Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קרן טבק כמערכת מודל חרקים למחקרים פרה-קליניים קנבינואידים

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63228
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 4
1Institute of Cannabis Research, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo, 3Department of Chemistry, Colorado State University-Pueblo, 4Chuncheon Bioindustry Foundation

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מספק מידע הדרכה לשימוש בתולעת טבק מנדוקה סקסטה במחקר קנבינואידים. השיטה המתוארת כאן כוללת את כל האספקה והפרוטוקולים הדרושים לניטור שינויים פיזיולוגיים והתנהגותיים של מודל החרקים בתגובה לטיפול בקנבידיול (CBD).

Abstract

עם תשומת לב מוגברת על קנבינואידים ברפואה, מספר אורגניזמים מודל יונקים שימשו כדי להבהיר את תפקודי התרופות הלא ידועים שלהם. עם זאת, קשיים רבים נותרו במחקר היונקים, המחייב פיתוח של אורגניזמים מודל שאינם יונקים למחקר קנבינואידים. המחברים מציעים את תולעת הטבק מנדוקה סקסטה כמערכת מודל חרקים חדשנית. פרוטוקול זה מספק מידע על הכנת הדיאטה המלאכותית עם כמויות משתנות של קנבידיול (CBD), הקמת סביבת גידול, וניטור השינויים הפיזיולוגיים וההתנהגותיים שלהם בתגובה לטיפול CBD. בקצרה, עם קבלת ביצי תולעי קרן, הביצים הורשו 1-3 ימים ב 25 °C (65 °F) על מחזור 12:12 כהה בהיר לבקוע לפני שהופץ באופן אקראי לשליטה (תזונה מלאכותית המבוססת על נבט חיטה; AD), רכב (AD + 0.1% שמן טריגליצרידים בשרשרת בינונית; שמן MCT) וקבוצות טיפול (AD + 0.1% MCT + 1 מ"מM או 2 מ"מ של CBD). ברגע שהתקשורת הוכנה, זחלי הכוכב הראשון הונחו בנפרד במבחנה של 50 מ"ל עם מקל שיפוד מעץ, ואז המבחנה כוסתה במטלית גבינה. המדידות נלקחו במרווחי זמן של יומיים לתגובות פיזיולוגיות והתנהגותיות לממשל CBD. הליך טיפוח פשוט זה מאפשר לחוקרים לבחון דגימות גדולות בניסוי נתון. בנוסף, מחזורי החיים הקצרים יחסית מאפשרים לחוקרים לחקור את ההשפעה של טיפולי קנבינואידים על פני דורות רבים של אוכלוסייה הומוגנית, ומאפשרים לנתונים לתמוך בעיצוב ניסיוני באורגניזמים מודל יונקים גבוהים יותר.

Introduction

במהלך השנים האחרונות, תשומת הלב הציבורית התמקדה קנבינואידים בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהם, כולל טיפול באפילפסיה1, מחלת פרקינסון2, טרשת נפוצה3, וצורות שונות של סרטן4,5,6 עם קנבידיול (CBD). מכיוון שקנאביס הופך לחוקי כסחורה חקלאית בחוק השיפור החקלאי של 2018, החוק הציבורי 115-334 (חוק החוות לשנת 2018), הקנאביס ונגזרותיו הקנבינואידיות בתעשיות המזון, הקוסמטיקה והתרופות גדלו באופן אקספוננציאלי. בנוסף, מבודדים קליניים של קנבינואידים בודדים ותערובות קנבינואידים נבדקו בהצלחה בנבדקים אנושיים7, קווי תאים5,8, ומערכות מודל בעלי חיים מגוונות9,10.

ניסוי קליני יהיה אידיאלי לאימות היעילות וההשפעות השליליות של קנבינואידים על מחלה ספציפית. עם זאת, ישנם אתגרים רבים בניסויים קליניים, כולל אישור אתי/ IRB, גיוס ושימור הנבדקים11. כדי להתגבר על משוכות אלה, נעשה שימוש בקווי תאים אנושיים שונים מכיוון שקווי תאים שמקורם בבני אדם הם חסכוניים, קלים לטיפול, יכולים לעקוף את הבעיות האתיות, ולספק תוצאות עקביות וניתנות לשחזור מכיוון שקווי התאים הם 'אוכלוסייה טהורה של תאים שאין להם זיהום צולב של תאים וכימיקלים אחרים'12.

