Summary
우리는 모기와 초파리에서 살충제 감수성을 측정하기위한 국소 적용 생물 분석의 방법론과 중요성을 설명합니다. 제시된 분석은 높은 처리량이며, 곤충 질량을 이용한다 - 따라서 농도 대신에 질량-상대화된 치사량을 계산할 수 있게 한다-그리고 다른 유사한 방법들보다 더 낮은 가변성을 가질 가능성이 있다.
Abstract
공중 보건 및 농업을위한 살충제의 지속적인 사용은 광범위한 살충제 내성과 통제 방법의 방해로 이어졌습니다. 모기 개체군에 대한 살충제 내성 감시는 일반적으로 질병 통제 예방 센터 (CDC) 병 생물 분석 또는 세계 보건기구 (WHO) 튜브 테스트를 통해 수행됩니다. 그러나 이러한 방법은 곤충과의 가변 살충제 접촉, 테스트 된 비교적 적은 수의 유기체, 인구 간 질량의 광범위한 변화 및 끊임없이 변화하는 환경 조건으로 인해 사망률 데이터의 높은 수준의 변동성을 초래할 수 있으며 다양한 결과를 초래할 수 있습니다. 이 논문은 모기와 초파리 모두에 대한 고처리량 표현형 생물 분석법으로 채택 된 국소 응용 생물 분석을 제시하여 다양한 살충제 농도에 따라 많은 수의 곤충을 테스트합니다.
이 분석은 1) 모든 유기체와의 일관된 치료 및 살충제 접촉을 보장하고, 2) 균주와 성별 간의 평균 질량의 차이를 설명하는 매우 구체적인 용량 - 반응 곡선을 생성하며(이는 현장 수집 생물에 특히 중요함), 3) 통계적으로 엄격한 중간 치사량 (LD50 ), 저항 비율 비교에 필요한 - 유충 내성 감시에도 사용되는 진단 용량 사망률로부터의 대안적인 감시 접근법. 이 분석은 모기 개체군을 정확하게 표현하기위한 보완적인 도구가 될 것이며, 초파리를 사용하여 예시 된 바와 같이 다른 곤충과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 우리는이 분석이 여러 곤충 종에서 유전자형과 표현형 살충제 내성 사이의 격차를 메우는 데 도움이 될 것이라고 주장합니다.
Introduction
모기는 인간에게 전염되는 질병으로 인해 매년 700,000 명이 넘는 사망자를 초래하며, 그 중 절반 이상이 말라리아만으로 인한 사망자1입니다. 말라리아 및 기타 벡터 매개 질병의 전염에 대한 주요 예방 방법은 종종 오래 지속되는 살충제 그물 또는 실내 잔류 살포의 형태로 살충제를 사용하는 것입니다2. 그러나 살충제 내성은 모기 및 기타 곤충 벡터뿐만 아니라 농업 해충 3,4 사이에서 널리 퍼져 있습니다. 저항을 효과적으로 관리하려면 감시가 매우 중요합니다5. 이를 위해서는 매우 정확하고 높은 처리량의 저항 감지 방법이 필요합니다. 현재 모기에 대한 가장 널리 퍼져있는 살충제 내성 감시 도구는 WHO 튜브 테스트6 및 CDC 병 생물 분석7입니다. 초파리의 경우 잔류 접촉 적용 방법 (CDC 병 생물 분석과 유사)은 일반적으로 사용되는 살충제 생물 분석 8,9,10입니다. 그러나 이러한 방법으로부터의 데이터의 변동성은 일반적으로 높으며, 동일한 실험실 모기 균주의 측정은 CDC 병 분석에서 ~ 20-70 %의 사망률과 치명적인 복용량에 노출 될 때 WHO 튜브 테스트에서 0-50 %(11)에 이릅니다. 이러한 변이는 대부분의 실험실 균주에서 제한된 유전적 변이가 집단에서 제한된 살충제 감수성 변이를 초래할 것으로 예상되기 때문에 놀랍다. 그럼에도 불구하고, 생물검정 결과에서 관찰된 높은 수준의 변이가 여전히 존재한다.
