Schritte des Heilungsprozesses mittels Histologie und Mikrocomputertomographie (MikroCT) werden ebenfalls ausführlich erläutert.
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Protocol
Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Harvard Medical Area genehmigt. In diesem Protokoll wurden 12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse (Männchen und Weibchen) verwendet. C57BL/6J männliche und weibliche Mäuse erreichen eine maximale Knochenmasse im Alter von etwa 12 Wochen mit Oberschenkelknochen, die breit genug sind, um einen stabilisierenden Stift unterzubringen, was sie zu einer geeigneten Belastung für dieses Protokoll15 macht.
1. Vorbereitung auf die Operation
- Autoklavieren Sie die chirurgischen Geräte, einschließlich chirurgischer Scheren, gerader Pinzetten, gebogener Pinzetten, chirurgischer Klemmen und Diamantschneidraden (siehe Materialtabelle), um das Infektionsrisiko zu minimieren.
- Legen Sie einen sauberen Mauskäfig auf ein Heizkissen, um die postoperative Genesung zu erleichtern. Stellen Sie das Heizkissen so ein, dass es eine Temperatur zwischen 37-45 ° C erreicht.
- Stellen Sie die Maus mit einer Isoflurankammer unter Narkose. Stellen Sie den induktiven Sauerstofffluss auf 2 l / min, die Isofluran-Induktion auf 2-4%, den Sauerstoff des Erhaltungskegels auf 2 l / min und den Erhaltungsisofluran auf 1,4%.
- Vergewissern Sie sich, dass die Atmung der Maus stabil ist und sie nicht auf eine Zehenzwicke reagiert. Tragen Sie eine dünne Schicht Augensalbe auf jedes Auge auf, um Hornhautkratzer zu vermeiden. Überführen Sie die Maus auf ein steriles Pad und halten Sie die Anästhesie mit einem Nasenkonus aufrecht, um Isofluran kontinuierlich mit der gleichen Geschwindigkeit wie in Schritt 1.3 abzugeben.
HINWEIS: Die Verwendung von 12 Wochen alten Mäusen oder älter wird empfohlen, da Femuren von jüngeren Mäusen möglicherweise zu dünn sind, um einen stabilisierenden Stift unterzubringen. - Injizieren Sie der Maus subkutan 0,05 mg/kg Körpergewicht langsam freisetzendes Buprenorphin (siehe Materialtabelle).
- Rasieren Sie mit einem elektrischen Trimmer ein 2 x 2 cm großes Quadrat auf beiden Oberschenkeln, das der Position des Femurs entspricht.
- Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit steriler Gaze oder Tupfern, um eine Jodschicht zu verteilen, gefolgt von einer Spülung mit 70% Ethanol (Abbildung 1A).
2. Chirurgie
- Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 5-mm-Schnitt in der rasierten, desinfizierten Region und schälen Sie die Haut ab, um die darunter liegende Faszie freizulegen.
- Verwenden Sie gerade Pinzetten und feine Scheren, um die Faszie, die den Femur direkt bedeckt, vorsichtig zu greifen und zu schneiden, um den Muskel freizulegen. Ein 5-mm-Schnitt der Faszie reicht aus, um auf den darunter liegenden Muskel zuzugreifen.
- Verwenden Sie ein Paar gerade Pinzetten und trennen Sie den Muskel sanft vom Femur mit minimaler Gewebeschädigung.
- Sobald der Femur sichtbar ist, schieben Sie die gekrümmte Pinzette unter den Femur zwischen dem abgetrennten Muskel und Knochen. Lassen Sie die Pinzette langsam öffnen, um die Muskeltrennung aufrechtzuerhalten, und sichern Sie den Femur, um einen sauberen Schnitt zu ermöglichen.
HINWEIS: Der Femur muss freiliegend und vom Muskel und der Haut getrennt bleiben, wenn die Pinzette nicht gehalten wird, wie in Abbildung 1B dargestellt. - Machen Sie einen Querschnitt in der Mitte des Femurschafts mit einer Handsäge auf der niedrigen Leistungseinstellung (siehe Materialtabelle für das verwendete Blatt und das Rotary Tool Kit).
