Summary
Tandfollikeln innehåller en epitelpopulation och mesenkymala celler. Epitelpopulationen valdes från den heterogena tandsäckscellpopulationen genom att tillhandahålla ett distinkt odlingsmedium. Epitelial celler överlevde och bildade kolonier i ett serumfritt medium.
Abstract
Tandsäcken (DF) skördades under avlägsnandet av en påverkad tredje molar av en muntliga maxillofacial kirurg. Epitelial cell isolering utfördes på dagen för DF skörd. DF tvättades tre gånger med DPBS och dissekerades sedan med vävnad sax tills vävnaden hade en pulpy eller squishy konsistens. Encelliga populationer pelleterades av centrifugering och tvättades med keratinocyt serum-free medium. Heterogena cellpopulationer fördelades i en kulturrätt. Keratinocyt serum-free medium användes för att välja epitelial celler. Odlingsmediet ändrades dagligen tills inga flytande skräp eller döda celler observerades. Epitelial celler uppträdde inom 7-10 dagar efter cellpopulation distribution. Epitelial celler överlevde i serum-fria medium, medan α-modifiering minimalt väsentliga medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum tillät spridning av mesenchymal-typ celler. DF är en vävnadskälla för isolering av tandepiteceller.
Syftet med denna studie var att fastställa en metod för isolering av epitelceller från mänskliga DF. Parodontala ligament (PDL) användes för isolering av mänskliga tandläkare epitelial celler. Att anskaffa epitelceller från humant PDL är inte alltid framgångsrikt på grund av den lilla vävnadsvolymen, vilket leder till lågt antal epitelceller. DF har en större volym än PDL och innehåller fler celler. DF kan vara en vävnadskälla för den primära kulturen av mänskliga tandepitetelceller. Det här protokollet är enklare och effektivare än isoleringsmetoden med PDL. Anskaffa mänskliga tandläkare epitelial celler kan underlätta ytterligare studier av tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner.
Introduction
Tandbildning börjar med invagination av det orala epitelet1. Enligt tandutvecklingsstadiet har det orala epitelet olika namn, inklusive inre och yttre emalj epitel, livmoderhalscancer slinga och Hertwigs epitelial rothylsa (HERS). Epitelial fack kommunicerar med de omgivande mesenchymala cellerna. Epitelial-mesenkymal interaktioner reglerar tandbildning och vävnad regenerering. Att anskaffa tandläkare epitelial celler, såsom muntliga keratinocyter och Hertwigs epitelial rot slidceller (HERSCs), är avgörande för studien av tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner2.
Gnagare-härledda tandepitetelceller isoleras från epitelstrukturen, såsom HERS. Li och kollegor isolerade och odödliggjorda råtta molar-härledda HERSCs efter skörd den apikala delen av de utveckla tand bakterier från 8-dagars gamla råttor3. HERS separerades från apikal vävnad under förstoring. Med tanke på tandutvecklingsstadiet och åldern är det nästan omöjligt att skörda HERS från människor på grund av etiska problem: en utvecklande tandgrodd måste avlägsnas från ett litet barn för att skörda den mänskliga HERS. Omogna tandbakterier extraheras sällan. Mänskliga tandkort epitelceller kan isoleras från tandköttet och parodontala ligament (PDL). Epitelial struktur-härledda celler deltar i tandbildning tillsammans med mesenchymala komponenter och kan vara mer lämplig för studier av tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner än muntliga keratinocyter. Epitelcellsrester av Malassez (ERM) är HERS-härledda epitelrester och finns i ett litet antal i PDL4. Studier rapporterar isolering av mänskliga HERSCs från PDL5. Att skörda mänskliga HERSCs från PDL vävnad är dock inte alltid framgångsrikt på grund av bristen på epitelpopulationen på denna plats5,6.
Även om gnagare-härledda HERSCs upprätthålls i serum-innehållande media3,7, odlas mänskliga DF-härledda epitelceller med serumfria medier som liknar andra mänskliga epitelceller, såsom normala mänskliga epidermal keratinocyter och normala mänskliga muntliga keratinocyter8,9. Detta innebär fysiologiska eller funktionella skillnader mellan gnagare tandläkare epitelial celler och mänskliga tandläkare epitelial celler. Förstå mekanismen när det gäller tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner kan bidra till utvecklingen av kliniska tillämpningar, inklusive parodontala återanslutning under återplantering, parodontala regenerering i parodontala sjukdomar, massa-dentin komplexa regenerering och bio-tand generation. Med tanke på egenskaperna hos translationell forskning, mänskliga tandläkare epitelial celler kan vara lämpligare än gnagare tandläkare epitelial celler för studier av epitelial-mesenchymal interaktioner.