이러한 변이의 잠재적 원인은 표면을 통한 간접적 인 살충제 노출, 이질적인 환경 영향, 동일한 유전자형을 가진 개인 간의 정상적인 생물학적 변이, 동일한 집단의 표본 질량의 변화로 인한 생물 분석 내 표본 간의 이질적인 살충제 노출의 결과 일 수 있습니다12 . 더 높은 재현성을 가진 드물게 사용되는 방법은 국소 적용 생물 검정입니다. 이 분석에서, 살충제는 각 곤충13,14에 직접 적용되어, 동일한 검정 내에서 상이한 표본의 이종 노출의 인자를 제거한다. 그러나이 방법의 느린 처리량 특성으로 인해 모기 개체군을위한 살충제 감수성 감시 도구로 일상적으로 사용되지 않습니다. 이 논문은 살충제 감수성의 변화와 상관 관계가 있는 파라미터인 곤충 질량의 변화를 교정하는 동시에 더 높은 처리량 노출을 허용하는 국소 적용 생물검정을 위한 변형된 프로토콜을 제시한다(12). 가변 살충제 노출로 인한 사망률 데이터의 소음 및 질량 관련 변동의 감소는 보다 정확한 기술적 저항 감시(Technical resistance surveillance 11,15)를 가능하게 할 것이다. 이러한 데이터는 표현형 내성을 유전자 마커, 적합성 파라미터 및/또는 벡터 능력과 보다 정확하게 연관시키는데 사용될 수 있다. 또한, 우리는이 분석이 더 작은 몸매의 곤충 종 인 초파리에 국소 적용 생물 분석을 사용하여 다른 곤충 종에 쉽게 적응할 수있는 방법을 보여줍니다.
전술한 잔류 접촉 용도의 주요 한계는 살충제 노출이 동일한 검정 내에서 시편마다 다를 수 있다는 것입니다. CDC 병 생물 검정 및 접촉 방법의 경우, 살충제 노출은 동일한 분석의 반복실험에 따라 다를 수 있습니다. 곤충은 유리 병 내부 (CDC 병 생물 분석 및 접촉 방법) 또는 함침 된 종이 (WHO 튜브 테스트)에 분포하는 살충제에 노출됩니다. 양쪽 표면 (유리 및 종이)에 살충제의 농도는 알려진 유전자형의 다른 종을 스크리닝함으로써 알려지고 미리 결정됩니다. 그러나, 곤충에 의해 잠재적으로 흡수될 수 있는 양은 사용되는 표면, 살충제 혼합물 성분, 및 살충제가 표면 물질(16,17)에 걸쳐 얼마나 균질하게 분포되는지에 따라 크게 변할 수 있다. CDC 병 생물 분석에서 병 내부의 살충제 코팅은 각 실험실 및 사용자가 사용하는 절차에 따라 다릅니다. WHO 튜브 테스트에서 살충제 처리 된 논문은 중앙에서 생산되므로 실험실 전체에서 매우 균질 할 가능성이 큽니다. 그러나 WHO 튜브 테스트에서 노출 튜브는 시편이 살충제에 노출되지 않은 금속 메쉬에 착륙하고 휴식을 취할 수있게하여 각 테스트 내에서 표본 중 잠재적 인 이종 살충제 노출을 유도합니다. 각 방법을 통해 표본에 의해 포착되고 흡수 된 살충제의 실제 양은 여전히 더 탐구 될 필요가 있습니다18.