HINWEIS: Sobald der Femur vollständig geschnitten ist, entstehen zwei Frakturenden: der proximale Abschnitt (am Hüftknochen befestigt) und der distale Abschnitt (am Knie befestigt, auch bekannt als das Würgegelenk). Vermeiden Sie es, den Femur in einer einzigen Bewegung zu schneiden. Machen Sie stattdessen 3-5 Durchgänge, bis der Femur vollständig durchtrennt ist. Dies ist entscheidend, um eine Überhitzung des umgebenden Gewebes und die Erzeugung erheblicher Knochenreste zu vermeiden, die sich negativ auf die Heilung auswirken. - Führen Sie eine Leitnadel (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (siehe Materialtabelle) in die Markhöhle des distalen Abschnitts ein. Drehen Sie die Nadel mit den Fingern vorsichtig, während Sie durch das Kniegelenk drücken (Abbildung 1C).
- Entfernen Sie die Leitnadel vom distalen Ende und wiederholen Sie dies am proximalen Ende, indem Sie die Führungsnadel mit der gleichen sanften Drehbewegung durch das Hüftgelenk drücken. Lassen Sie die Führungsnadel im proximalen Ende, wobei ihre Spitze aus der Haut hervortritt (Abbildung 1D).
HINWEIS: Um die Bruchenden zu stabilisieren, wurde zuerst eine Führungsnadel verwendet, um einen Weg durch die Bruchenden zu schaffen, und dann wurde ein stabilisierender Stift durch diesen Weg gefädelt, um die Bruchenden14 zu sichern.
- Entfernen Sie die Leitnadel vom distalen Ende und wiederholen Sie dies am proximalen Ende, indem Sie die Führungsnadel mit der gleichen sanften Drehbewegung durch das Hüftgelenk drücken. Lassen Sie die Führungsnadel im proximalen Ende, wobei ihre Spitze aus der Haut hervortritt (Abbildung 1D).
- Stecken Sie den Stabilisierungsstift (Nadel, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (siehe Materialtabelle) in die Spitze der Leitnadel (Abbildung 1E). Drücken Sie vorsichtig so, dass der stabilisierende Stift eintritt, wenn die Führungsnadel die Knochenmarkshöhle des proximalen Endes verlässt.
- Entsorgen Sie die Leitnadel. Verwenden Sie eine Pinzette, um das distale Ende mit dem proximalen Ende zu halten und auszurichten, und fädeln Sie den stabilisierenden Stift weiterhin durch die distale Markhöhle, bis er das Kniegelenk mit dem in 2.6 hergestellten Weg verlässt (Abbildung 1F).
HINWEIS: Der stabilisierende Stift sollte nun aus der Hüfte und den Kniegelenken herausragen.
- Entsorgen Sie die Leitnadel. Verwenden Sie eine Pinzette, um das distale Ende mit dem proximalen Ende zu halten und auszurichten, und fädeln Sie den stabilisierenden Stift weiterhin durch die distale Markhöhle, bis er das Kniegelenk mit dem in 2.6 hergestellten Weg verlässt (Abbildung 1F).
- Ziehen Sie mit der chirurgischen Klemme an der Spitze des Stiftes, um die proximalen und distalen Abschnitte nahe beieinander zu bringen, so dass sie sich kaum berühren. Richten Sie die Bruchenden bei Bedarf mit einer Pinzette neu aus und falten Sie die Enden des stabilisierenden Stifts mit der chirurgischen Klemme zur Bruchstelle (siehe Materialtabelle).
- Entfernen Sie den Kunststoff mit Drahtschneidern von der Nadelbasis. Drehen Sie mit der Klemme beide Enden des Stiftes, bis sie stumpf sind, um innere Gewebeschäden zu vermeiden.
