Summary
Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.
Abstract
La mayor parte de la energía de la célula se obtiene a través de la degradación de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por diferentes vías que convergen en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que se regula en respuesta a las demandas celulares. La molécula lipídica Coenzima Q (CoQ) es esencial en este proceso mediante la transferencia de electrones al complejo III en la cadena de transporte de electrones (ETC) a través de ciclos constantes de oxidación/reducción. El estado de las mitocondrias y, en última instancia, la salud celular se pueden evaluar midiendo el consumo de oxígeno ETC utilizando ensayos respirométricos. Estos estudios se realizan típicamente en líneas celulares establecidas o primarias que se han cultivado durante varios días. En ambos casos, los parámetros respiratorios obtenidos pueden haberse desviado de las condiciones fisiológicas normales en cualquier órgano o tejido dado.
Además, las características intrínsecas de las fibras individuales cultivadas aisladas del músculo esquelético impiden este tipo de análisis. Este artículo presenta un protocolo actualizado y detallado para el análisis de la respiración en mitocondrias recién aisladas del músculo esquelético de ratón. También proporcionamos soluciones a posibles problemas que podrían surgir en cualquier etapa del proceso. El método aquí presentado podría aplicarse para comparar las tasas de consumo de oxígeno en diversos modelos de ratones transgénicos y estudiar la respuesta mitocondrial a los tratamientos farmacológicos u otros factores como el envejecimiento o el sexo. Este es un método factible para responder a preguntas cruciales sobre el metabolismo y la regulación de la bioenergética mitocondrial.
Introduction
Las mitocondrias son los principales orgánulos metabólicos de la célula1. Estos orgánulos especializados encerrados en membrana utilizan moléculas de nutrientes para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este proceso se basa en la transferencia de electrones de moléculas donantes en una serie de reacciones redox en el ETC2. La CoQ es el único lípido redox-activo que se produce endógenamente en todas las membranas celulares y lipoproteínas circulantes que muestra función antioxidante3. Es un componente esencial de la ETC, transfiriendo electrones del complejo I dependiente de NADH y del complejo II dependiente de FADH2 al complejo III, aunque muchas otras reductasas pueden impulsar la reducción de la CoQ mitocondrial a ubiquinol como paso obligatorio en múltiples vías metabólicas celulares4,5.
A lo largo del proceso, se crea un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna mitocondrial, que se transforma en energía biológicamente activa por el complejo ATP sintasa V2. En consecuencia, la disfunción mitocondrial conduce a una miríada de condiciones patológicas que afectan principalmente a los tejidos con altos requerimientos de energía: el cerebro, el corazón y el músculo esquelético6,7. Por lo tanto, es fundamental desarrollar métodos para analizar con precisión la bioenergética mitocondrial para investigar su papel en la salud y la enfermedad, particularmente en tejidos altamente energéticos como los músculos esqueléticos.
El electrodo de oxígeno tipo Clark se ha utilizado clásicamente en el estudio de la respiración mitocondrial8. Sin embargo, este sistema ha sido desplazado progresivamente por tecnologías de mayor resolución, siendo especialmente populares las tecnologías de consumo de oxígeno basadas en microplacas como los analizadores Agilent Seahorse XF9. En el campo del músculo esquelético, estos estudios se realizan típicamente en células cultivadas, principalmente en la línea celular de mioblastos de ratón inmortalizada C2C12 o cultivos primarios derivados de células satélite10,11. Sin embargo, estos estudios no recapitulan completamente la situación in vivo, especialmente cuando se investiga la biología mitocondrial y la función a nivel tisular sobre insultos específicos, intervenciones no genéticas o manipulaciones genéticas.
Además, los ensayos de respiración en las células son más complejos debido a factores adicionales, incluida la demanda extramitocondrial de ATP y sustratos de ensayo o eventos de señalización, que podrían inducir a error la interpretación de los resultados. Alternativamente, también es posible usar miofibras individuales o haces de miofibras recién aisladas de los músculos. Sin embargo, el método de aislamiento es técnicamente desafiante y solo factible para unos pocos tipos de músculo. En este caso, los músculos flexor digitorum brevis (FDB) y extensor digitorum longus (EDL) se utilizan principalmente10,12,13, aunque algunos informes describen el uso de otros tipos de músculos también14,15.
También se ha reportado perfil bioenergético de secciones del músculo esquelético16. La principal ventaja de este método es que se pueden estudiar los músculos intactos (los autores muestran que cortar a través de las fibras no altera los resultados en comparación con las miofibras aisladas). Sin embargo, el acceso mitocondrial a sustratos e inhibidores de ensayos es limitado y, por lo tanto, solo se pueden medir unos pocos parámetros16. Finalmente, las mitocondrias aisladas también pueden ser empleadas9,17,18,19. En este caso, las mitocondrias pierden su entorno citosólico, lo que podría afectar su función. Por el contrario, este método garantiza el acceso a sustratos e inhibidores, permite el análisis de una gran cantidad de tipos de muestras y, por lo general, requiere menos material.
Este artículo describe un método para realizar el perfil bioenergético de mitocondrias aisladas del músculo esquelético de ratón utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas (Figura 1). En particular, se detallan tres protocolos: el Ensayo de Acoplamiento, CA para evaluar el grado de acoplamiento entre el ETC y la maquinaria OXPHOS; el ensayo de flujo de electrones, EFA para medir la actividad de los complejos ETC individuales; y el ensayo BOX para determinar la capacidad de β-oxidación mitocondrial. En particular, solo se requieren pequeñas cantidades de muestras en comparación con los métodos de respirometría convencionales. El protocolo de aislamiento utilizado aquí ha sido modificado a partir del método publicado en otra parte18.
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Protocol
El alojamiento del ratón y la recolección de tejidos se realizaron utilizando protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, España; protocolos 24/04/2018/056 y 12/03/2021/033) de acuerdo con el Real Decreto 53/2013, la Directiva Europea 2010/63/UE y otras directrices relevantes.
1. Preparación de existencias, tampones y reactivos para los ensayos de respiración
- Prepare las siguientes soluciones de stock, que se pueden almacenar a la temperatura indicada durante meses. Use H2O ultrapuro en todos los casos.
- Disuelva las tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en H2O (1 tableta por 200 ml de H2O) para preparar 1x PBS. Autoclave la solución y guárdela a temperatura ambiente (RT).
