Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Hücresel metabolizma, hücrelerin enerji ürettiği süreçtir ve kanser de dahil olmak üzere birçok hastalık anormal metabolizma ile karakterizedir. İndirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD(P)H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotid (FAD) metabolik reaksiyonların koenzimleridir. NAD (P) H ve FAD otofloresan sergiler ve uyarma ve emisyon dalga boyları ile spektral olarak izole edilebilir. Her iki koenzim, NAD (P) H ve FAD, her biri ayrı bir floresan ömrüne sahip olan serbest veya proteine bağlı bir konfigürasyonda bulunabilir - floroforun uyarılmış durumda kaldığı süre. Floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM), hücresel metabolizmanın etiketsiz analizi için NAD (P) H ve FAD'nin floresan yoğunluğunun ve ömürlerinin ölçülmesini sağlar. Floresan yoğunluğu ve ömür boyu mikroskoplar, uygun uyarma ve emisyon dalga boyları seçilerek NAD(P)H ve FAD'yi görüntülemek için optimize edilebilir. Siyanür ile metabolik pertürbasyonlar, hücrelerdeki metabolik değişiklikleri tespit etmek için otofloresan görüntüleme protokollerini doğrular. Bu makalede, hücresel metabolizmayı ölçmek için NAD (P) H ve FAD'nin otofloresan görüntüleme tekniği gösterilecektir.
Giriş
Metabolizma, enerji üretmenin hücresel sürecidir. Hücresel metabolizma, glikoliz, oksidatif fosforilasyon ve glutaminoliz dahil olmak üzere birçok yolu kapsar. Sağlıklı hücreler, bağışıklık hücreleri tarafından sitokinlerin üretimi gibi çoğalma ve işlev için enerji üretmek için bu metabolik yolları kullanır. Metabolik bozukluklar, kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere birçok hastalık, değişmiş hücresel metabolizma ile karakterizedir1. Örneğin, bazı kanser hücresi tipleri, nükleik asitlerin, proteinlerin ve lipitlerin sentezi için moleküller üretmek üzere oksijen varlığında bile glikoliz oranlarını yükseltmiştir2,3....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Görüntüleme için hücre kaplaması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Epitelyal meme kanseri hücre hattı MCF-7, DMEM'de fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenerek kültüre alındı. Floresan görüntüleme için, hücreler görüntülemeden 48 saat önce 35 mm cam tabanlı görüntüleme kabı başına 4 × 105 hücre yoğunluğunda tohumlandı. Hücreler, yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak siyanür tedavisinden önce ve sonra görüntülendi. Siyanür deneyinin amacı, NAD (P) H ve FAD floresansının spektral izolasyonunu doğrulamak ve hücrelerdeki metabolik değişiklikle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Otofloresan yoğunluğu ve ömür boyu görüntüleme, hücrelerdeki metabolizmayı değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır21,55. FLIM yüksek çözünürlüktedir ve bu nedenle kanser çalışmaları için önemli olan tek hücreleri çözer, çünkü hücresel heterojenlik tümör saldırganlığına ve ilaç direncine katkıda bulunur7,39,41,44,45,46,58.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Finansman kaynakları arasında Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT RP200668) ve Texas A & M Üniversitesi bulunmaktadır. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-deoksi-d-glukoz (2-DG) | Sigma | AC111980000; AC111980010; AC111980050; | |
| Antibiyotik Antimikrobiyal (pen-strep) | Gibco | 15240096 | |
| Hücre Örnekleri | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu | N/A | MCF-7 kanser hattı |
| CellProfiler | Broad Institute | N/A | Görüntü analiz yazılımı |
| Konik Boru | VWR | 89039-664 | 15 mL konik tüp |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Kültür ortamı |
| FAD dikroik ayna | Semrock | FF495-Di03-25x36 | 495 nm |
| FAD emisyon filtresi | Semrock | FF01-550/88-25 | 550/88 nm |
| FAD uyarma filtresi | Semrock | FF01-458/64-25 | 458/64 nm |
| FBS | ThermoFisher | 16000036 | |
| Floresan Ömür Boyu Mikroskop | 3i | Yok | |
| Cam alt çanak | MatTek Corp | P35G-1.0-14-C | |
| Çoklu Foton Lazer | Tutarlı | N/A | 2P Tutarlı Lazer, Ayarlanabilir 680 nm-1080 nm |
| NAD(P)H dikroik ayna | Semrock | FF409-Di03-25x36 | 409 nm |
| NAD(P)H emisyon filtresi | Semrock | FF02-447/60-25 | 447/60 nm |
| NAD(P)H uyarma filtresi | Semrock | FF01-357/44-25 | 357/44 nm |
| PBS | ThermoFisher | 70011044 | |
| Potasyum Siyanür | Sigma-Aldrich | 380970 | |
| SlideBooks 6 | 3i N | /A | Görüntü elde etme yazılımı |
| SPCImage | Becker & Hickl GmbH | N/A | Floresan ömür boyu analiz yazılımı |
| Aşama Üst İnkübatör | okoLab | N/A | |
| Tripsin | Biosciences | 786-262 | |
| Üre | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| YG boncuk | Polysciences | 19096-2 | Yg mikroküreler (20.0 ve mikro; m) |
Kaynaklar
- Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
- Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using en....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