추가적으로, CDC 병 생물 분석, WHO 튜브 테스트 및 접촉 방법은 하나의 미리 결정된 살충제 농도만을 시험하는 역치 분석으로 가장 일반적으로 사용된다. 이 접근법은 저항의 존재를 정확하게 감지 할 수 있으며 저항 감시 (특히 저항이 확산되는 경우)에 유용합니다. 그러나 역치 분석은 저항의 강도를 정량화 할 수 없으므로 개입 도구의 효능을 더 잘 예측할 수 있습니다. 이러한 방법과 함께 여러 살충제 농도를 사용하면 강도 분석으로 사용할 수 있습니다. CDC 병 생물 검정 및 WHO 튜브 시험에 대한 강도 검정은 감시 6,19에서 이러한 격차를 해결하기 위해 미리 결정된 판별 투여량을 5x 및 10배로 시험함으로써 도입되었다. 내성 집단을 구별하는 더 큰 능력을 제공하면서, 3-5 (미리 결정된) 복용량은 치사 농도를 계산하기 위해 제한된 해상도를 제공합니다. 또한, 다양한 크기의 모기가 이러한 분석에 사용됩니다. 그러나, 질량은 질량 단위당 유효 투여량이 더 작은 유기체(12)의 그것보다 훨씬 낮을 것이기 때문에 더 큰 표본이 더 높은 투여량이 사멸될 필요가 있을 수 있기 때문에 측정하는데 중요하다. 질량 상대화된 치사량(곤충 질량 당 살충제의 양)을 계산하는 것은 성별, 개체군 및 유전자형 사이의 곤충 질량의 변화를 고려하기 때문에 더 일반적인 치사농도(예를 들어, 표면적 당 살충제의 양)보다 더 유용한 지표가 될 것이다. 이러한 데이터는 실험실과 현장 내에서 유전자형과 표현형 내성 사이의 격차를 메우는 데 도움이되며 알려진 평균 질량의 곤충 개체군을 치료하는 데 필요한 적용 농도를 계산하는 쉬운 방법을 제공 할 수 있습니다.
표본의 50 % (LD 50)를 죽이는 대량 상대화 된 치명적인 복용량의 사용은 또한 몇 가지 다른 이점을 통합합니다. mg / kg (= ng / mg)의 특정 화합물의 독성 평가는 인간 및 수의학 독성학14에서 표준이며 LD50 값은 재료 안전 데이터 시트에서 발견됩니다. 치사량은 또한 특정 종에 대한 상이한 화학물질 또는 상이한 종(20)에 대한 동일한 화학물질 사이의 독성의 직접적인 비교뿐만 아니라, 새로운 살충제 및 화학물질(13)에 대한 고품질 평가를 허용한다. 추가적으로,LD50 은 진단 용량 사망률 결과로부터 유래된 것들보다 더 의미 있고 정확한 저항 비율을 제공할 수 있으며, 이는 집단에 존재하는 저항 수준의 과대 평가를 초래할 수 있다. 따라서, 이러한 분석은 다른 생물분석법(21)에 권장되는 것보다 더 많은 표본으로부터 유래된 질량-상대화된 치사량에 기초한 보다 엄격한 저항 모니터링을 제공함으로써 일상적인 감시 프로그램에 적합할 것이다.
국소 적용 방법은 내성이 이미 알려져 있거나 의심되는 경우 표준 살충제 감수성 생물 검정 (22,23)의 대안으로 모기 및 파리에 대한 살충제 감수성 감시뿐만 아니라 일부 해충 곤충(24)에서의 감시를 위해 내성 프로파일 및 살충제 고유 독성21을 보다 정확하게 평가하기 위해 사용되어 왔다. . 국소 적용 생물 분석에서 살충제는 각 유기체에 적용되어 살충제 노출의 변동을 최소화합니다. 이 논문은 곤충 질량22을 통제하면서 단기간에 많은 수의 곤충에 살충제 노출을 적용 할 수있게 해주는 약간 적응되고 개선 된 방법을 제시합니다. 재현성이 좋은 이 높은 처리량 방법은 일상적인 살충제 감수성 감시에 유용한 추가 도구가 될 수 있습니다.
Protocol
참고 : 살충제는 인간, 동물 및 환경 적 위험을 유발할 수 있습니다25. 주의, 교육 및 개인 보호 장비를 적극 권장합니다. 사용 된 모든 살충제 및 용제에 대한 재료 안전 데이터 시트를 따르십시오.
1. 후방 표본
- 후면 3-5 일 된 성인 모기.
참고 : 아래의 프로토콜은 유엔 지침 26의 식량 농업기구 (Food and Agriculture Organization of United Nations guidelines26)를 면밀히 준수하는 Aedes aegypti 양육 조건을 반영합니다.- 27 ± 1 ° C 및 75 ± 5 % 상대 습도에서 12:12 시간의 밝고 어두운 사이클링으로 모든 생명 단계의 후방 모기.