Alves et al. (2021)13 נבדק CBD באופן תלוי במינון ב trophoblasts השליה, שהם תאים מיוחדים של השליה הממלאים תפקיד חיוני השתלת עובר ואינטראקציה עם הרחם האימהי החליט14. התוצאות שלהם הראו כי CBD גרם לאובדן הכדאיות התא, הפרעה בהתקדמות מחזור התא, אינדוקציה אפופטוזיס. תצפיות אלה ממחישות את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של שימוש בקנביס על ידי נשים בהריון13. כמו כן, סדרה של קווי תאים שימשו גם כדי לבחון את ההשפעות הפרמקולוגיות של CBD במחלות אנושיות, בפרט, צורות שונות של סרטן. מחקרי הפריה חוץ גופית הדגימו בהצלחה השפעות אנטי סרטניות בתאי סרטן הלבלב15, השד8 וסרטן המעי הגס16. עם זאת, בעוד להיות זמין נרחב וקל לטפל, קווי תאים ספציפיים כגון HeLa, HEK293 נוטים לשינויים גנטיים פנוטיפיים עקב שינויים בתנאי הצמיחה שלהם או טיפול17.

במחקר קנאביס, מערכות מודל בעלי חיים שונות, החל בעלי חיים קטנים כגון עכבר18, שפן ניסיונות19, ארנב19 כדי בעלי חיים גדולים כגון כלב20, חזירון21, monkey22, horse23, שימשו כדי לחקור השפעות טיפוליות לא ידועות. עכברים היו מערכת מודל בעלי החיים המועדפת ביותר לחקר קנבינואידים בשל הדמיון האנטומי, הפיזיולוגי והגנטי שלהם לבני אדם24. והכי חשוב, לעכברים יש קולטני CB1/2 במערכת העצבים שלהם, שנמצאים בבני אדם. יש להם גם מחזור חיים קצר יותר מאשר נבדקים אנושיים, עם תחזוקה קלה יותר ומשאבים גנטיים בשפע, ובכך להקל בהרבה על ניטור ההשפעות של קנבינואידים לאורך מחזור חיים שלם. מערכת היונקים נמצאת בשימוש נרחב והוכיחה בהצלחה כי CBD מקל על הפרעות פרכוסים1, הפרעת דחק פוסט טראומטית9, כיבים אוראליים25, ותסמינים דמויי דמנציה10. מודל העכבר אפשר גם מחקר אינטראקציה חברתית של אנשים בתוך קהילה אשר קשה מאוד בבעלי חיים גדולים ובני אדם26.

למרות כל היתרונות של מערכת מודל בעלי חיים, זה עדיין יקר ודורש טיפול נמרץ במהלך מתן תרופות ואיסוף נתונים. בנוסף, יש בדיקה של שימוש בעכברים במחקר בגלל חוסר הדדיות ו recapitulation לקוי של התנאים האנושיים בשל מגבלות בתכנון ניסיוני והקפדה27.

עם הביקוש הגובר למחקרים רפואיים/פרה-קליניים של קנבינואידים, יש צורך במערכת מודלים שאינם יונקים. מודלים חסרי חוליות העניקו באופן מסורתי יתרונות ייחודיים על פני מודלים בעלי חוליות. היתרונות המשמעותיים כוללים את הקלות והעלות הנמוכה של גידול דגימות רבות ומאפשר לחוקרים לעקוב אחר דורות רבים של אוכלוסיות הומוגניות גנטית28. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח את זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, להיות מערכת מודל חרקים יעיל לחקור פונקציות פרמקולוגיות של קנבינואידים מווסת התנהגויות האכלה29. בין מערכות מודל החרקים, המחברים התמקדו בתולעת הטבק, Manduca sexta, הידועה גם בשם עש ספינקס קרולינה או עש נץ, כמערכת מודל חרקים חדשנית למחקר קנבינואידים.