- Disolver 2 g de gránulos de NaOH en 50 mL de H2O para preparar 1 M de NaOH.
- Prepare existencias de 0,1 M, 1 M, 5 M y 10 M KOH para la calibración del pH.
- Agregue 14.612 g de EDTA a 70 ml de H2O. Agregue gránulos de NaOH hasta que el pH alcance 8.0 para que el EDTA se disuelva por completo. Agregue H2O quantum satis (QS) a 100 ml. Autoclave la solución resultante de EDTA de 0,5 M (pH 8) y guárdela en RT.
- Agregue 19 g de EGTA a 70 ml de H2O. Agregue gránulos de NaOH hasta que el pH alcance 8.0 para permitir que el EGTA se disuelva por completo. Agregue H2O QS a 100 ml. Autoclave la solución resultante de EGTA (pH 8) de 0,5 M y guárdela en RT.
- Agregue 2 ml de 0,5 m de EDTA a 98 ml de PBS. Almacene la solución EDTA/PBS de 10 mM resultante en RT.
- Disuelva 5.958 g de HEPES en 40 mL H2O. Ajuste el pH a 7.2 con KOH y QS a 50 mL con H2O. Filtre el búfer HEPES resultante de 0.5 M a través de una malla de 0.45 μm y guárdelo en RT.
- Disuelva 3.402 g de KH2PO4 en hasta 50 mL de H2O. Filtre la solución KH2PO4 de 0.5 M resultante a través de una malla de 0.45 μm y guárdela en RT.
- Disolver 9.521 g de MgCl2 anhidro en hasta 100 mL de H2O. Autoclave la solución resultante de 1 M MgCl2 y guárdela en RT.
NOTA: Como se trata de una reacción exotérmica, proceda con precaución y disuelva el MgCl2 en hielo.
- Preparar soluciones madre de sustrato e inhibidores (ver Tabla 1). Alícuota y guárdalos a -20 °C. Evite los ciclos de congelación-descongelación. Como excepción, siempre prepare ácido pirúvico inmediatamente antes de su uso.
- Preparar en H2O ultrapuro: 0.5 M de succinato, 0.5 M de ácido pirúvico, 0.5 M de ácido málico, 100 mM de ADP, 1 M de ácido ascórbico y 50 mM de N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenileno-diamina (TMPD) (proteger de la luz).
- Preparar en 100% dimetilsulfóxido (DMSO): 50 mM palmitoil-L-carnitina, 4 mM de rotenona, 20 mM de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), 4 mM de oligomicina y 5 mM de antimicina A.
NOTA: No exceda la concentración final de DMSO del 0,1% en los pozos de microplacas. Por lo tanto, prepare soluciones de stock altamente concentradas para mantenerse por debajo de este límite.
- Prepare los tampones para el aislamiento de mitocondrias y la cuantificación de proteínas recién el día del experimento. Use H2O ultrapuro en todos los casos y mantenga todos los tampones en hielo a menos que se indique lo contrario.
NOTA: Para ahorrar tiempo, todos los reactivos se pueden pesar y mantener en los recipientes apropiados (por ejemplo, tubos de 15 ml) a la temperatura adecuada el día anterior.- Para preparar 10% de ácidos grasos libres (FFA) BSA, disuelva completamente 150 mg de FFA BSA en 1.5 ml de H2O por inversión / rueda giratoria. No vórtice para evitar la formación de espuma.
- Para preparar 1x reactivo Bradford, diluya la solución de stock comercial 5x con H2O y manténgala en la oscuridad en RT.
- Para preparar 8x Mitochondria Buffer (MB), disuelva 4.112 g de sacarosa y 763 mg de HEPES en 15 mL de H2O. Ajuste el pH a 7.2, agregue 1.6 mL de 10% FFA BSA y QS a 20 mL con H2O.
- Para preparar 20 ml de tampón de aislamiento 1 (IB1) (4 ml utilizados por muestra), disuelva 400 μL de 0,5 M de EDTA, 784 mg de D-manitol y 2,5 ml de 8x MB en 15 ml de H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS con H2O.
- Para preparar 5 ml de isolation buffer 2 (IB2) (500 μL utilizados por muestra), disuelva 30 μL de 0,5 M de EGTA, 196 mg de D-manitol y 625 μL de 8x MB en 4 mL de H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS con H2O.
- Para preparar 5 ml de tampón de resuspensión (RB) (200 μL utilizados por muestra), disuelva 120 mg de sacarosa, 191,3 mg de D-manitol, 50 μL de 0,5 M HEPES y 10 μL de 0,5 M de EGTA en 4 ml de H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS con H2O.
- Para preparar 2x Solución de Ensayo Mitocondrial-1 (MAS-1), disolver 1.199 g de sacarosa, 2.8 g de manitol, 1 mL de 0.5 M KH2PO4, 250 μL de 1 M MgCl2, 200 μL de 0.5 M HEPES y 100 μL de 0.5 M EGTA en 20 mL de H2O. Ajuste el pH a 7.2 y QS a 25 mL con H2O. Mantener en hielo por períodos cortos. Durante períodos más largos, manténgalo a 4 ° C para evitar precipitaciones.
- Para preparar 1x medio de ensayo de acoplamiento (CAM), prepare dos tampones diferentes basados en MAS-1: 1) CAM + BSA para el ensayo de CA propiamente dicho, y 2) CAM-BSA para preparar los inhibidores del ensayo. Mantenga siempre la proporción piruvato:malato en 10:1.
NOTA: Como BSA puede obstruir los puertos de inyección, diluya los inhibidores en CAM libre de BSA.- Para preparar CAM+BSA, diluya 300 μL de ácido pirúvico 0,5 M, 30 μL de ácido málico 0,5 M y 7,5 ml de 2x MAS-1 en 6 mL de H2O. Ajuste el pH a 7,2. Añadir 300 μL de FFA BSA y QS al 10% a 15 mL con H2O.
- Para preparar CAM-BSA, diluya 120 μL de ácido pirúvico 0.5 M, 12 μL de ácido málico 0.5 M y 3 mL de 2x MAS-1 en 2 mL de H2O. Ajuste el pH a 7.2 y QS a 6 mL con H2O.
- Para preparar 1x medio de ensayo de flujo de electrones (EFAM), prepare búferes EFAM que contengan BSA y que no contengan BSA.
