记录间隙连接电流 非洲爪蟾 卵母细胞

摘要

本文介绍了一种在Xenopus卵母细胞中表达间隙连接蛋白，并利用专为双卵母细胞电压钳记录设计的商用放大器，以高侧电流测量模式记录两个相邻卵母细胞之间连接电流的实验方案。

摘要

在Xenopus卵母细胞中异源表达连接蛋白（connexins）和无脊椎动物连接蛋白（innexins）是研究缝隙连接（gap junctions, GJs）生物物理特性的有力方法。然而，该方法在技术上具有挑战性，因为它需要对两个共用同一接地端的相对卵母细胞进行差分电压钳制。尽管已有少数实验室成功实现了该技术，但基本上所有这些实验室均使用自制放大器或专为单卵母细胞记录设计的商用放大器，这使得其他实验室难以推广应用。尽管一种高侧电流测量模式已被整合到用于双卵母细胞电压钳记录的商用放大器中，但在我们最近的研究之前，尚未有关于其应用的报道。我们通过引入多项技术改进，使高侧电流测量方法更加实用和便捷，这些改进包括：构建基于磁力的记录平台，以实现卵母细胞及各种电极的精确定位；利用浴液作为电压差分电极中的导电介质；采用商用低泄漏KCl电极作为参考电极；使用薄壁玻璃毛细管制作电流和电压电极；以及利用基于磁力的装置对所有电极进行定位。本文所述方法可方便且稳定地记录两个相对的Xenopus卵母细胞之间的连接电流（I_j）。

引言

间隙连接（GJs）是细胞间的通道，可能允许电流流动以及相邻细胞间小分子细胞质物质的交换。它们存在于多种细胞类型中，并执行多样的生理功能。脊椎动物中的间隙连接由连接蛋白（connexins）构成，而无脊椎动物中的间隙连接则由innexins构成。每个间隙连接由两个相对的半通道组成，每个半通道含有6个或8个亚基，具体数目取决于其为连接蛋白还是innexins^1,2,3。人类具有21个连接蛋白基因⁴，而常用的无脊椎动物模型秀丽隐杆线虫（C. elegans）和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）分别具有25个和8个innexin基因^5,6。基因转录本的可变剪接可能进一步增加间隙连接蛋白的多样性，至少在innexins中如此^7,8。

根据分子组成，间隙连接（GJ）可分为三类：同型、异型和杂合型。同型GJ的所有亚基均相同。异型GJ包含两个同源半通道，但这两个半通道由....

方案

手术操作遵循康涅狄格大学医学院机构动物护理委员会批准的方案进行。

1. 青蛙手术及去滤泡卵母细胞的制备

1. 麻醉一只成年雌性非洲爪蟾（*Xenopus laevis*）Xenopus laevis) (材料表通过浸入冰冷（含冰）的三卡因溶液（~300 mg/L）中进行麻醉。
2. 等待约15分钟，直至青蛙对其脚蹼受挤压无明显或无任何反应。将青蛙仰卧置于手术台上。
3. 在左侧或右侧下腹部做一个纵向切口（8–10 mm长），用镊子轻轻拉出一小块卵巢组织，再用小剪刀将卵巢组织剪下。
4. 立即将游离的卵巢组织浸入含钙的溶液中²⁺-无ND96溶液（NaCl 99 mM，KCl 2 mM，MgCl₂ 1 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）₂ 1 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）置于60 mm培养皿内。
5. 使用5-0丝线进行单纯间断缝合关闭切口后（材料表将青蛙放回浅水缸中以恢复。
   注意：切口分两步闭合：先缝合腹膜层和肌肉层，然后缝合皮肤层。每只青蛙接受5次手术，连续两次手术之间至少间隔4周。
6. 将分离的卵巢组织转移至含有10 mL Ca的50 mL离心管中²⁺无 ND96 溶....

结果

UNC-7 和 UNC-9 是秀丽隐杆线虫（C. elegans）的连接子蛋白（innexin）。虽然 UNC-9 仅有一种亚型，但 UNC-7 具有多种亚型，主要在其氨基末端的长度和氨基酸序列上存在差异^7,8。当在非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中表达时，这些连接子蛋白可形成同型以及异型（UNC-7 与 UNC-9）间隙连接（GJ）^7,8。UNC-7b 和 UNC-9 同型间隙连接的代表性 I_j 电流轨迹及其归一化的 G_j-V_j 关系曲线如图3所示。在成对卵母细胞的实验中，卵母细胞1的膜电位（V_m）被钳制在相对于保持电压（-30 mV）的不同水平，而.......

讨论

双卵母细胞电压钳实验似乎需要进行系统优化。若不优化，记录可能极不稳定，放大器可能需要注入过量电流才能达到目标膜电位（Vm），从而导致卵母细胞损伤和记录失败。采用高侧电流测量法获得稳定的双卵母细胞记录时，多个因素至关重要。首先，电流电极和电压电极必须具有适当的电阻（约 1 MΩ），且其电极夹必须保持清洁。其次，V_DIFF 电极必须具有低电阻（<150 kΩ），并应靠近卵母细胞。第三，同一卵母细胞的所有电极（电压、电流和 V_DIFF）必须置于同一侧（左侧或右侧），且电极排列顺序（从后到前）应为电流电极、电压电极、V_DIFF 电极。最后，参考电极应位于 35 mm 培养皿边缘靠近操作者的一侧。

我们对制造商推荐的部分实验步骤进行了修改，并做了一些其他改进。主要包括：1）使用充满ND96溶液的微电极代替KCl负载的琼脂桥作为V_DIFF电极。这种玻璃微电极易于制作、可重复使用，且对卵母细胞无损伤；2）采用低渗.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂桥磁力支架	ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	由于其磁性底座更大，比Narishige管夹更稳定，但需要改装以适配2毫米雌性插座。
自动纳升级注射器	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	Nanoject II	自动化纳升级注射装置
胶原酶 II型	Gibco-USA, Langley, OK, USA	17101-015
金刚石刻划刀	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	62108-ST
差分电压探针	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	7255DI
模数信号转换器	Molecular Devices, San Jose,CA, USA	Digidata 1440A
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500341
玻璃毛细管	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	3-000-203-G/X
热丝切割器	Amazon.com	Proxxon 37080	可选替代型号为Hercules 8500 DHWT，配备脚踏控制踏板。
透明质酸酶 I-S型	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	H3506
磁力支架底座	Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA	MB-L-45
微电极斜面研磨仪	Sutter Instrument, Novato, CA, USA	BV-10
微电极夹持器	World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA	MEH1S15
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument, , Novato, CA, USA	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA	438733	微孔板迷你托盘
尼龙网筛	Component Supply Company, Sparta, TN, USA	U-CMN-1000
卵母细胞钳制放大器	Warner Instruments, , Hamden, CT, USA	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2020b
pClamp	Molecular Devices, , San Jose,CA, USA	Version 10
参比电极	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	DRIREF-2SH	技术规格：https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT（核糖核酸酶抑制剂）	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
5-0 丝线缝合线	Covidien, North Haven, CT, USA	VS890
分光光度计 NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA	TW150F-4
管夹	Narishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	可直接使用，但由于磁性底座较小，其位置容易发生偏移。
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, FL, USA	IMP-XL-FM