סקסטה מנדוקה שייכת למשפחתו של ספינגידיי. החרק הוא מזיק הצמח הנפוץ ביותר בדרום ארצות הברית, שם הם ניזונים מצמחים סולניים. למודל החרקים היסטוריה ארוכה במחקרים בפיזיולוגיה של חרקים, ביוכימיה, נוירוביולוגיה ומחקרי אינטראקציה עם סמים. תיק המחקר של מנדוקה סקסטה כולל טיוטת רצף גנום, המאפשר הבנה ברמה המולקולרית של תהליכים תאיים חיוניים30. יתרון מכריע נוסף של מערכת מודל זו הוא גודלו הגדול, להגיע יותר מ 100 מ"מ אורך ו 10 גרם במשקל ב 18-25 ימים של התפתחות זחל. הגודל הגדול מאפשר לחוקרים לעקוב בקלות אחר שינויים מורפולוגיים והתנהגותיים בזמן אמת בתגובה לטיפול CBD. כמו כן, בשל הגודל, נבדקו תגובות אלקטרופיזיולוגיות עם מערכת העצבים בבטן, כולל גרעינים שנותחו מהזחלים ללא הגדרות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. התכונה הייחודית מאפשרת לחוקרים לחקור בקלות תגובות חריפות וארוכות טווח לקנבינואידים המנוהלים.

למרות רב-תכליתיות כזו, M. sexta רק לאחרונה נחקרה על התאמתה כמודל ניסיוני למחקרי קנאביס וקנבינואידים. בשנת 2019, המחברים השתמשו לראשונה במערכת מודל החרקים כדי להתייחס להשערה כי קנאביס התפתח לייצר קנבידיול כדי להגן על עצמו מפני אוכלי עשב חרקים30,31. התוצאה הראתה בבירור כי הצמחים ניצלו CBD כגורם מרתיע האכלה ועיכבו את הצמיחה של חרק המזיקים M. sexta זחל, כמו גם גרימת תמותה מוגברת31. המחקר הדגים גם את ההשפעות המצילות של CBD לזחלי אתנול שיכורים, וזיהה את ההשפעה הפוטנציאלית של הרכב של אתנול כנשא של CBD. כפי שמוצג, מערכת מודל החרקים חקרה ביעילות את ההשפעות הטיפוליות של קנבינואידים בתוך 3-4 שבועות עם פחות עבודה ועלויות מאשר מערכות בעלי חיים אחרות. למרות מודל החרקים חסר קולטני קנבינואידים (כלומר, אין קולטני CB1/2), מערכת המודל מספקת כלי בעל ערך להבנת התפקידים הפרמקולוגיים של קנבינואידים באמצעות קולטן קנבינואידים באופן עצמאי.

מחברי המחקר הזה עבדו בעבר עם תולעת קרן הטבק כמערכת מודל למחקר קנבינואידים31. לאחר בחינה מדוקדקת של היתרונות והסיכונים של שימוש ב- M. sexta, סיפקנו שיטה המערבת טיפול נכון והכנה של דיאטה לניסויים פרה-קליניים המאפשרים הזדמנויות לשימוש עתידי במעבדה פרה-קלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תולעי קרן וטיפול בקנבידיול