HINWEIS: Die Bruchenden sind jetzt an Ort und Stelle verriegelt, so dass die Maus das verletzte Bein belasten kann. Der Stift wird gesichert, wenn sich die Bruchenden nicht trennen können. Ein Drahtschneider kann auch verwendet werden, um die Enden abzustumpfen. Der stabilisierende Stift muss während der gesamten Dauer der Studie an Ort und Stelle bleiben, bis die Maus eingeschläfert wird. Versuche, den Stift zu entfernen, werden wahrscheinlich die Frakturreaktion destabilisieren und dem Tier Schaden zufügen. Der Stift kann bei der Dissektion entfernt werden.
- Entfernen Sie den Kunststoff mit Drahtschneidern von der Nadelbasis. Drehen Sie mit der Klemme beide Enden des Stiftes, bis sie stumpf sind, um innere Gewebeschäden zu vermeiden.
- Verwenden Sie gerade Pinzetten, um den Muskel auf dem Oberschenkelknochen neu zu positionieren. Drücken Sie mit einer gebogenen Pinzette die Enden der Haut zusammen und schließen Sie die Öffnung mit Wundclips.
HINWEIS: Schließen Sie die Haut nicht zu fest mit den Clips, sonst vermeidet die Maus, dieses Bein zu belasten. Die Begrenzung der körperlichen Belastung während der Genesung könnte den Heilungsprozess verzögern. - Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.4 am anderen Bein und schließen Sie die Wunde, ohne die Oberschenkelfraktur durchzuführen.
HINWEIS: Dieser scheinoperierte Femur dient als kontralaterale Kontrolle. - Ziehen Sie die Isofluran-Exposition zurück, legen Sie die Maus in den beheizten Käfig und stellen Sie sicher, dass sie innerhalb von 10-15 Minuten das Bewusstsein wiedererlangt.
- Überwachen Sie die Aktivität und die Inzisionsstelle der Maus täglich für 5 Tage nach der Operation auf Anzeichen von Stress oder Infektion.
HINWEIS: Wenn das Tier Anzeichen von Schmerzen zeigt, nicht frisst und / oder zögert, auf seinen Hinterbeinen zu gehen, konsultieren Sie das Tierarztpersonal und verabreichen Sie zusätzliches Analgetikum. - Entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation.
HINWEIS: Wenn die Wunde nach 10 Tagen nicht geschlossen zu sein scheint, konsultieren Sie das Tierarztpersonal und die IACUC, bevor Sie die Clips entfernen.
3. Gewebeentnahme
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO 2-Inhalation mit anschließender Zervixdislokation.
HINWEIS: Dieses Verfahren steht im Einklang mit dem Panel on Euthanasia der American Veterinary Medical Association. - Entfernen Sie mit einer Schere und einer Pinzette die Haut von beiden Mausbeinen, verrenken Sie den Hüftkopf vom Hüftknochen und schneiden Sie den angrenzenden Muskel ab, um das Bein zu befreien.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viele Muskeln um den Oberschenkelknochen zu entfernen, da der Kallus entfernt oder beschädigt werden könnte. - Vermeiden Sie den stabilisierenden Stift, schneiden Sie durch das Kniegelenk, um den Femur von der Tibia zu trennen.
- Sezieren Sie um die distalen und proximalen Teile des Femurs, um die Enden der stabilisierenden Nadel freizulegen.
- Schneiden Sie mit einem harten Drahtschneider die gefalteten stumpfen Enden des Stiftes ab, so dass nur der gerade Teil des Stiftes übrig bleibt. Verwenden Sie eine Pinzette, um den stabilisierenden Stift langsam und sanft aus dem Oberschenkelknochen zu schieben.
HINWEIS: Wenn der Stift nicht leicht herausgleitet, wenden Sie keine Kraft an, da dies die Hornhaut lösen und die Probe beschädigen könnte. Versuchen Sie stattdessen, den Stift zu drehen und vorsichtig zu entfernen. Das Entfernen des Stiftes kann auch nach der Fixierung einfacher sein.