Den mänskliga DF är en lös bindväv och bor ofta i en påverkad tand. DF innehåller mesenkymala prekursorer10. Såvitt vi vet har dock ingen studie rapporterat isolering av epitelceller från tandsäckar före 2021. Oh och Yi rapporterade isoleringen av epitelceller från mänsklig DF 20218. Epitelial fenotyp bekräftades av västra blotting och morfologiska analys. Analys av ursprunget till DF-härledda epitelceller visade liknande resultat med andra studier. DF-härledda epitelial celler var varken endotel eller hematopoietic5,11, och Oh och Yi föreslog att namnge dessa celler som DF-HERSCs. DF har en större volym än PDL, och fler epitelceller kan isoleras från DF. Detta ökar uppkomsten av epitelkolonier och resulterar i en hög framgångsgrad vid skörd av epitelceller från DF. Denna studie föreslår att använda DF som en vävnad källa för isolering av tandläkare epitelial celler.
I den aktuella studien isolerades enstaka celler från DF enligt tidigare beskrivna förfaranden10,12. DF innehåller heterogena cellpopulationer, och flera celltyper kan vara närvarande i det tidiga skedet av förfarandet. Morsczek och kollegor isolerade DF-härledda mesenkymala stamceller10. Vi hypotesen att DF innehåller epitelial celler och att endast epitelial celler kan överleva under serum-fria villkor. Denna studie skiljer sig från Morsczek et al. när det gäller valet av epitelpopulationen och hämningen av mesenkymala celler. Urvalet utfördes med keratinocyt serum-free media (SFM), som tillåter epitelial cell spridning och hämmar mesenchymal cell spridning. Denna studie härstammar från en rapport av Oh och Yi8. Syftet med denna studie var att beskriva detaljer om den metod som används i den rapporten för isolering av epitelceller från mänskliga DF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Institutional Review Board vid Kyung Hee University Hospital i Gangdong (IRB godkännande nr. KHNMC 2017-06-009).
1. Samla in DF
OBS: Patienterna gav informerat samtycke före operationen för avlägsnande av en mogen eller omogen påverkad tredje molar. Patienter med följande sjukdom uteslöts: diabetes, högt blodtryck, tuberkulos, hepatit, förvärvat immunbristsyndrom. Gravida kvinnor uteslöts också.
- Skörda DF under kirurgisk extraktion av påverkade tredje molarer (figur 1A).
OBS: Kirurgi utfördes av en muntliga maxillofacial kirurg. Samarbete krävs med en tandläkare för vävnadsinsamling. - Förvara DF i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med 3% penicillin-streptomycin vid 4 °C före användning. Utför isoleringsprocedurer på dagen för DF-skörd (figur 1B).
2. Isolera encellspopulationer från DF
- Förbered stamlösningar av kollagenas typ I och proteas i DPBS så att de slutliga koncentrationerna av kollagenas typ I och proteas är 1 mg/ml respektive 2,4 mg/ml.
- Förbered tre 50 ml tvättrör med 20 ml DPBS per rör. Märk rören som 1, 2 och 3.
- Tvätta DF i tvättrören sekventiellt. Håll DF med pincett och placera DF i rör 1. Ta ut DF ur rör 1 och placera den i rör 2. Ta ut DF ur rör 2 och placera den i rör 3. Skaka försiktigt DF 10-15 gånger i varje rör. Efter tvätt tre gånger, placera DF i en 60 mm odlingsfat (figur 2A).
- Hacka DF med vävnadssax (bild 2B). Överför endast en liten del till odlingsrätten för att minimera vävnadsförlusten. Upprepa styckningen tills DF har ett pulpy eller squishy utseende (bild 2C).
- Blanda 1 ml kollagenas typ I och 1 ml proteaslösning i ett koniskt rör på 15 ml för att uppnå slutliga koncentrationer på 1 mg/ml respektive 2,4 mg/ml.
- Överför den hackade DF till 15 ml koniskt rör från steg 2,5. Skaka försiktigt och inkubera röret i 1 h vid 37 °C.
- Tillsätt 5 ml 0,05 % trypsin-EDTA i röret, skaka och inkubera röret i 15 minuter vid 37 °C.
- Förbered keratinocytmedium som innehåller keratinocyt SFM 10% fetala nötkreatur serum (FBS). Tillsätt 3 ml keratinocytmedium i ett nytt koniskt rör på 50 ml. Placera en 40 μm sil ovanpå detta rör och använd en 10 ml serologisk pipett för att aspirera supernatanten från steg 2.6 och passera den genom silen.
OBS: Minimera införlivandet av smälta vävnadsrester medan du tar supernatanten. Ta bort vävnadsresterna med en sil på 40 μm för att minimera fel. Vävnadsrester kan passera genom 70 μm silar och hindra kolonibildning. FBS i keratinocytmediet kommer att inaktivera enzymerna. - Upprepa steg 2.7 och 2.8.