  1. להשיג 150-200 M קיימא. ביצי סקסטה ודיאטות מלאכותיות המבוססות על נבט חיטה (ראו טבלת חומרים).
  2. מניחים את ביצי תולעי הקרן בצלחת פטרי פוליסטירן עם שכבת תזונה מלאכותית המבוססת על נבט חיטה (AD) ומעבירים את הביצים לתא גידול חרקים (ראה טבלת חומרים) המתוחזק ב 25 °C (60 °F) עם 40%-60% לחות יחסית.
  3. אפשר ביצי תולעי קרן טבק במשך 1-3 ימים לבקוע בתוך תא גידול החרקים נשמר ב 25 °C (60 °F) עם 40%-60% לחות יחסית.
  4. הכן קנבידיול (CBD) פתרון מלאי (200 mM) על ידי הוספת 1.26 גרם של >98% טוהר CBD לבודד ב 20 מ"ל של EtOH (200 הוכחה) או 100% שמן טריגליצרידים שרשרת בינונית (MCT) (ראה טבלת חומרים).
    הערה: בידוד CBD הוא רגיש לאור, אז טפלו בחושך.
  5. הוסף 5 מ"ל ו 10 מ"ל של פתרון מלאי CBD 200 mM ל 1,000 גרם של AD כדי להביא את הריכוזים הסופיים של דיאטות 1 מ"מ ו 2 מ"מ של CBD, בהתאמה.
    הערה: ודא את הדיאטה ואת פתרון מלאי CBD מעורבבים היטב עד תערובת הומוגנית לחלוטין נוצרת. ערבבו את AD המכיל מלאי של CBD בשקית ניילון במשך 45 דקות לפחות ביד.
    זהירות: מערבל קפה או כל מטחנת מתכת אחרת נראו לא יעילים.
  6. חלוקת 20 גרם של שלוש מדיה, שליטה (AD), רכב (AD + 0.1% של שמן EtOH או MCT), ו CBD המכיל מדיה (AD + 0.1% של שמן EtOH או MCT + 1 מ"מ /2 מ"מ של CBD) לתחתית צינור 50 מ"ל.
  7. יש לפזר באופן אקראי זחלי אינסטאר 1 (באורך של כ-2 מ"מ) בנפרד במבחנה של 50 מ"ל ולכסות במכסה מחורר או במטלית גבינה (ראו טבלת חומרים).
    הערה: מניחים את הצינור הפוך ומגדלים חרקים בתא גידול חרקים המתוחזק ב-25 °C (60 °F) עם 40%-60% לחות יחסית.
  8. לגדל אותם בתוך תא גידול חרקים (ראה שולחן של חומרים) מתוחזק ב 25 °C (65 °F) עם מחזור אור / כהה 12 שעות.

2 . M. גידול זחל סקסטה , צריכת דיאטה ומדידות תמותה

  1. מדוד את צמיחת הזחל (כלומר, גודל ומשקל) עם איזון אנליטי ותמותה במרווחי זמן של יומיים לאחר שהועבר למיכלים בודדים עד שהגור יוכר כצבע החום הכהה של שכבת exocuticle מוקשחת.
    1. רשום את המסה הראשונית (בגרמים) של כל קבוצה של זחלים לפני הצגת הזחלים לתזונה שלהם בהתאמה ולהפחית את המסה של הזחלים בכל מדידה מן המסה הראשונית כדי לקבוע רווחי מסה בין שלבי התפתחות זחלים עד הזחלים להשלים את שלב הגור.
    2. רשום את מספר הימים בין השלבים ההתפתחותיים של instar כדי להבין את ההבדלים במסגרת הזמן ההתפתחותית בין שלבי צמיחת הזחלים עד גור על כל דיאטה.
      הערה: יש לגרד את החומר הצואתי מהמכל כדי למנוע זיהום עובש. לאסוף את העניין לבדיקות עתידיות התלויות במטרות הניסוי (למשל, חישוב קצב הצטברות CBD, פרופיל מיקרוביאלי). חשוב לטפל בזהירות בחרק בתקופות שבריריות של אפוליזה או אקדיזה. כאשר מוציאים את הזחלים ממיכל, תופסים בעדינות את הגוף הראשי של החרק עם קצה שטוח ומלקחיים רחבים ואינם מכריחים להסיר את השכבה החיצונית של העור כאשר חרק נמצא בתהליך של שפיכה.
  2. למדוד את צריכת הדיאטה31 על ידי שקלול אובדן הדיאטה של המיכל בין זחלי instar 1 וגור. להקליט את הגרמים הראשוניים של דיאטה בתחילת הניסוי ולהפחית את הכמות הראשונית מכמות הדיאטה הנותרת כאשר הזחלים נכנסו לשלב הגור המלא.
    הערה: יש להוציא את החומר הצואתי ממדידת הדיאטה. החומר הצואתי ופסולת אחרת (כלומר, סככות עור) ניתן להסיר בקלות מהתקשורת על ידי הצבת המיכל הפוך.
  3. עבור מדידות ניידות, אפשר לחרק הנבדק להסתגל לסביבת החדר למשך 5 דקות לפחות ולעקוב אחר המרחקים31 ששלוש קבוצות של חרקים אינסטאר 5 (80-100 מ"מ אורך) נסעו באמצעות תא מיזוג פחד אוטומטי וממוחשב (ראה טבלת חומרים).
  4. נתח את תגובת הניידות31 באמצעות וידאו שהוקלט 60 פריימים לשנייה במשך 5 דקות באמצעות תוכנה לזיהוי תנועה (ראה טבלת חומרים) המייצרת אינדקס תנועה.