4. Histologie - Alcian Blue / Eosin / Orange G Färbung
HINWEIS: Die Alcian Blue / Orange G / Eosin-Färbung wird routinemäßig verwendet, um Knorpel (blau) und den Knochen (rosa) zu visualisieren. Die Knorpelfläche kann als Anteil an der gesamten Kallusfläche quantifiziert werden (Abbildung 2A,B).
- Femuren in 10% neutralem gepuffertem Formalin über Nacht bei 4 °C fixieren.
- Waschen Sie die fixierten Proben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Proben in 0,5M EDTA, pH 8,0 auf einem langsam rotierenden Shaker für 2 Wochen legen. Wechseln Sie die EDTA-Lösung jeden zweiten Tag, um eine effiziente Entkalkung zu gewährleisten.
HINWEIS: Für den Shaker ist keine bestimmte Drehzahl erforderlich. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit im Behälter fließt, um alle Proben abzudecken. Die vollständige Entkalkung kann durch Röntgen der Oberschenkelknochen getestet werden. - Um die Proben für die Paraffineinbettung zu verarbeiten, inkubieren Sie sie in den folgenden Lösungen (je 1 h): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xylol, Xylol, Paraffin, Paraffin.
- Betten Sie die Proben zum Schneiden in Paraffin ein.
- Schneiden Sie 5-7 μm dicke Längsschnitte der gebrochenen Oberschenkelknochen mit einem Mikrotom ab.
- Deparaffinisieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie in 2 Bädern Xylol (je 5 min) inkubieren.
- Rehydrieren Sie die Abschnitte durch Inkubation im folgenden Ethanolgradienten (je 2 min): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
- Legen Sie die Rutschen für 1 Minute in Leitungswasser.
- Machen Sie die Lösungen von Alcian Blau, saurem Alkohol, Ammoniumwasser und Eosin / Orange G für die Histologie, wie in der Ergänzungsdatei 1 erwähnt.
HINWEIS: Die vorgeschlagenen Volumina jeder Lösung sollten ausreichen, um die Objektträger für die Färbung vollständig zu untertauchen. - Legen Sie die Objektträger in sauren Alkohol für 30 s und inkubieren Sie in Alcian Blau für 40 min.
- Vorsichtig unter dem laufenden Wasserhahn waschen, bis das Wasser für ca. 2 min klar ist.
- Tauchen Sie die Objektträger schnell in sauren Alkohol für 1 s.
- Spülen Sie wie in Schritt 4.9 beschrieben ab.
- 15 s in Ammoniumwasser inkubieren.
- Spülen Sie wie in Schritt 4.9 beschrieben ab.
- In 95% EtOH für 1 min geben und 90 s in Eosin/Orange G inkubieren.
- Trocknen Sie die Objektträger schnell mit einem einzigen Dip in 70% EtOH, 80% EtOH und 100% EtOH.
- Legen Sie die Dias für 1 Minute in Xylol, um die Dias zu löschen.
- Tragen Sie Montagemedien und ein Deckblatt für die Bildgebung auf.
HINWEIS: Für die molekulare Analyse können RNA und Protein aus dem Kallus isoliert werden. Sezieren Sie den Muskel vorsichtig unter einem Sezierbereich und trennen Sie den Kallus mit einem Skalpell vom darunter liegenden Knochen.
5. Mikro-CT
HINWEIS: In den späteren Stadien der Heilung kann eine MikroCT durchgeführt werden, um die Mineralisierung im harten Kallus und die Frakturlücke abzubilden und zu quantifizieren. Bei C57BL/6J-Mäusen ist der Kallus in der Regel mineralisiert und nach 10 Tagen nach der Fraktur (dpf) durch MikroCT nachweisbar (Abbildung 2C).
- Femuren in 10% neutralem gepuffertem Formalin über Nacht bei 4 °C fixieren.
