הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

תקציר

ביטוי הטרולוגי של קונקסינים ופונקסינים בביציות קסנופוס הוא גישה רבת עוצמה לחקר התכונות הביופיזיות של צמתי פער (GJs). עם זאת, גישה זו מאתגרת מבחינה טכנית מכיוון שהיא דורשת מהדק מתח דיפרנציאלי של שתי ביציות מנוגדות החולקות מכנה משותף. למרות שמספר קטן של מעבדות הצליחו לבצע טכניקה זו, למעשה כולן השתמשו במגברים תוצרת בית או במגברים מסחריים שנועדו להקלטות של ביצית בודדת. לעתים קרובות זה מאתגר עבור מעבדות אחרות ליישם טכניקה זו. למרות שמצב מדידת זרם צד גבוה שולב במגבר מסחרי להקלטות של מהדקי מתח ביציות כפולים, לא היה שום דיווח על יישומו עד למחקר האחרון שלנו. הפכנו את גישת מדידת הזרם הגבוה למעשית ונוחה יותר על ידי הכנסת מספר שינויים טכניים, כולל בניית פלטפורמת הקלטה מבוססת מגנטית המאפשרת מיקום מדויק של ביציות ואלקטרודות שונות, שימוש בתמיסת האמבטיה כמוליכה באלקטרודות דיפרנציאליות מתח, אימוץ אלקטרודת KCl מסחרית עם דליפה נמוכה כאלקטרודת הייחוס, ייצור אלקטרודות זרם ומתח מנימי זכוכית בעלי דופן דקה, ומיקום של כל האלקטרודות באמצעות מכשירים מבוססי מגנטים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הקלטות נוחות וחזקות של זרם צומתי (I_j) בין שתי ביציות קסנופוס מנוגדות.

מבוא

GJs הם תעלות בין-תאיות שעשויות לאפשר זרימה והחלפה של זרם של מולקולות ציטוזוליות קטנות בין תאים שכנים. הם קיימים בסוגי תאים רבים ומבצעים תפקודים פיזיולוגיים מגוונים. GJs אצל בעלי חוליות נוצרים על ידי connexins, ואילו אלה של חסרי חוליות על ידי innexins. כל GJ מורכב משני המיכנלים עם 6 או 8 תת-יחידות לכל המיקנל, תלוי אם הם קונקסינים או innexins ^1,2,3. לבני אדם יש 21 גנים של קונקסין⁴, בעוד שלדגמים הנפוצים של חסרי חוליות C. elegans ו- Drosophila melanogaster יש 25 ו-8 גנים של innexin, בהתאמה ^5,6.

פרוטוקול

הניתוחים מבוצעים בעקבות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קונטיקט.

1. ניתוח צפרדע והכנת ביציות מפורקות

1. להרדים נקבה בוגרת של צפרדע אפריקאית בעלת טפרים (Xenopus laevis) (טבלת חומרים) על ידי טבילה בתמיסת טריקאין קרירה (עם קרח) (כ-300 מ"ג/ל').
2. המתן (כ-15 דקות) עד שהצפרדע תציג תגובה מועטה, אם בכלל, ללחיצה על רגליה ברשת. הניחו את הצפרדע על שולחן ניתוחים כשבטנה פונה כלפי מעלה.
3. לאחר חתך אורכי (באורך 8-10 מ"מ) באזור הבטן התחתונה השמאלית או הימנית, שלפו בעדינות חתיכה קטנה של רקמת שחלה עם זוג מלקחיים, וחתכו את רקמת השחלה עם זו....