3. ניתוח סטטיסטי

  1. לנתח את ההבדלים בצמיחת הזחל (כלומר, גודל ומשקל) ואת מדד התנועה על ידי ANOVA חד כיווני עם מבחן שלאחר הבדיקה32 של Tukey.
  2. השתמש במבחן דירוג היומן (Mantel-Cox)33 להשוואות עקומת ההישרדות.
    הערה: כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מנדוקה סקסטה כמערכת מודל לבחינת רעילות קנבינואידים
איור 1 מתאר את המרכיבים העיקריים בניסוי CBD באמצעות תולעת הטבק מנדוקה סקסטה. מספר גדול של חרקים (>20) גודלו בנפרד ב 25 °C (50 °F) על 12 שעות: 12 שעות = אור: מחזור כהה. גודל החרקים, משקלם ותמותתם נמדדו במרווחי זמן של יומיים כדי לעקוב אחר תגובות לטווח קצר וארוך לאחר טיפול CBD במינון גבוה (2 מ"מ).

איור 2 מראה את ההשפעות השליליות של CBD על הצמיחה וההתפתחות של החרק. החרקים שגדלו בתזונה מלאכותית (AD) הראו את ביצועי הצמיחה הטובים ביותר. בקרת הרכב שהשתמשה 0.1% שמן טריגליצרידים בשרשרת בינונית (MCT) כסוכן המסה עבור בידוד CBD הראתה גם צמיחה נורמלית ללא כל השפעות מזיקות. עם זאת, מינון גבוה של CBD (2 מ"מ) גרם לירידה במשקל (איור 2C) והוביל לשיעור תמותה גבוה יותר מזה של קבוצות בקרה וכלי רכב (איור 2D).

ביום 24, הגודל הממוצע של הזחלים המוזנים על AD היה 63.9 מ"מ (n = 20-22). עם זאת, גודל הזחלים שגדלו על AD המכיל 2 מ"מ של CBD היה 50.7 מ"מ, שהיה קטן בכ-21% מהזחלים שגדלו ב-AD (קו אדום באיור 2C)31. ביום 24, המשקל הממוצע של זחל גדל על AD היה 6.5 גרם, אשר היה 2.2 פי 2 גדול יותר מאשר אלה של זחלים גדל על AD עם 2 מ"מ של CBD (n = 12-16, p < 0.00001)31. ראוי לציין כי המינון הגבוה של CBD (2 מ"מ) העלה באופן משמעותי את שיעור התמותה עד 40%, בעוד שקבוצות הבקרה והרכב הראו רק שיעור תמותה של 20% (איור 2D)31. התוצאות הצביעו על כך שהמינון הגבוה של CBD (2 מ"מ) בתזונה מזיק להתפתחות החרקים ומתאם לתמותה מוגברת.

מנדוקה סקסטה כמערכת מודל לחקור פונקציות טיפוליות לא ידועות של קנבינואידים
איור 2 הראה שמערכת מודל החרקים מנטרת ביעילות כל השפעה מזיקה של CBD על ידי ניטור השינויים המורפולוגיים והפיזיולוגיים שלהם. התוצאה הראשונית הצביעה על כך >1% אתנול (EtOH) קשורה באופן שלילי לצמיחה שלהם, ניידות, צריכת דיאטה, ושיעור הישרדות. כדי לבחון אם CBD משפר את הניידות של החרקים ואת התנהגות האכלה בזחלי M. sexta שיכורים EtOH, הכמות הכוללת של דיאטה הנצרכת על ידי חרקים ואת המרחק שהם נסעו במשך 10 דקות נמדדו חרקים גדלו תחת שלושה תנאי האכלה (AD, AD + 1% EtOH, ו AD + 1% EtOH + 1 mM CBD). איור 3A מראה כי M. זחלי סקסטה גדלו על AD המכיל 1 מ"מ של CBD נצרך לפחות 3.1 פעמים יותר מסת דיאטה מאשר אלה שגדלו על דיאטה הוסיף EtOH31. עם זאת, צריכת הדיאטה של החרקים גדל על 2 מ"מ של מדיה הוסיף CBD לא היה שונה באופן משמעותי מאלה של זחלים גדל על דיאטות EtOH בלבד (p > 0.05)31.

