Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.
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Artículo de método
Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos
En este artículo
Resumen
Resumen
La mayor parte de la energía de la célula se obtiene a través de la degradación de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por diferentes vías que convergen en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que se regula en respuesta a las demandas celulares. La molécula lipídica Coenzima Q (CoQ) es esencial en este proceso mediante la transferencia de electrones al complejo III en la cadena de transporte de electrones (ETC) a través de ciclos constantes de oxidación/reducción. El estado de las mitocondrias y, en última instancia, la salud celular se pueden evaluar midiendo el consumo de oxígeno ETC utilizando ensayos respirométricos. Estos estudios se realizan típicamente en líneas celulares establecidas o primarias que se han cultivado durante varios días. En ambos casos, los parámetros respiratorios obtenidos pueden haberse desviado de las condiciones fisiológicas normales en cualquier órgano o tejido dado.
Además, las características intrínsecas de las fibras individuales cultivadas aisladas del músculo esquelético impiden este tipo de análisis. Este artículo presenta un protocolo actualizado y detallado para el análisis de la respiración en mitocondrias recién aisladas del músculo esquelético de ratón. También proporcionamos soluciones a posibles problemas que podrían surgir en cualquier etapa del proceso. El método aquí presentado podría aplicarse para comparar las tasas de consumo de oxígeno en diversos modelos de ratones transgénicos y estudiar la respuesta mitocondrial a los tratamientos farmacológicos u otros factores como el envejecimiento o el sexo. Este es un método factible para responder a preguntas cruciales sobre el metabolismo y la regulación de la bioenergética mitocondrial.
Introducción
Las mitocondrias son los principales orgánulos metabólicos de la célula1. Estos orgánulos especializados encerrados en membrana utilizan moléculas de nutrientes para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este proceso se basa en la transferencia de electrones de moléculas donantes en una serie de reacciones redox en el ETC2. La CoQ es el único lípido redox-activo que se produce endógenamente en todas las membranas celulares y lipoproteínas circulantes que muestra función antioxidante3. Es un componente esencial de la ETC, transfiriendo electrones del complejo I depe....
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Protocolo
El alojamiento del ratón y la recolección de tejidos se realizaron utilizando protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, España; protocolos 24/04/2018/056 y 12/03/2021/033) de acuerdo con el Real Decreto 53/2013, la Directiva Europea 2010/63/UE y otras directrices relevantes.
1. Preparación de existencias, tampones y reactivos para los ensayos de respiración
- Prepare las siguientes soluciones de stock, que se pueden almacenar a la temperatura indicada durante meses. Use H2O ultrapuro en todos los casos.
- Disuelva las tabletas de solución salina tampona....
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Resultados
El protocolo aquí presentado permite el análisis in vivo de la respiración mitocondrial a través del aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón. En la Figura 1 se muestra un esquema del método. Después de diseccionar los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores (Figura 2), los tejidos se homogeneizan y las mitocondrias se purifican, en condiciones isotónicas, a través de centrifugaciones en serie. La pureza de las diferent.......
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Discusión
Todos los métodos utilizados para estudiar la respiración mitocondrial tienen sus limitaciones; por lo tanto, es crucial seleccionar el método que mejor se adapte a una pregunta experimental específica. Este trabajo proporciona un protocolo actualizado y detallado para aislar las mitocondrias del músculo esquelético del ratón para realizar diferentes ensayos respiratorios para investigar la función mitocondrial. De hecho, el estudio de la bioenergética mitocondrial en mitocondrias aisladas utilizando tecnologías basadas .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Queremos agradecer a Juan J. Tena por el uso del homogeneizador y a las instalaciones de Proteómica y Ganadería de CABD por el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte de España a través de la beca FPU16/03264 a J.D.H.C., la Association Française contre les Myopathies (AFM) a través de la beca #22450 a C.V.-G., una Beca Institucional MDM-2016-0687 (Unidad de Excelencia Maria de Maeztu, Departamento de Regulación Génica y Morfogénesis en CABD) y BFU2017-83150-P a J.J.C. La Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, el Programa de Financiación FEDER de la Unión Europea, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acciones de ADP | Sigma | A5285 | a -20 ° Tecnología |
| de señalización celular | anticuerpos C AKT | C67E7 | Conejo (especie huésped) |
| anti-Cabra HRP | Sigma | 401504 Conejo (especie huésped) | |
| anti-ratón Señalización celular HRP | #7076 | Caballo (especie huésped) | |
| Antimicina A | Sigma | A8674 | Stock a -20 ° C |
| anti-Conejo HRP | Señalización | #7074 | Cabra (especie huésped) |
| Ácido ascórbico | Sigma | A5960 | Stock en RT |
| Anticuerpo de bactina | Sigma | MBS4-48085 | Cabra (especie huésped) |
| Kit de ensayo de proteínas Bio-Rad II | Bio-Rad | 5000002 | Incluye 5 veces el reactivo Bradford y BSA de concentración conocida para la curva estándar |
| BSA, fracción V, Caldo de 126575 Calbiochem sin ácidos grasos | a 4 & grados; C | ||
| C tubo | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tapa morada |
| Anticuerpo de calnexina | ThermoFisher | MA3-027 | Ratón (especie huésped) |
| D-manitol | Sigma | M4125 | Stock en RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock en 4 & deg; C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Culata en RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Culata en -20 ° C |
| gentleMACS Disociador | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogeneizador |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock en RT |
| Anticuerpo HSP70 | Proteintech | 10995-1-AP | Conejo (Especie huésped) |
| Anticuerpo LDH-A | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Cabra (Especie huésped) |
| Cloruro de magnesio | ChemCruz | sc-255260A | Stock en RT |
| Ácido málico | Sigma | P1645 | Stock en RT |
| Espectrofotómetro de microplacas | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock en RT |
| Milli-Q water | Millipore system F7HA17757A | Agua ultrapura | |
| anticuerpo mtTFA | Santa Cruz Biotechnology SC23588 | Cabra (Especie huésped) | |
| Na+/K+-ATPasa y alfa; 1 anticuerpo | Novus Biologicals | NB300-14755 | Ratón (Especie huésped) |
| Oligomicina | Sigma | O4876 | Stock a -20 ° C |
| Palmitoyl-L-carnitina | Sigma | P1645 | Stock a -20 ° C |
| PBS comprimidos | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock en RT |
| Fosfato de dihidrógeno potásico | ChemCruz | sc-203211 | Stock en RT |
| Hidróxido de potasio | Sigma | 60377 | Stock en RT |
| Ácido pirúvico | Sigma | 107360 | Stock en 4 & deg; C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock a -20 ° C |
| Caballito de mar XF24 analizador de flujo mitocondrial | Agilent Technologies | 420179 | modelo XFe24 |
| Caballito de mar XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | El kit incluye cartuchos, microplacas y solución calibrante |
| Succinato | Sigma | S7626 | Stock en RT |
| Sacarosa | Sigma | S9378 | Stock en |
| RT TIMM23 anticuerpo | Abcam | ab230253 | Conejo (Especie huésped) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock a -20 ° C |
| TOMM20 anticuerpo | Abcam | ab56783 | Ratón (Especie huésped) |
| Anticuerpo VDAC | Abcam | ab15895 | Conejo (Especie huésped) |
Referencias
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M.....
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Reimpresiones y permisos