- Para preparar EFAM+BSA, diluya 300 μL de ácido pirúvico 0,5 M, 60 μL de ácido málico 0,5 M, 3 μL de 20 mM FCCP y 7,5 mL de 2x MAS-1 en 6 mL de H2O. Ajuste el pH a 7,2. Añadir 300 μL de FFA BSA y QS al 10% a 15 mL con H2O.
- Para preparar EFAM-BSA, diluya 120 μL de ácido pirúvico 0,5 M, 24 μL de ácido málico 0,5 M, 1,2 μL de 20 mM FCCP y 3 mL de 2x MAS-1 en 2 mL de H2O. Ajuste el pH a 7,2 y QS a 6 mL con H2O.
- Para preparar 1x medio de β oxidación (BOXM), prepare soluciones BOXM que contengan BSA y no contengan BSA.
- Para preparar BOXM+BSA, diluya 12 μL de 50 mM de palmitoil-L-carnitina, 30 μL de ácido málico 0,5 M y 7,5 mL de 2x MAS-1 en 7 mL de H2O. Ajuste el pH a 7,2. Añadir 300 μL de FFA BSA y QS al 10% a 15 mL con H2O.
- Para preparar BOXM-BSA, diluya 4.8 μL de 50 mM de palmitoil-L-carnitina, 12 μL de ácido málico 0.5 M y 3 mL de 2x MAS-1 en 2 mL de H2O. Ajuste el pH a 7.2 y QS a 6 mL con H2O.
2. Disección muscular, homogeneización y aislamiento mitocondrial
- Coloque todos los materiales y amortiguadores sobre hielo. Asegúrese de que todos los materiales estén helados durante todo el procedimiento para proteger las mitocondrias del daño.
- Coloque tres vasos de precipitados de 50 ml por muestra en hielo y agregue las siguientes soluciones: 10 ml de PBS en el vaso de precipitados 1, 10 ml de 10 mM de EDTA/PBS en el vaso de precipitados 2 y 4 ml de IB1 en el vaso de precipitados 3.
- Eutanasiar al ratón por luxación cervical. Evite la eutanasia de CO2 , ya que los músculos esqueléticos podrían volverse hipóxicos, lo que interfiere con los análisis de respiración.
- Rocíe la extremidad posterior derecha con etanol al 70% para evitar que la piel se desprenda, y tape la extremidad a la tabla de disección de corcho. Pegue con cinta adhesiva la extremidad anterior izquierda también.
- Haga una incisión con un bisturí desechable estéril a través de la piel desde la rodilla hasta los pies.
- Agarre la piel con pinzas dentadas a la altura del tobillo y córtela con tijeras finas alrededor del tobillo.
- Alivie la piel de la musculatura subyacente con pinzas de punta fina en una mano mientras la levanta con pinzas dentadas en la otra mano.
- Diseccionar todos los músculos esqueléticos desde el tobillo hasta la rodilla (Figura 2).
- Retire todo el tejido conectivo sobre el músculo tibial anterior (TA) para facilitar la extracción muscular con pinzas finas y tijeras.
- Encuentre los cuatro tendones distales del músculo EDL y seccionarlos cerca de sus inserciones en los dedos de los pies. Localiza el tendón distal TA y córtalo cerca de su inserción, siempre por debajo del tobillo.
- Tire con cuidado de los tendones TA y EDL por encima del tobillo para liberar los cabos sueltos.
- Agarre los extremos sueltos de los tendones y alivie los músculos del resto de la musculatura y los huesos tirando de ellos hacia arriba. Use pinzas finas o tijeras para facilitar el proceso. Proceda con cuidado para evitar la contracción de miofibra.
- Cortar el tendón proximal de la EDL y el músculo TA lo más cerca posible de la rótula.
- Gire el ratón boca abajo para proceder con la extracción del músculo gastrocnemio (GA) y sóleo.
- Agarre el bolsillo formado entre el bíceps femoral y el GA con pinzas dentadas. Use tijeras finas para separar estos músculos y visualizar el tendón GA proximal.
- Agarre el tendón de Aquiles con fórceps finos y córtelo cuidadosamente con tijeras finas. Libere los músculos GA y sóleo del hueso subyacente tirando de ellos hacia arriba a través de sus tendones. Cortar el tendón GA proximal liberándolo junto con el sóleo subyacente.
- Diseccione cuidadosamente los músculos restantes de tendón a tendón siguiendo el mismo procedimiento hasta que solo queden huesos.
- Vuelva a fijar el ratón en la posición inicial para diseccionar el músculo cuádriceps.
- Deseche el tejido adiposo sobre los cuádriceps en el lado proximal usando pinzas dentadas y tijeras finas.
- Inserte pinzas finas entre los cuádriceps y el fémur y muévalos en ambas direcciones a lo largo del eje del fémur para separar el músculo del hueso.
- Agarre los tendones musculares distales del cuádriceps con pinzas dentadas y corte el tendón con tijeras finas lo más cerca posible de la rótula.
- Tire del cuádriceps hacia arriba y suéltelo en la inserción proximal con tijeras finas.
- Repita los pasos 4-8 de esta sección con la extremidad posterior izquierda.
- Enjuague todos los músculos en Beaker 1 primero y luego en Beaker 2.
- Transfiera todos los músculos a Beaker 3 y pice finamente todos los músculos con tijeras afiladas en hielo.
- Transfiera la suspensión a un tubo C (tapa púrpura), manteniéndola siempre en hielo.
- Cierre firmemente el tubo C y colóquelo boca abajo en la manga del homogeneizador. Asegúrese de que el material de la muestra esté en el área del rotador/estator. Seleccione el programa de 1 minuto llamado m_mito_tissue_01.
- Divida el homogeneizado en dos tubos de microcentrífuga preclasificados de 2 ml y centrífuga a 700 × g durante 10 min a 4 °C en una centrífuga de mesa.
- Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos preenrollados de 2 ml, evitando cuidadosamente la grasa y el tejido no homogeneizado. Almacene los gránulos a -80 °C para la determinación de la pureza de la fragmentación (fracción N) (Figura 3).
- Centrifugar los sobrenadantes a 10.500 × g durante 10 min a 4 °C.
- Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos preenrollados de 2 ml y etiquételos como Sobrenadante número 1 (SN1). Guárdelos a -80 °C para determinar la pureza de la fragmentación (Figura 3).