- Överför den insamlade suspensionen till ett koniskt rör på 15 ml.
- Centrifugera koniska röret på 15 ml vid 288 × g i 3 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten.
OBS: Var noga med att undvika oavsiktlig borttagning av pelleterade celler, som oftast är osynliga. - Tillsätt 3 ml keratinocyt SFM och tvätta cellerna två gånger med en 1 mL pipett med centrifugering enligt steg 2.11.
- Plätera encellspopulationen till en 60 mm odlingsskål med keratinocyt SFM. Håll odlingsrätten med en slutlig volym på 5 ml i en fuktad atmosfär på 5% CO2 vid 37 °C. Byt odlingsmedium dagligen tills ingen vävnad eller cellrester observeras.
OBS: Ta bort flytande skräp i odlingsmediet genom att byta medium. Fördröjd borttagning av vävnadsskräp eller döda celler har en ogynnsam effekt på primärkulturen. - Undersök plattan från steg 2.13 för att kontrollera tillväxten av epitelceller (figur 3A).
OBS: Epitelialceller växer inom 7-10 dagar efter plätering av encelliga populationer. - Expandera epitelkolonierna och subkultur cellerna.
- Aspirera mediet och tvätta botten av odlingsplattan en gång med 3 ml keratinocyt SFM.
- Tillsätt 2 ml cell dissociation proteas och inkubera i en fuktad atmosfär på 5% CO2 vid 37 °C i 3 min.
OBS: Upprepa steg 2.15.2 om cellavlossning inte är effektiv. - Tillsätt 2 ml keratinocytmedium till odlingsplattan och överför innehållet i ett koniskt rör på 15 ml.
OBS: Det krävs inte att lägga till mer keratinocytmedium om steg 2.15.2 upprepas. - Centrifugera koniska röret på 15 ml vid 288 × g i 3 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och tvätta cellpelleten två gånger med 3 ml keratinocyt SFM.
- Plätera cellerna i en 100 mm odlingsskål med keratinocyt SFM (slutlig volym på 10 ml per 100 mm skål).
- Förbered och lagra celllager i en flytande kvävetank.
- Skörda celler enligt beskrivningen i steg 2.15.1-2.15.5.
- Fördela cellerna i kryovialer i 1 ml frysmedium (80% keratinocyt SFM, 10% dimetyllsulfoxid, 10% FBS).
- Placera flaskorna i en frysbehållare och förvara dem vid -80 °C i 24 timmar.
- Överför injektionsflaskan från frysen till en flytande kvävetank.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DF-skörd
Kirurgi utfördes av en muntliga maxillofacial kirurg. Material framställda av människor, inklusive tandfragment, gingival vävnad och DF, samlades in av en kirurg (figur 1A). DF kan fästas på tandfragmentet. En oral maxillofacial kirurg kommer att kunna identifiera DF. Samarbete och kommunikation med kirurgen krävs för vävnadsuppsamling. DF är en oregelbundet formad membranliknande vävnad. Gingival vävnad har en keratiniserad yta och kan särskiljas från DF. Massa vävnad bor i massa kammaren och är sällan separeras från tänder under kirurgi. DF lagrades i DPBS med 3% penicillin-streptomycin vid 4 °C före användning (figur 1B).
Mekanisk behandling av DF
Vävnadsskräp och blod avlägsnades genom att tvätta DF med DPBS. Tre koniska rör förbereddes med tvättlösning. Efter tvätt överfördes DF till en 60 mm eller 100 mm odlingsfat (figur 2A). DF ska hackas med sax tills vävnaden har ett pulpy eller mushy utseende (figur 2B, C).
Uppkomst av epitelpopulation
Efter plätering av heterogena cellpopulationer flöt många celler och små skräp i odlingsmediet. Antalet flytande celler minskade gradvis med successiva medelstora förändringar. Fördröjd medelförändring kan orsaka en grumlig kulturmiljö. I början uppträder olika celltyper längst ner i odlingsrätten men försvinner när de underhålls i keratinocyt SFM. Celler med epitelmorfologi visas inom 7-10 dagar efter plätering av encellspopulationer (figur 3A). Antalet kullerstensformade celler varierar från 1 till 10 vid tidpunkten för uppkomsten av epitelceller, som expanderar till kolonier med tiden (figur 3B).
Malning förfarandet upprepades för att öka DF kontaktområde med 0,05% trypsin-EDTA för att främja cell dissociation. Fler enstaka celler skördades från DF massa än intakt DF. Klibbigheten i DF massa anges sannolikheten för framgång av isolering av epitelial celler. Dagliga medelstora förändringar hindrade keratinocyt SFM från att bli grumlig, vilket är viktigt för epitelial cellen överlevnad.