HINWEIS: MicroCT kann an den gleichen Femuren durchgeführt werden, die für die Histologie verwendet werden, solange sie vor der EDTA-Entkalkung durchgeführt wird (Schritt 4.3). Wenn Sie für beide Techniken dieselben Oberschenkelknochen verwenden, führen Sie eine MikroCT durch, rufen Sie die Proben ab und fahren Sie mit Schritt 4.3 fort. - Waschen Sie die fixierten Proben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und lagern Sie sie in 70% EtOH.
- Führen Sie MikroCT mit einer isotropen Voxelgröße von 7 μm bei einem Energieniveau von 55 kVP und einer Intensität von 145 μA durch (siehe Materialtabelle).
- Konturieren Sie die microCT-Scheiben, um den Kallus einzuschließen und den kortikalen Knochen auszuschließen.
HINWEIS: Da der Kallus mit der Zeit mineralisierter wird, kann der Schwellenwert angepasst werden, um das Kallusvolumen in verschiedenen Stadien zu visualisieren und zu messen. - Erhalten Sie das in den Kalluskonturen enthaltene Knochenvolumen als Maß für das Kallusvolumen.
HINWEIS: Die Bruchlücke kann direkt an den microCT-Scheiben als Abstand gemessen werden, der vom Bruch eingenommen wird.
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Representative Results
Bei C57BL/6J-Mäusen schließt eine erfolgreiche Operation die zuvor erwähnten Heilungsschritte mit wenig bis gar keiner lokalen Entzündungsreaktion oder periostalen Beteiligung am scheinoperierten kontralateralen Femur ab. Ein Hämatom wird einige Stunden nach der Operation gebildet, und das Periost wird aktiviert, um Skelettvorläufer für die Chondrogenese zu rekrutieren. Verschiedene Zellpopulationen, wie z.B. Prx1+ mesenchymale Vorläufer, können während des Reparaturprozesses mit handelsüblichen fluoreszierenden Reporter-Mausmodellen verfolgt werden (Abbildung 3). Bei 5 Tagen nach der Fraktur (dpf) kann die Alcian Blue-Färbung verwendet werden, um den weichen Kallus sichtbar zu machen und anschließend die Knorpelfläche zu quantifizieren (Abbildung 2A, B). Die Mineralisierung ist durch Mikro-CT bei 28 dpf nachweisbar (Abbildung 2C). Das Volumen des mineralisierten Kallus, der Abstand der Frakturlücke und die Knochenstärke, die durch mechanische Tests gemessen wird, werden häufig als quantifizierbare Ergebnisse der Frakturreparatur verwendet. Genetische Veränderung oder medikamentöse Intervention können den Verlauf der Genesung verändern, daher wird empfohlen, eine Zeitstudie durchzuführen, um Frakturen in verschiedenen Stadien der Reparatur zu charakterisieren. Der gesamte Kallus kann für die molekulare Analyse seziert werden und der kontralaterale Knochenschaft kann als Kontrolle verwendet werden. Wenn die Bruchenden nicht mit dem Stift ausgerichtet oder ausreichend gesichert sind, zeigen die resultierenden Bilder einen Mangel an Kallusbildung auf der gesamten oder einer Seite der Bruchstelle (Abbildung 4).