- Resuspendir y combinar ambos pellets en un volumen total de 500 μL de IB2 en hielo.
- Centrifugadora a 10.500 × g durante 10 min a 4°C.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo prehilado de 2 ml y etiquételo como Sobrenadante número 2 (SN2). Guárdelo a -80 °C para la determinación de la pureza de la fragmentación (Figura 3).
- Resuspend el pellet mitocondrial final en 200 μL de RB. Reserve rápidamente 10 μL para la cuantificación de proteínas e inmediatamente agregue 10 μL de FFA BSA al 10% a la suspensión mitocondrial restante para evitar daños.
- Determinar la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.
- Para la curva estándar, prepare 30 μL de diluciones en serie de concentración conocida de una proteína en tampón RB. Por ejemplo, use 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.0625 mg/ml y 0 mg/ml de BSA.
- Preparar diluciones seriadas 1:3 y 1:6 de las muestras mitocondriales en tampón RB.
- En una placa de fondo plano de 96 pocillos, primero cargue 2,5 μL de muestra/estándar por pozo. A continuación, agregue 10 μL de 1 M de NaOH a cada muestra y, finalmente, 200 μL de 1x reactivo bradford. Mezclar bien, evitando burbujas de aire. Compruebe visualmente que el color de las muestras está dentro de la línea de calibración. Realizar siempre el análisis por triplicado.
- Incubar las placas durante 5 min a RT en la oscuridad y leer la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
- Calcule la curva estándar trazando los valores de absorbancia (eje y) frente a la concentración de proteína correspondiente de las diluciones preparadas en el paso 22.1 de esta sección (eje x).
- Calcular la cantidad total de proteína en las muestras mitocondriales por extrapolación con la curva estándar.
3. Preparación de los ensayos respirométricos basados en microplacas
- Hidratar el sensor de ensayo respirométrico al menos 12 h antes del experimento con 1 ml de tampón de calibración por pozo. Incubar a 37 °C (sin CO2).
NOTA: Los sensores hidratados se pueden utilizar hasta 72 h. El cartucho debe manipularse con cuidado durante este paso: si algo toca los sensores, la sensibilidad de medición podría verse afectada. - Prechill la centrífuga preparativa con el rotor de microplaca de cucharón oscilante y los adaptadores de microplaca correspondientes a 4 °C.
- Encienda la computadora, abra el software de análisis y seleccione el protocolo deseado.
NOTA: Se escucha un clic cuando el software se conecta al instrumento de medición del consumo de oxígeno. El sensor de calentamiento debe estar verde y a 37 °C antes de que comience el experimento. - Preparar las soluciones inhibidoras a partir de las cepas indicadas en la sección 1, paso 2 según el ensayo a realizar. Prepare suficiente volumen para cada solución. Véanse la Tabla 1 y la Tabla 2 para referencia.
- Agregue el volumen apropiado de cada inhibidor en cada puerto, inserte el cartucho en el instrumento de medición del consumo de oxígeno e inicie la calibración.
NOTA: La adición del inhibidor al cartucho y la inserción del cartucho en el instrumento tarda entre 15 y 20 minutos. Asegúrese de que se introducen los componentes correctos del cartucho. La tapa del cartucho y el refuerzo hidráulico podrían desecharse mientras se necesitan el cartucho del sensor y el lugar de utilidad. - Centrifugar la suspensión mitocondrial concentrada de la sección 2, paso 21 a 10.500 × g durante 10 min a 4 °C.
- Resuspender el pellet mitocondrial en 100 μL de 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA, o 1x BOXM+BSA, dependiendo del protocolo a realizar.
- Diluir aún más la muestra mitocondrial concentrada a una concentración final de 0,2 μg/μL en el medio de ensayo correspondiente.
- Sembrar 50 μL de la suspensión (total 10 μg de proteína) por pocillo en una microplaca precultada de 24 pocillos sobre hielo. No agregue mitocondrias en los pozos de corrección de fondo; sólo agregue el medio de ensayo correspondiente. Almacene la suspensión mitocondrial restante a -80 °C para la determinación de la pureza de la fragmentación (Figura 3).
- Girar la microplaca en la centrífuga preparativa prechilled a 2.000 × g durante 20 min a 4 °C. Contrapeso para equilibrar en consecuencia.
- Caliente el medio de ensayo restante a 37 °C durante la centrifugación de microplacas.
- Después de la centrifugación, deje la microplaca en el banco durante 5 minutos para equilibrar. Añadir 450 μL de medio de ensayo caliente para un volumen final de 500 μL por pocillo en RT. Haga esto lenta y cuidadosamente, agregando el medio a la pared de los pozos para evitar desprenderse de las mitocondrias.
- Coloque la microplaca inmediatamente en el instrumento de medición del consumo de oxígeno sin la tapa e inicie el protocolo (Tabla 3). Asegúrese de que el primer paso sea una incubación de 10 minutos para permitir que la microplaca se caliente.
- Una vez finalizado el experimento, retire el cartucho y la microplaca, apague el instrumento y comience el análisis.
4. Análisis de los resultados
- En el caso de los ensayos CA y BOX, realice los siguientes análisis:
- Registrar el consumo de O2 no mitocondrial, que corresponde a la media de los valores obtenidos tras la inyección de Antimicina A y rotenona.
NOTA: La antimicina A y la rotenona son inhibidores del complejo III e I, respectivamente. - Calcular la respiración basal restando el consumo de O2 no mitocondrial de los valores basales (puntos de medición 1 y 2).
- Reste el consumo de O2 no mitocondrial de los valores posteriores a la inyección del sustrato complejo V ADP (inyección A) para determinar el estado mitocondrial III.
- Reste el consumo de O2 no mitocondrial de los valores de respiración después de la inyección del inhibidor del complejo V oligomicina (inyección B) para obtener el estado mitocondrial IVo.
- Calcular el estado mitocondrial IIIu deduciendo el consumo de O2 no mitocondrial de la respiración después de la inyección de FCCP (inyección C).
NOTA: FCCP es un potente desacoplador de fosforilación oxidativa mitocondrial. La síntesis de ATP se omite en su presencia, y el ETC alcanza la máxima actividad. - Reste los valores de respiración basal de los valores de IIIu del estado mitocondrial para obtener la capacidad excedentaria mitocondrial, que es la capacidad de generar ATP adicional en caso de aumento de la demanda de energía.
- Dividir el estado mitocondrial IIIu por valores de IVo de estado para obtener la Relación de Control Respiratorio (RCR).
NOTA: Los valores negativos o nulos de RCR indican que el acoplamiento mitocondrial está afectado.
- Registrar el consumo de O2 no mitocondrial, que corresponde a la media de los valores obtenidos tras la inyección de Antimicina A y rotenona.
- En referencia a la EPT, realice los siguientes cálculos:
- Obtener actividad residual calculando el valor medio después de la inyección de rotenona y antimicina A (inyecciones A y C).
- Calcular la actividad del complejo I al IV (CI-CIV) restando la actividad residual de los valores basales (puntos de medición 1 y 2).
- Reste la actividad residual de los valores posteriores a la inyección del sustrato CII succinato (inyección B) para obtener la actividad CII-CIII-CIV.
- Calcular la actividad CIV deduciendo la actividad residual de los valores obtenidos tras la inyección de los agentes reductores del citocromo c, ácido ascórbico y TMPD (inyección D).
- Representar todos los resultados utilizando gráficos de barras, como en la Figura 4, para extraer las conclusiones apropiadas.
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Representative Results
El protocolo aquí presentado permite el análisis in vivo de la respiración mitocondrial a través del aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón. En la Figura 1 se muestra un esquema del método. Después de diseccionar los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores (Figura 2), los tejidos se homogeneizan y las mitocondrias se purifican, en condiciones isotónicas, a través de centrifugaciones en serie. La pureza de las diferentes fracciones obtenidas durante el proceso de aislamiento puede ser analizada por western blot utilizando anticuerpos contra diferentes marcadores de orgánulos. La Figura 3A muestra el perfil general de proteínas de las diferentes fracciones que muestran distintas poblaciones de proteínas en las fracciones aisladas.
La Figura 3B muestra que todo el contenido mitocondrial está en la fracción mitocondrial, como lo demuestran las fuertes señales para los marcadores de las membranas mitocondriales externas (VDAC y TOMM20) e internas (TIMM23), e incluso para las proteínas asociadas a nucleoides (MTTFA). Todos los núcleos y citoesqueleto (β-actina) están presentes en la Fracción N, que representa núcleos y material no interrumpido (Figura 3C). Además, la mayoría del retículo endoplásmico (RE) (Calnexin), membrana plasmática (Na+/K+-ATPasaα1) o marcadores de citoplasma (LDHA, HSP70 o AKT) permanecen en las fracciones SN1 o SN2, destacando la alta pureza obtenida durante el aislamiento (Figura 3C). Sin embargo, hay algunos rastros de contaminación por ER en la fracción mitocondrial, posiblemente debido a la proximidad de estos orgánulos. Dados los resultados obtenidos en ensayos respiratorios posteriores, el procedimiento de aislamiento descrito aquí produce preparaciones mitocondriales altamente puras y viables.
Tanto los ensayos CA como los BOX permiten el cálculo de diferentes estados mitocondriales en presencia de varios sustratos que estimulan vías metabólicas específicas. Específicamente, estos ensayos se realizan en presencia de ácido pirúvico o cloruro de palmitoil-L-carnitina. El ácido pirúvico es un sustrato del ciclo de Krebs; El ácido málico es un intermediario del ciclo de Krebs y un inductor de NADH, mientras que la palmitoil-L-carnitina es un sustrato de la vía de β oxidación de ácidos grasos. (Figura 4A,B). En ambos ensayos, el primer estado que se puede medir es la tasa de respiración basal, que representa la respiración mitocondrial en presencia de los sustratos inicialmente agregados al medio de ensayo. Luego, se logra el Estado III mitocondrial, que representa la producción de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico, mostrando la respiración máxima en un estado acoplado. Por lo tanto, hay un aumento en el consumo de oxígeno después de la adición de ADP, como se observa en la Figura 4A, B.
Además, el estado IVo indica la fuga de protones asociada con la inhibición de la ATP sintasa por oligomicina, lo que conduce a una disminución de la respiración, como se observa en los gráficos CA y BOX (Figura 4A, B). La adición de FCCP conduce al Estado IIIu, que muestra la capacidad respiratoria máxima que las mitocondrias pueden mostrar en un estado desacoplado cuando el consumo de oxígeno alcanza su nivel más alto en estos ensayos. Para calcular todos estos estados, es fundamental primero determinar la respiración no mitocondrial, que se obtiene al final del ensayo cuando se inyectan antimicina A y rotenona para inhibir la respiración oxidativa. Como se muestra en la Figura 4A, B, estos valores deben estar siempre por debajo de la respiración basal y muy cerca de cero en el caso de ensayos con mitocondrias aisladas como estos ensayos descritos aquí. Finalmente, se debe calcular el parámetro RCR para evaluar la integridad mitocondrial. Refleja si las mitocondrias pueden reaccionar al ADP produciendo ATP a una tasa alta con una baja fuga de protones. Los valores medios de RCR encontrados en los ensayos CA y BOX fueron de 5,78 ± 1,03 y 3,47 ± 0,42 (Figura 4A,B), respectivamente, que están de acuerdo con los RCR óptimos informados anteriormente21,22,23,24.
Además, la EFA examina la actividad de los complejos etc individualmente o en combinación mediante la inyección de sustratos e inhibidores específicos (Figura 4C). La actividad CI-CIV representa la respiración mitocondrial basada en sustratos de piruvato y malato cuando no se inhiben complejos; en este caso, la mayoría de los electrones pasan por IC. Como la rotenona es un inhibidor específico de la IC, la IC se bloquea después de su adición, lo que resulta en una disminución del consumo de oxígeno (Figura 4C). La actividad de CII-CIII-CIV muestra respiración cuando solo se bloquea el IC y se activa el CII: el succinato, inyectado a través del puerto B, es un sustrato específico del complejo II (succinato deshidrogenasa). Así, la CII se reduce, iniciando el flujo de electrones de la CII a la CIV, mientras que la IC sigue siendo inhibida por la inyección previa de rotenona, produciendo un aumento en el consumo de oxígeno (Figura 4C). La adición de antimicina A inhibe el CIII, bloqueando el flujo de electrones a través del ETC y reduciendo el consumo de oxígeno. Además, la actividad CIV se determina cuando es estimulada por la oxidación del citocromo C después de ser reducida por la adición de ácido ascórbico / TMPD; La Figura 4C muestra que la activación de CIV produce un aumento en el consumo de oxígeno. Finalmente, la actividad residual se refiere al consumo de oxígeno cuando la cadena de fosforilación oxidativa se inactiva después de la adición de rotenona y antimicina A. Este valor establece los antecedentes para el cálculo de la actividad de los complejos como se indica en los pasos del protocolo 2.2-2.4 en la sección 4.
Figura 1: Visualización esquemática del método. Abreviaturas: OCR = tasa de consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; OL = oligomicina; FCCP = cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona; AntA = Antimicina A; Podredumbre = rotenona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección y aislamiento de los músculos esqueléticos murinos de las extremidades posteriores para análisis de respiración mitocondrial. (A) La extremidad posterior derecha se estiró e inmovilizó con cinta adhesiva. (B) Se realizó una incisión a través de la piel desde el lado del tobillo, deteniéndose proximal a la rodilla. El tejido conectivo que recubre la AT se extrajo cuidadosamente. Los tendones EDL (C) y TA (D) se seccionaron cerca de sus inserciones. El tendón TA se levantó para aliviar el músculo lejos de la musculatura subyacente y el hueso. Luego, la AT se cortó proximalmente, cerca de la cresta ventral a la tibia. Del mismo modo, el músculo EDL se alivió y el tendón proximal se cortó meticulosamente en el lado de la rodilla. (F) Extremidad posterior derecha después de la disección de TA y EDL. (G) En la extremidad posterior posterior, el tendón de Aquiles se seccionó para diseccionar los músculos GA y sóleo. (H) GA y sóleo fueron cuidadosamente liberados del hueso tibial. (I) Los músculos restantes se recolectaron desde el tobillo hasta la rodilla hasta que solo quedaron el peroné y los huesos tibiales. (J) Extremidad posterior después de la disección. (K) Se diseccionó el cuádriceps. (L) Todos los músculos esqueléticos recolectados para el aislamiento mitocondrial posterior. El proceso se realizó para ambas extremidades posteriores. Abreviaturas: TA = tibial anterior; EDL = extensor digitorum longus; GA = gastrocnemio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pureza del proceso de fragmentación. (A) Perfil proteico general teñido con azul de Coomassie. (B) Perfil de pureza de proteínas mitocondriales. (C) Marcadores no mitocondriales. Las diferentes fracciones obtenidas durante el aislamiento de las mitocondrias fueron cargadas e incubadas con anticuerpos contra diferentes proteínas en fracciones subcelulares específicas. Abreviaturas: fracción N = tejido y núcleos no homogeneizados; SN1 = sobrenadante número 1: citoplasma + orgánulos; SN2 = sobrenadante número 2: citoplasma + orgánulos; VDAC = canal aniónico dependiente del voltaje; TOMM20 = translocasa de la membrana mitocondrial externa 20; mtTFA = factor de transcripción mitocondrial A; TIMM23 = translocasa de la membrana mitocondrial interna 23; LDHA = lactato deshidrogenasa A; HSP70 = proteína de choque térmico 70; ER = retículo endoplásmico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos. Perfil bioenergético de mitocondrias aisladas de los músculos de las extremidades posteriores de un ratón macho salvaje de 13 meses de edad tipo C57BL / 6N. Los puntos de inyección de los diferentes sustratos e inhibidores están indicados en cada ensayo. El rendimiento de la maquinaria ETC y OXPHOS se puede analizar utilizando piruvato y malato, o palmitoil-L-carnitina y malato como sustratos en el ensayo de acoplamiento (A) o β-oxidación de los ensayos DE FA (B), respectivamente. (C) El ensayo de flujo de electrones permite el estudio de complejos mitocondriales individuales en presencia de piruvato, malato y FCCP; Se colocaron 10 μg de mitocondrias por pozo. Los resultados se muestran siguiendo la opción de representación de punto medio para visualizar los resultados de forma agregada. Esto contrasta con la opción punto a punto, que permitiría la visualización de las 9 mediciones consecutivas que generalmente se realizan durante cada paso de medición. El tipo de visualización se puede cambiar después de completar el ensayo en las opciones del gráfico de líneas cinéticas en el software de análisis. Abreviaturas: FA = ácidos grasos; OCR = tasa de consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; FCCP = cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona; RCR = relación de control respiratorio; EFA = Ensayo de flujo de electrones; BOX = β-oxidación de FA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ensayo de acoplamiento | ||||||
| Puerto | Inhibidor | [Stock] | [Puerto de inyección] | [Final] | Receta | |
| Inhib | CAM-BSA | |||||
| Un | ADP | 100 metros | 50 metros | 5 mM | 650 μL | 650 μL |
| B | Oligomicina | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 metros | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimicina A // Rotenona | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13,52 μL // 21,12 μL | 1655,36 μL |
| Ensayo de flujo de electrones | ||||||
| Puerto | Inhibidor | [Stock] | [Puerto de inyección] | [Final] | Receta | |
| Inhib | EFAM-BSA | |||||
| Un | Rotenona | 4 mM | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Succinato | 500 metros | 100 metros | 10 mM | 286 μL | 1144 μL |
| C | Antimicina A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Ascorbato // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| ensayo de β oxidación | ||||||
| Puerto | Inhibidor | [Stock] | [Puerto de inyección] | [Final] | Receta | |
| Inhib | CAJA-BSA | |||||
| Un | ADP | 100 metros | 40 mM | 4 mM | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomicina | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 metros | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimicina A // Rotenona | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μL |
Tabla 1: Preparación de soluciones inhibidoras para los diferentes ensayos. La columna [Stock] muestra las concentraciones de las soluciones stock del compuesto indicadas en la columna Inhibidor . [Puerto de inyección] se refiere a la concentración de las soluciones inhibidoras a cargar en los diferentes puertos del cartucho, mientras que la columna [Final] indica la concentración final de los inhibidores en los pocillos. Finalmente, las columnas Receta especifican los volúmenes de soluciones inhibidoras de stock y medios libres de BSA que deben mezclarse para preparar las soluciones que se cargarán en los puertos de inyección. Abreviaturas: ADP = difosfato de adenosina; FCCP = cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona; TMPD = N,N,N′,N′-tetrametil-para-fenileno-diamina; Inhib = inhibidor; BSA = albúmina sérica bovina; CAM-BSA = medio de ensayo de acoplamiento libre de BSA; EFAM-BSA = medio de ensayo de flujo de electrones libre de BSA; BOX-BSA = β-oxidación libre de BSA del medio de ensayo de ácidos grasos.
| Puerto | Volumen inyectado | Stock preparado (26 pozos) |
| Un | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
Tabla 2: Cálculo de los volúmenes de inyección.
| Acción | Tiempo (minutos) | Repetición | Puerto |
| Calibrar | 15-20 | ||
| Esperar | 10 | ||
| Mezclar + Esperar | 1 + 3 | × 2 | |
| Mezclar | 1 | ||
| Medir + Mezclar | 3 + 1 | × 2 | |
| Inyectar | Un | ||
| Mezclar | 1 | ||
| Medir | 3 | ||
| Mezclar | 1 | ||
| Inyectar | B | ||
| Mezclar | 1 | ||
| Medir | 3 | ||
| Mezclar | 1 | ||
| Inyectar | C | ||
| Mezclar | 1 | ||
| Medir | 3 | ||
| Mezclar | 1 | ||
| Inyectar | D | ||
| Mezclar + Medir | 1 + 3 | × 2 |
Tabla 3: Configuración del protocolo para los diferentes ensayos.
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Discussion
Todos los métodos utilizados para estudiar la respiración mitocondrial tienen sus limitaciones; por lo tanto, es crucial seleccionar el método que mejor se adapte a una pregunta experimental específica. Este trabajo proporciona un protocolo actualizado y detallado para aislar las mitocondrias del músculo esquelético del ratón para realizar diferentes ensayos respiratorios para investigar la función mitocondrial. De hecho, el estudio de la bioenergética mitocondrial en mitocondrias aisladas utilizando tecnologías basadas en microplacas es valioso para estudiar la respiración específica del tejido en términos de reproducibilidad, confiabilidad y complejidad. Además, el uso de mitocondrias aisladas confiere control sobre la disponibilidad de sustrato, facilitando la comprensión de los procesos biológicos subyacentes. Otro aspecto positivo del uso de mitocondrias aisladas es que es posible estudiar el Estado III porque el ATP generado después de la inyección de ADP no se convierte nuevamente en nuevo ADP ya que la mayoría de las ATPasas transmembrana se pierden. Además, en los ensayos aquí descritos, se añade oligomicina para bloquear la posible síntesis inespecífica de ATP20.
Es necesario destacar varias consideraciones importantes para este protocolo. En primer lugar, las mitocondrias aisladas son extremadamente sensibles y deben manejarse con cuidado. El alto contenido de sacarosa y manitol en los tampones utilizados asegura las condiciones osmóticas óptimas para proteger las mitocondrias aisladas del daño. Sin embargo, la duración del ensayo debe mantenerse al mínimo para preservar la viabilidad mitocondrial y evitar el desprendimiento de la microplaca una vez sembrada. Por lo tanto, dado que los pasos del protocolo, como la preparación de medios de ensayo y soluciones de sustrato e inhibidores, o la carga de los inhibidores en el cartucho de ensayo respirométrico, consumen mucho tiempo, cada paso debe estar perfectamente coordinado. Además, a diferencia de otros métodos basados en la digestión enzimática21,24 y la homogeneización de morteros y morteros17,19,21,23,24, el método aquí descrito se basa en el uso de un homogeneizador automatizado, lo que permite una homogeneización de muestras rápida y eficiente. Es importante destacar que las suspensiones mitocondriales son menos sensibles si están altamente concentradas. Por lo tanto, solo prepare las diluciones inmediatamente antes de usarlas. Finalmente, es esencial trabajar rápidamente durante el ensayo respirométrico propiamente dicho. Por lo general, al analizar células en cultivo en estos ensayos, se realizan tres pasos de medición consecutivos después de la inyección de sustratos o inhibidores, lo que resulta en protocolos que se extienden entre 40 y 50 min., Para garantizar la viabilidad de las mitocondrias aisladas a lo largo de todo el procedimiento, el número de pasos de medición a menudo se mantiene al mínimo debido a su vulnerabilidad19, 23,25, reduciendo el tiempo que se tarda en completar el análisis respirométrico a ~20 min. Los protocolos descritos en este trabajo (Tabla 3) siguen esta tendencia, a pesar de que otros métodos publicados anteriormente reportan perfiles de OCR eficientes con pasos de medición más largos y estándar26.
Por ejemplo, si se van a realizar dos ensayos consecutivos con el mismo conjunto de muestras en el mismo día, prepare todos los reactivos para el segundo ensayo durante el primero, excepto las diluciones mitocondriales: solo diluya, siembre y gire las mitocondrias inmediatamente antes de comenzar el segundo ensayo, mientras se calibra el instrumento. Una vez finalizado el experimento, se debe calcular el parámetro RCR (sección 4, paso 1.7) para evaluar la calidad de los preparados mitocondriales utilizados. Por lo general, los valores de RCR entre 3,5 y 5 denotan que la integridad mitocondrial es óptima y muestran respiración oxidativa funcional acoplada25. Los ensayos con valores más bajos de RCR deben descartarse porque la integridad mitocondrial se vio comprometida durante el aislamiento. En estos casos, considere lavar el gránulo mitocondrial dos veces (sección 2, pasos 19-21)22, como se informó anteriormente.
En segundo lugar, mantener el pH correcto durante todo el procedimiento es fundamental para obtener resultados exitosos. Asegúrese de que el pH de todas las soluciones se establece como se indica, es decir, pH 7.2, y que el pH siempre se ajusta con KOH a menos que se indique lo contrario. En particular, el pH de los tampones que contienen BSA no debe medirse directamente con el medidor de pH, ya que BSA puede dañar la sonda. Por lo tanto, ajuste el pH en los tampones correspondientes antes de agregar BSA. Para evitar cambios en el pH debido a la adición de BSA, siempre use FFA BSA. Además, algunos lotes ultrapuros de H2O podrían ser ácidos, por lo que se recomienda el uso de H2O de pH 7 purificado comercialmente. Además, es necesario asegurarse de que el medidor de pH está correctamente calibrado y que es el modelo adecuado para medir el pH de los productos químicos a preparar.
En tercer lugar, es crucial realizar correctamente la etapa de recolección de muestra para la medición de proteínas de la suspensión mitocondrial final (sección 2, paso 21) para prevenir la destrucción mitocondrial. Resuspender el pellet rápida pero completamente, recolectar una alícuota y agregar FFA BSA a la suspensión restante para conservar el equilibrio osmótico y proteger las mitocondrias del daño. Si FFA BSA ya estuviera presente en el tampón de resuspensión y, por lo tanto, durante la cuantificación de proteínas, el alto contenido de proteínas confundiría los resultados de cuantificación. Esta es la razón por la cual FFA BSA debe agregarse después de reservar una alícuota para la cuantificación.
Cuarto, este método es muy versátil y se puede ajustar a las necesidades del experimentador. Por ejemplo, si el modelo animal en estudio se caracteriza por una masa muscular reducida (por ejemplo, ratones sarcopénicos), los músculos adicionales pueden aumentar el rendimiento mitocondrial. Aunque en este trabajo se utilizó un ratón macho adulto de tipo salvaje C57BL / 6N, se pueden emplear animales de cualquier género, edad o antecedentes genéticos, así como tipos musculares específicos.
En quinto lugar, los valores respiratorios pueden diferir entre los experimentos debido a ligeras variaciones en la composición de tampones y reactivos, que deben prepararse frescos cada vez. La edad, el sexo, los antecedentes genéticos o las condiciones ambientales también pueden tener un profundo impacto en los resultados. Sin embargo, un experimento exitoso debe presentar aumentos en el consumo de oxígeno después de la inyección de sustratos complejos como ADP y succinato, disminuciones después de la inyección de inhibidores como oligomicina o rotenona, y aumentos marcados cuando se agrega el potente desacoplador FCCP. Además, para evitar una alta variabilidad técnica, asegurar una resuspensión completa de los gránulos mitocondriales para obtener suspensiones homogéneas antes de sembrarlos en la microplaca.
Sexto, si los valores respiratorios basales son bajos, considere realizar un experimento de titulación para ajustar la cantidad de proteína para la siembra. Finalmente, debido a que este trabajo proporciona un método para obtener extractos mitocondriales crudos, se espera un cierto grado de impureza asociada con otros orgánulos, principalmente ER. Un proceso de fragmentación más agresivo para eliminar estas impurezas sería perjudicial para la viabilidad mitocondrial, dificultando la realización de ensayos respiratorios. Si la pureza es una preocupación, especialmente si no es consistente entre las muestras, los resultados del ensayo se pueden normalizar en relación con la pureza mitocondrial después de ejecutar western blots contra diferentes marcadores de orgánulos (Figura 3). Hasta donde sabemos, este es el primer método que destaca las preocupaciones sobre la pureza mitocondrial en los extractos crudos. Por lo general, en otros protocolos para ensayos respirométricos con mitocondrias aisladas, se siembra la misma cantidad de extracto de proteína en los pocillos para comparar muestras, suponiendo que se utilice la misma cantidad de mitocondrias en todos los casos. Esta es una suposición razonable teniendo en cuenta que el aislamiento se realiza en paralelo en todas las muestras. Sin embargo, los antecedentes genéticos o ambientales de las muestras en estudio pueden dar lugar a diferencias considerables en la pureza de los extractos mitocondriales. Por ejemplo, si una mutación genética dada causa un mayor desarrollo de ER citoplasmático, los extractos mitocondriales crudos de estos animales podrían contener un contenido de ER mayor de lo esperado y, en consecuencia, una proteína mitocondrial más baja de lo esperado. Por lo tanto, incluso si la misma cantidad de proteína total de las muestras de control y mutantes se siembran en la microplaca, el consumo de oxígeno de los mutantes se subestimaría. Por lo tanto, se recomienda que se determine la pureza de los extractos de todas las condiciones en estudio. Si los valores son comparables, no se necesita normalización. Sin embargo, si los valores de pureza entre las muestras difieren considerablemente más allá del error estadístico que el experimentador está dispuesto a aceptar, deben usarse para normalizar los resultados del consumo de oxígeno.
El presente protocolo tiene algunas limitaciones. Cabe destacar que este método ha sido optimizado para el tejido muscular esquelético aislado de ratones. Es posible que sea necesario realizar ajustes si se usan diferentes tejidos o músculo esquelético de diferentes especies. Además, cuando se realizan análisis en mitocondrias aisladas, el microambiente celular normal se pierde debido a la ausencia de contexto celular y los otros orgánulos que podrían interactuar con las mitocondrias. Esto podría conducir a resultados que se desvíen ligeramente de las condiciones fisiológicas. Finalmente, a medida que las mitocondrias se centrifugan, se adhieren al fondo de los pozos. Si bien es completamente necesario, se desconocen los efectos potenciales de la centrifugación en su estado normal.
Es importante tener en cuenta que, después de realizar los análisis del ensayo respirométrico, una reducción en el consumo de oxígeno asociada con la respiración ligada a ATP o estimulada por FCCP en mitocondrias aisladas podría indicar posibles alteraciones mitocondriales que podrían explicarse por20: 1) transporte restringido de sustratos a través de la membrana mitocondrial interna, 2) disminución de la actividad de las enzimas involucradas en las reacciones limitantes de velocidad de vías metabólicas específicas como la ETC, ciclo de Krebs, o β-oxidación, o 3) deterioro de la función ETC, entre otras posibles explicaciones.
En resumen, el método actualizado descrito aquí representa una forma adecuada y confiable de evaluar la función de ETC y OXPHOS a partir del tejido muscular esquelético. Tiene múltiples aplicaciones para evaluar cómo las modificaciones genéticas o el medio ambiente podrían afectar la respiración mitocondrial contribuyendo a un fenotipo específico. Sorprendentemente, el presente protocolo podría adaptarse a otros organismos modelo o utilizarse con muestras humanas para evaluar posibles disfunciones mitocondriales asociadas con enfermedades humanas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer a Juan J. Tena por el uso del homogeneizador y a las instalaciones de Proteómica y Ganadería de CABD por el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte de España a través de la beca FPU16/03264 a J.D.H.C., la Association Française contre les Myopathies (AFM) a través de la beca #22450 a C.V.-G., una Beca Institucional MDM-2016-0687 (Unidad de Excelencia Maria de Maeztu, Departamento de Regulación Génica y Morfogénesis en CABD) y BFU2017-83150-P a J.J.C. La Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, el Programa de Financiación FEDER de la Unión Europea, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades a P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