ניידות זחל היה גם במעקב כדי לבחון אם CBD השפיע על הניידות שלהם כאשר שיכור עם EtOH. מדד הסלולר מוצג כאחוז (%) מההקפאה. איור 3B משווה את המדד הנייד של M. זחלי סקסטה גדלו בתנאים שונים. התוצאות מראות כי 1% זחלים שטופלו EtOH לא השפיעו על הניידות (p > 0.05). ממשל CBD 1 מ"מ גם לא השפיע על הניידות (p > 0.05)31. 2% טיפולים EtOH התברר להיות קטלני לזחלי M. sexta ; לכן, לא נרשם מדד ניידות. עם תוספת של המינון הגבוה של CBD (2 מ"מ) לתוך AD המכיל 2% EtOH, הניידות נשארה נמוכה (80% הקפאה)31.

Figure 1
איור 1: התהליך המסכם של שימוש זחלי קרן מנדוקה סקסטה של תולעי טבק במחקר קנבידיול. (A) ביצי תולעי קרן בקעו במיכל גדול נפרד עם שכבה של תזונה מלאכותית. (ב) מזרק שימש למילוי המיכל כדי למנוע מכל דיאטה להידבק לצדי המיכלים. (ג) תולעת קרן טבק שנייה במבחנה של 50 מ"ל עם מטלית גבינה. (D) תולעת קרן טבק אינסטאר שלישית. (ה) אורך תולעת הקרן (מ"מ) ומשקל (ז) נמדדו בסולם. (ו) תולעת קרן הטבק החמישית של אינסטאר שעוברת אקדיזה ומוכנה לגור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ההשפעות של קנבידיול (CBD) על הצמיחה והתמותה של תולעת קרן הטבק מנדוקה סקסטה. (A) זחלי תולעי קרן טבק במקום החמישי, השלישי אינסטאר וגור מוקדם. הגודל (B), המשקל (C) והתמותה (D) של M. סקסטה כאשר ניזונים מתזונה מלאכותית (AD), AD + 0.1% של טריגליצרידים בעלי שרשרת בינונית (MCT), ו- AD + 0.1% של MCT + 2 מ"מ של CBD. עבור ניתוחים סטטיסטיים על צמיחת חרקים ושיעור הישרדות, ANOVA חד כיווני עם מבחן השוואות מרובות של Tukey (n = 20-22, p < 0.05) ובדיקת Mantel-Cox (n = 20-22, p < 0.05) שימשו, בהתאמה. הדמות מותאמת מתוך Reference31. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ההשפעות של קנבידיול (CBD) על התנהגות וניידות האכלת חרקים. (A) צריכת דיאטה של זחלי תולעי קרן טבק שגדלה בתזונה מלאכותית (AD), AD + 1-2% מהאתנול (EtOH) ו- AD + 1-2% מ- EtOH + 1-2mM של CBD (ANOVA חד כיווני, ההשוואה המרובה של טוקי ב - p < 0.05). (ב) ניידות חרקים. הניידות מתוארת כהקפאה %. מציין p < 0.01. הדמות מותאמת מתוך Reference31. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר ההאכלה הראה כי מינונים גבוהים של CBD (2 מ"מ) עיכבו את צמיחת החרק והגדילו את התמותה31. מודל החרקים הראה גם רגישות לאתנול; עם זאת, CBD למעשה detoxicated רעילות האתנול, הגדלת שיעור ההישרדות שלהם, צריכת דיאטה, והתנהגויות חיפוש מזון לרמות דומות לקבוצת הביקורת (איור 3A,B)31. מערכת מודל החרקים המתוארת מורכבת משלושה שלבים קריטיים: (1) הבטחת הביצים של M. sexta בקעו באופן אחיד בגודל ובתזמון, (2) הכנת מדיית הצמיחה הממוזגת באופן הומוגני עם קנבינואידים לריכוז ממוקד, ו-(3) שמירה על מדיית הצמיחה כך שתהיה נקייה מזיהום פטרייתי תוך שמירה על רמת לחות אידיאלית בשיעור של 40%-60%. מערכת מודל החרקים אפשרה לנו להתייחס לשאלת המחקר בתוך 25 יום, מהכנה לתקשורת ועד איסוף נתונים ופרשנות. והכי חשוב, מערכת החרקים הניבה תוצאות עקביות מדגימות גדולות.