Abbildung 1: Bruch und Einsetzen des stabilisierenden Stiftes . (A) Ein Quadrat wird am rechten Bein einer C57BL/6J-Maus rasiert. (B) Nachdem ein Schnitt in Haut und Faszie gemacht wurde, wird eine gekrümmte Pinzette unter dem Femur befestigt, um den Muskel, die Haut und den Knochen zu trennen. (C) Nachdem der Schnitt vorgenommen wurde, werden zwei Frakturenden erstellt: der proximale Abschnitt des Femurs, der am Hüftknochen befestigt ist, und der distale Abschnitt, der am Knie befestigt ist. Die Führungsnadel (grün) wird in den distalen Abschnitt eingeführt und durch das Kniegelenk gedrückt. (D) Die Führungsnadel wird aus dem distalen Abschnitt entfernt, in den proximalen Abschnitt eingeführt und durch das Hüftgelenk gedrückt. (E) Der stabilisierende Stift (graue Nadel) wird in die aus dem Hüftgelenk ragende Führungsnadel eingeführt. (F) Der stabilisierende Stift wird durch den proximalen Abschnitt, in den distalen Abschnitt und durch das Kniegelenk gedrückt, wobei der Weg der Führungsnadel in C verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Histologie und MikroCT von Femurfrakturen. (A) Formalin-fixierte Paraffinabschnitte von Femurfrakturen wurden bei 5, 10 und 28 dpf gesammelt und mit Alcian Blue/Eosin/Orange G gefärbt. Skalenbalken = 500 μm. (B) Die Knorpelfläche wurde mit der ImageJ-Software bei 5, 10 und 28 dpf quantifiziert. (C) Bei 28 dpf wurde eine Mineralisierung beobachtet, und das Kallusvolumen und die Frakturlücke konnten mittels MikroCT gemessen werden. Maßstabsleiste = 1.000 μm. Daten, die als Mittelwert ± REM angezeigt werden. Das mineralisierte Kallusvolumen wurde durch Konturierung um den kortikalen Knochen an der Frakturstelle gemessen. Der dunkelgraue Bereich grenzt den mineralisierten Kallus auf dem Bild ab, während der kortikale Knochen (hellgrau) nicht in die Messung einbezogen wird. Die Daten werden als Mittelwert ± REM angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fluoreszierendes Reportermodell, das zur Visualisierung der Expansion von Prx1+ periostalen Zellen nach einer Fraktur verwendet wird. Prx1CreER; Rosa26tdTomato-Mäuse wurden fünf Tage lang täglich mit 80 mg/kg Tamoxifen Körpergewicht injiziert, um die tdTomato-Expression zu induzieren. Drei Tage nach der letzten Injektion wurde eine Femurfraktur eingeleitet, und Mäuse wurden bei 7 oder 14 dpf geopfert, um zu verfolgen, wo sich Prx1-exprimierende Zellen und ihre Nachkommen (Prx1+) innerhalb des Frakturkallus und des erweiterten Periosts befinden. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Beispiel für eine unregelmäßige Heilung aufgrund von chirurgischen Problemen. Die Bruchenden waren in diesem Beispiel nicht richtig ausgerichtet und der stabilisierende Stift durchbohrte den proximalen Abschnitt des Femurs. Diese Fehler führten zur Kallusbildung, bei der der Femur durchbohrt wurde (gelber Kasten) und nicht an der Schnittstelle. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusatzdatei 1: Zusammensetzung der für die Histologie erforderlichen Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das in diesem Protokoll beschriebene Verletzungsmodell umfasst alle vier signifikanten Schritte, die während der Heilung spontaner Frakturen beobachtet wurden, einschließlich (1) entzündungsfördernder Reaktion mit der Bildung des Hämatoms, (2) Rekrutierung von Skelettvorläufern aus dem Periost zur Bildung des weichen Kallus, (3) Mineralisierung des Kallus durch Osteoblasten und (4) Umbau des Knochens durch Osteoklasten.
Der in diesem Manuskript beschriebene chirurgische Eingriff ist für erwachsene Mäuse optimiert, die mindestens 12 Wochen alt sind. Als stabilisierender Stift wird eine Nadel mit 27 G x 1 1/4 (0,4 mm x 30 mm) verwendet, da sie in diesem Alter die ideale Größe für die Breite der Markhöhle hat. Bei Bedarf könnte das Protokoll für jüngere Tiere geändert werden, wenn ein dünnerer stabilisierender Stift verwendet wird. Der stabilisierende Stift ist ein wesentlicher Bestandteil des Erfolgs der Operation, da bekannt ist, dass Instabilität die Frakturheilung signifikant beeinflusst16. Andere Stabilisierungsmethoden wurden überprüft und alle haben ihre Vorteile und Einschränkungen17,18,19. Die ideale Stabilisierung sollte anhand der Forschungsfrage und des experimentellen Ziels ausgewählt werden. Eine Einschränkung der hier beschriebenen Stabilisierung besteht darin, dass der Stift durch die Wachstumsplatten und die Gelenke verläuft. Wenn der Beitrag des Gelenk- oder Wachstumsplattenknorpels von Belang ist, empfehlen wir, eine andere stabilisierende Methode in Betracht zu ziehen.