Figur 1: Material framställda av människor. (A) Material framställda av människor samlades in av en oral maxillofacial kirurg. Den gula pilen anger DF. Svarta pilar indikerar tandfragmentet och tandsatt mjukvävnad. (B) DF lagrades i PBS kompletterat med 3% penicillin-streptomycin vid 4 °C. Isolering förfaranden utfördes inom 24 h av insamling. Förkortningar: DF = tandsäck; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Behandling av tandsäckar. A) DF överfördes till en 60 mm odlingsskål efter tvätt med DPBS tre gånger. B) DF maldes med vävnadssax. C) Den malda DF:n hade ett pulpy eller mushy utseende. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Uppkomsten av epitelceller. (A) Celler med epitelial morfologi visas inom 7-10 dagar efter plätering encelliga populationer. B) Ex vivo-expansion av DF-härledda epitelceller genom subkultur. Skalstänger = 100 μm. Förkortning: DF = tandsäck. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet innehåller kritiska steg. Skörd encelliga populationer är avgörande för framgångsrik isolering av epitelceller från DF. Vi försökte isolera epitelceller från DF baserat på vår hypotes att det finns fler epitelial celler i DF. Malningsproceduren förbättrar lösgöring och frisättning av celler från DF. Malning förfarandet förbättrades, och malet upprepas tills DF uppträdde pulpy att underlätta frisättningen av enskilda celler. Att få det maximala antalet enstaka celler ökar sannolikheten för uppkomsten av epitelpopulationen. Kontaminering sker ofta under isolering av epitelceller från DF. Användningen av 40 μm silar minimerar införandet av vävnadsrester i encellspopulationer, eftersom vävnadsrester kan passera genom 70 μm silar och hämma epitelcellskolonisering.
Epitelial celler verkar vara mer sårbara för vissa miljöer än mesenchymala celler, och den dagliga förändringen av kulturmediet gav också en ren miljö för uppkomsten av epitelial befolkningen. Att förlora celler på grund av frekvent mediumförändring kan vara en begränsning av detta protokoll. Daglig ändring av mediet utfördes dock efter felsökning för detta protokoll, och följaktligen visades och expanderade epitelceller. Att fördröja medelförändringen kan påverka kulturerna. Eftersom cellpelleten efter centrifugeringen är nästan osynlig ökar den smala spetsen på ett koniskt rör på 15 ml hur lätt det är att avlägsna supernatant utan att förlora cellpelleten. Därför föreslår detta protokoll att överföra innehållet i 50 mL koniska röret till ett 15 mL koniskt rör.
DF ger en större volym vävnad och fler enskilda celler än PDL. Därför kan DF användas istället för PDL som en vävnadskälla för isolering av mänskliga tandepitetelceller. Urval och hämning av celltyper i DF kan göras helt enkelt genom ett selektivt odlingsmedium. SFM inducerar epitelial tillväxt, medan serum-innehållande medium väljer för mesenchymal celler. Denna metodik möjliggör enkel tillgänglighet till mänskliga tandepitetelceller. Morsczek och kollegor isolerade tidigare DF-härledda mesenkymala prekursorer. Denna studie skiljer sig från deras genom valet av epitelpopulationer och hämning av mesenkymala celler.
Den regulatoriska rollen för tandepitetelceller under tandbildning är av stort intresse för tandforskning. Studera epitelial-mesenchymal interaktioner under tand utveckling kan föreslå ledtrådar för lösning av kliniska problem13. Vävnad regenerering genom att kombinera epitelial och mesenchymala komponenter har försökt14. Dental epitelial cell-härledda faktorer, såsom en emalj matris derivat, har utvärderats som terapeutiska mål som syftar till parodontala regenerering, massa-dentin komplexa regenerering och parodontala reattachment2,15. Kombinationen av regenereringsfaktorer, inklusive stamceller, epitelial-mesenkymala cellark, cell-härledda faktorer och biomaterial, kan generera biotänder vid tandförlust eller agenes16. Tand agenesis-associerade gener, såsom PAX9, MSX1, AXIN2, EDA, EDAR och WNT10A gener, är potentiella kandidat nyckelreglerande gener för epitelial-mesenchymal interaktioner17. Vidare kan nästa generations sekvenseringsmetod-härledda data från tand agenesis-associerade studier på samma sätt föreslå förmodade nya mål gener som reglerar molekylär kontroll under tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från National Research Foundation of Korea (NRF) som finansierades av den koreanska regeringen (NRF-2017R1C1B2008406 och NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae tillhandahöll vänligt DF för primärkultur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig's epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig's epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig's epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