תוצאות

UNC-7 ו- UNC-9 הם innexins של C. elegans. בעוד של-UNC-9 יש רק איזופורם אחד, ל-UNC-7 יש מספר איזופורמים הנבדלים זה מזה בעיקר באורך וברצף חומצות האמינו של מסופי האמינו שלהם ^7,8. תמימים אלה עשויים ליצור GJs הומוטיפיים כמו גם הטרוטיפיים (של UNC-7 ו- UNC-9) כאשר הם באים לידי ביטוי בביציות קסנופוס ^7,8. עקבות _{מייצגים I j} והיחסים המנורמלים G_{j-V j .......}

דיון

נראה כי אופטימיזציה של המערכת נחוצה לניסויים כפולים של מהדקי מתח ביציות. בלעדיו, הקלטות יכולות להיות מאוד לא יציבות, וייתכן שהמגברים יצטרכו להזריק כמות מופרזת של זרם כדי להגיע למטרה Vm, וכתוצאה מכך לגרום לנזק לביציות ולכשלים ברישום. מספר גורמים הם קריטיים להשגת רישומי ביציות כפולות יציבות בשיטת מדידת הזרם הצדדי הגבוה. ראשית, אלקטרודות הזרם והמתח חייבות להיות בעלות התנגדות מתאימה (~1 MΩ), ומחזיקיהן חייבים להיות נקיים. שנית, אלקטרודות V_DIFF חייבות להיות בעלות התנגדות נמוכה (<150 kΩ) ולהיות קרוב.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחזיק מגנטי של גשר אגר	ALA מכשירים מדעיים	MPSALT-H	יציב יותר מהדק הצינור של Narishige בשל הבסיס המגנטי הגדול יותר שלו, אך הוא דורש שינוי כדי לקלוט שקע נקבה בגודל 2 מ"מ.
מזרק ננוליטר אוטומטי	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, ארה"ב	Nanoject II	מזרק ננוליטר אוטומטי
קולגנאז, סוג II	Gibco-USA, לנגלי, אוקיי, ארה"ב	17101-015
Diamond Scriber	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, האטפילד, פנסילבניה, ארה"ב	62108-ST
בדיקת מתח דיפרנציאלי	וורנר אינסטרומנטס, המדן, קונטיקט, ארה"ב	7255DI
מכשירים מולקולריים ממיר אותות אנלוגי לדיגיטלי	, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב	Digidata 1440A
Dumont #5 פינצטה	מכשירי דיוק עולמיים, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	500341
נימי זכוכית	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, ארה"ב	3-000-203-G/X
חותך חוטים חמים	Amazon.com	Proxxon 37080	אלטרנטיבה היא הרקולס 8500 DHWT, בעל דוושת בקרת כף הרגל.
Hyaluronidase, סוג I-S	MilliporeSigma, ברלינגטון, MA, ארה"ב	H3506
בסיס מחזיק מגנטי	Kanetec USA Corp., Bensenville, IL, ארה"ב	MB-L-45
Microelectrode Beveler	Sutter Instrument, Novato, CA, ארה"ב	BV-10
מחזיק מיקרואלקטרודה	World Precision Instruments, , סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	MEH1S15
חולץ מיקרופיפטות	Sutter Instrument, , נובאטו, קליפורניה, ארה"ב	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב	438733	Microwell Minitray
ניילון	רשת רכיבי חברת אספקת רכיבים, ספרטה, טנסי, ארה"ב	U-CMN-1000
מגבר מהדק ביציות	וורנר מכשירים, , המדן, קונטיקט, ארה"ב	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, נורת'המפטון, מסצ'וסטס, ארה"ב	2020b
pClamp	מכשירים מולקולריים, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב	גרסה 10
עולמיים של אלקטרודות ייחוס	, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	DRIREF-2SH	מפרטים: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (מעכב ריבונוקלאז)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
תפר משי 5-0	Covidien, נורת' הייבן, קונטיקט, ארה"ב	VS890
ספקטרופוטומטר NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
קפליות זכוכית קיר דק	Precision Instruments, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	מהדק
	Narishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	מוכן לשימוש אך מיקומו נוטה להשתנות בגלל הבסיס המגנטי הקטן.
Xenopus laevis	Xenopus Express, ברוקסוויל, פלורידה, ארה"ב	IMP-XL-FM

מכשירי דיוק World צינור TW150F-4