Die Variabilität in der Operationstechnik und zwischen den Tieren ist bei der Durchführung dieser Operation ein Problem. Daher wird empfohlen, umfangreiche Zahlen zu verwenden, insbesondere für quantitative Auslesungen, und ähnliche Arten von Frakturen gruppenübergreifend zu vergleichen. Es ist wichtig, die Femurabschnitte dicht beieinander zu befestigen, um Lücken über 2 mm zu vermeiden. Die Variabilität der Lücken zwischen den Abschnitten kann die Größe des Kallus und den Zeitpunkt der Reparatur erheblich beeinflussen. Die Abschnitte sollten auch richtig ausgerichtet sein. Lose und falsch ausgerichtete Frakturen verursachen eine größere Variabilität zwischen den Proben und können die Heilung beeinträchtigen.
Die Gewichtsbelastung ist auch entscheidend für das Timing der Knochenheilung und kann zu Variabilität zwischen Mäusen führen. Die meisten Mäuse legen einige Stunden nach der Operation nur minimales Gewicht auf das verletzte Bein, sollten aber am nächsten Tag normal gehen. Die Überprüfung, ob sich die Maus normal bewegt und die Last gleichmäßig auf beide Beine verteilt ist, ist von entscheidender Bedeutung, insbesondere wenn der kontralaterale Femur als Scheinkontrolle verwendet wird. Darüber hinaus kann die Operation eine systemische Entzündung auslösen, die das kontralaterale Bein betrifft. Es wird daher empfohlen, bei der Etablierung dieser Technik scheinoperierte Oberschenkelknochen mit nicht operierten Mäusen zu vergleichen. Nicht operierte Kontrollen könnten auch für quantifizierbare Ergebnisse wie Wirkungen auf RNA oder Proteinexpression vorzuziehen sein.
Die Konsistenz der Frakturgeometrie kann bei anderen Methoden20 eine Herausforderung darstellen, aber die Verwendung einer Säge ermöglicht dem Chirurgen mehr Kontrolle und verringert die Variabilität der nachfolgenden Frakturen. Der Sägeansatz wurde auch verwendet, um metaphysäre Frakturen der proximalen Mausfemuren erfolgreichzu erzeugen 21.
Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Mäusen in ihrer Reaktion auf die Heilung von Frakturen werden selten beobachtet. Das Geschlecht kann jedoch mit dem Alter und der Drogenintervention zu einem Faktor werden, daher wird dringend empfohlen, Tiere des gleichen Geschlechts zu vergleichen oder Statistiken durchzuführen, um Geschlechtsunterschiede zu untersuchen, bevor Proben kombiniert werden. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll für C57BL6/J-Mäuse entwickelt. Forscher, die andere Mausstämme verwenden, sollten die Heilung bei männlichen und weiblichen Mäusen vergleichen, um Geschlechtsunterschiede zu identifizieren.
Wir glauben, dass diese Femurfrakturchirurgie ein effizientes Modell ist, um die signifikanten Heilungsschritte bei Mäusen zu rekapitulieren und die Auswirkungen genetischer Veränderungen oder therapeutischer Interventionen auf die Wiederherstellung von Frakturen beim Menschen zu testen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Vicki Rosen für die finanzielle Unterstützung und Begleitung des Projekts. Wir möchten uns auch bei den Veterinär- und IACUC-Mitarbeitern der Harvard School of Medicine für die Beratung in Bezug auf die Steriltechnik, das Wohlergehen der Tiere und die Materialien, die zur Entwicklung dieses Protokolls verwendet wurden, bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
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