כדי להבטיח את ההצלחה של זחלי M. sexta מעובדים, שמירה על הלחות היחסית ב 40%-60% בתוך המיכל הוא חיוני. אם מיכל לא מצליח להחזיק את הלחות הגבוהה, דיאטה מלאכותית המכילה את הקנבינואידים תתייבש במהירות, מה שיגרום להפסקת ניסוי מוקדם עקב מותם של החרקים. עם זאת, במערכת סגורה, הלחות הגבוהה מספקת תנאי אידיאלי להתפרצות הפטרייתית, שקשה למגר אותה. המחברים מציעים להשתמש במכסה מחורר או במטלית גבינה כדי לספק זרימת אוויר מספקת תוך מזעור אובדן המים מהתקשורת. בסביבה טבעית, הזחלים מעדיפים לאכול בצד האבקסיאלי של עלה שבו הלחות גבוהה יותר תוך הצגת פחות טריכומים מאשר שטח הפנים של העלה34. לכן, הצבת מיכל הפוך היה מועיל במיוחד תוך מתן אזור מקלט או מקל עץ זוחל. זה גם עוזר להסיר חומר צואתי מאזור המדיה ומקל על איסוף הפסולת לבדיקות נוספות.

כמו קולטני קנבינואידים נעדרים invertabrates35, תולעת הטבק M. sexta לא יכול להיות מתאים למחקרים טיפוליים בתיווך המערכת האנדוקנבינואידית. עם זאת, עם היתרונות הרבים שהוכחו במחקר הפיילוט שלנו, החרק צריך להיחשב מערכת מודל חדשה לחקור את הפונקציות הפרמקולוגיות של קנבינואידים, במיוחד מחקרים מעורבים פרמקוקינטיקה שאינם מתווכים קולטן CB. מחזור החיים הקצר יחסית של M. sexta מאפשר לחוקרים להבין את ההשפעות של דיאטה המכילה קנבינואידים על פני דורות רבים, ומאפשר עיצוב ניסיוני באורגניזמים מודל יונקים גבוהים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי המכון לחקר הקנאביס באוניברסיטת קולורדו סטייט-פואבלו ומשרד המדע וה- ICT (2021-DD-UP-0379), ועיר צ'ונצ'און (קנבוס מו"פ ותיעוש, 2020-2021).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytic balance Mettler Instrument Corp. AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%) Lilu's Garden
Cheesecloth VWR INTERNATIONAL 470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes VWR 89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof Sigma-Aldrich EX0276-1
Fear conditioning chamber Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber Darwin Chambers INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil Walmart
Motion detection software (Actimetrics) Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) VWR INTERNATIONAL 688161
Tobacco hormworm artificial diet Carolina Biological Supply Company Item # 143908 Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs Carolina Biological Supply Company Item # 143880 Unit of 30-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
  2. Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
  3. Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
  4. Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
  5. Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
  6. Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
  7. Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
  8. de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
  9. Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
  10. Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
  11. Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
  14. Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
  15. Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
  16. Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
  17. Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
  18. Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
  19. Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
  20. Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
  21. Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
  22. Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
  23. Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
  24. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  25. Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
  26. Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
  27. Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
  28. Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
  29. He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
  30. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  31. Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
  32. Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  33. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  34. Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
  35. McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).

Tags

ביולוגיה גיליון 178 קנאביס קנאביס סאטיבה קנבינואידים תולעי טבק סקסטאקה
קרן טבק כמערכת מודל חרקים למחקרים פרה-קליניים קנבינואידים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, S. H., Koch, S., Richardson,… More

Park, S. H., Koch, S., Richardson, K., Pauli, C., Han, J. H., Kwon, T. H. Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies. J. Vis. Exp. (178), e63228, doi:10.3791/63228 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter