Coleta, Expansão e Diferenciação de Modelos Primários de Células Epiteliais Nasais Humanas para Quantificação da Frequência de Batimento de Cílios

Katelin M. Allan; Sharon L. Wong; Laura K. Fawcett; Alexander Capraro; Adam Jaffe; Cristan Herbert; Elvis Pandzic; Shafagh A. Waters

doi:10.3791/63090

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Artigo de método

Coleta, Expansão e Diferenciação de Modelos Primários de Células Epiteliais Nasais Humanas para Quantificação da Frequência de Batimento de Cílios

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DOI:

10.3791/63090

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10 de novembro de 2021

Katelin M. Allan¹^,² , Sharon L. Wong¹^,² , Laura K. Fawcett¹^,²^,³ , Alexander Capraro¹^,² , Adam Jaffe¹^,²^,³ , Cristan Herbert⁴ , Elvis Pandzic⁵ , Shafagh A. Waters¹^,²^,³

¹School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ²Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, ³Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, ⁴Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, ⁵Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a coleta, expansão e diferenciação de células epiteliais nasais para modelos de células epiteliais organotípicas das vias aéreas e quantificação da frequência de batimentos de cílios por meio de imagens de células vivas e scripts personalizados.

Resumo

Medidas da função dos cílios (frequência de batimento, padrão) foram estabelecidas como ferramentas diagnósticas para doenças respiratórias, como discinesia ciliar primária. No entanto, a aplicação mais ampla dessas técnicas é limitada pela extrema suscetibilidade da função ciliar a mudanças em fatores ambientais, por exemplo, temperatura, umidade e pH. Nas vias aéreas de pacientes com Fibrose Cística (FC), o acúmulo de muco impede o batimento dos cílios. A função dos cílios tem sido investigada em modelos celulares primários das vias aéreas como um indicador da atividade do canal CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR). No entanto, uma considerável variabilidade de paciente para paciente na frequência de batimento de cílios foi encontrada em resposta a drogas moduladoras de CFTR, mesmo para pacientes com as mesmas mutações de CFTR . Além disso, o impacto da secreção disfuncional de cloreto regulado por CFTR na função ciliar é pouco compreendido. Atualmente, não existe um protocolo abrangente que demonstre a preparação de amostras de modelos de vias aéreas in vitro , a aquisição de imagens e a análise da frequência de batimento ciliar (CBF). Condições de cultura padronizadas e aquisição de imagens realizadas em uma condição ambientalmente controlada permitiriam quantificação consistente e reprodutível do FSC entre indivíduos e em resposta a drogas moduladoras de CFTR. Este protocolo descreve a quantificação do CBF em três diferentes sistemas de modelos de células epiteliais das vias aéreas: 1) folhas epiteliais nativas, 2) modelos de interface ar-líquido fotografados em pastilhas de suporte permeáveis e 3) organoides tridimensionais embutidos em matriz extracelular. Os dois últimos replicam a fisiologia pulmonar in vivo, com batimento de cílios e produção de muco. A função ciliar é capturada usando uma câmera de vídeo de alta velocidade em uma câmara controlada pelo ambiente. Scripts personalizados são usados para a análise do CBF. A tradução das medidas do CBF para a clínica é considerada uma importante ferramenta clínica para prever a resposta a medicamentos moduladores de CFTR por paciente.

Introdução

Medidas de frequência e padrão de batimento ciliar (CBF) têm sido estabelecidas como ferramentas diagnósticas para doenças respiratórias, como a discinesia ciliar primária (PCD)¹. Na Fibrose Cística (FC), a disfunção do canal de cloreto do Regulador de Condutância Transmembrana Transmembrana da FC (CFTR) causa desidratação do líquido superficial das vias aéreas e comprometimento do clearance mucociliar². A função ciliar tem sido investigada in vitro em modelos primários de células das vias aéreas como um indicador da atividade do canal CFTR³. No entanto, existe uma considerável variabilid....