- 모기 알을 탈이온수에 담그고 효모26을 첨가하여 부화하거나 침수 된 알을 진공 챔버 내부에 30 분 동안 넣으십시오.
참고 : 두 방법 모두 물 내의 산소 함량을 감소시키고 부화27을 증가시킵니다. - 새로 부화 한 유충에게 쟁반 내에서 물고기 음식 (또는 지상 고양이 키블과 같은 동등한 식단)을 먹이고 애벌레 밀도가 발달12 (예 : 총 1.5 L의 물을 포함하는 트레이 당 200-250 마리의 유충)에 영향을 미치기 때문에 트레이 사이에서 가능한 한 유사하게 유충 밀도를 유지하십시오.
- 번데기 단계 (약 7-10 일)에 도달 할 때까지 격일로 애벌레에게 먹이를주고 필요에 따라 음식의 양을 늘리십시오.
참고 : 너무 적게 먹으면 애벌레의 성장이 방해 받고 애벌레가 서로 먹을 수 있습니다. 너무 많이 먹으면 애벌레가 죽어서 물이 파울로 변할 수 있습니다. - 번데기가 발달하면 매일 성인 모기 케이지의 물 그릇으로 옮기고 10 % 자당 용액 광고 리비툼을 제공하십시오.
- 성인 출현 첫날을 기록하십시오. 출현이 시작된 지 2 일 후에 새장에서 남아있는 번데기를 제거하십시오.
참고 : 수컷 모기는 더 빨리 나타납니다. 남성과 여성이 별도로 출현하는 것을 주목하고 각 테스트에 충분한 남성과 여성을 사용할 수 있는지 확인하십시오. - 번데기를 제거한 후 3 일 동안 기다렸다가 테스트를 위해 3-5 일 된 모기를 얻으십시오.
- 후방 초파리(취리히 대학28의 프로토콜을 느슨하게 따름).
- 리어 초파리는 23 ± 1 °C 및 60 ± 5 % 상대 습도에서 12:12 h 밝고 어두운 사이클링으로 스톡 병에 균주를 함유합니다.
참고 : 초파리 스톡 병에는 75mL의 표준 플라이 배지가 포함되어야하며, 먼저 병 바닥에 액체로 부은 다음 밤새 응고되도록합니다. - 인구 과잉과 곰팡이 성장을 방지하기 위해 두 주마다 신선한 음식으로 새로운 재고 병에 식민지를 옮깁니다. 이렇게하려면 휴대용 이산화탄소 (CO2) 디스펜서를 사용하여 파리를 쓰러 뜨리고 마취 된 파리를 얼음 팩 또는 냉장 테이블의 계량 용지로 옮기고 미세 팁 페인트 브러시를 사용하여 파리를 신선한 스톡 병에 브러시로 닦으십시오. 파리가 음식에 떨어지고 익사하는 것을 방지하기 위해이 과정에서 병을 옆구리에 보관하십시오.
- 리어 초파리는 23 ± 1 °C 및 60 ± 5 % 상대 습도에서 12:12 h 밝고 어두운 사이클링으로 스톡 병에 균주를 함유합니다.
2. 중량 측정 접근법을 사용하여 살충제 제형을 준비하십시오.
- 흄 후드 내부에 0.1mg 정확도의 분석 스케일을 사용하여 중량 측정 접근법에 따라 첫 번째 원액을 만드십시오.
참고 : 중량 측정 접근법은 살충제와 첨가 된 용매의 양을 측정하기 위해 질량을 사용합니다. 표준 관행 (용적 접근법)은 첫 번째 원액이 준비 될 때 첨가 된 (고체) 살충제의 양을 측정하기 위해 분석 척도가 필요합니다. 그러나, 첨가된 용매의 양 및 다음의 모든 희석은 부피에 의해서만 측정된다. 중량 측정 접근법은 더 높은 수준의 정확도를 가지며 따라서 선호된다.- 첫 번째 원액에 대한 목표 살충제 농도 및 목표 부피 (냉동실에 보관할 때 유출을 방지하기 위해 15 mL 원뿔형 튜브를 사용하는 경우 최대 10 mL 권장)를 결정하고 Eq (1)를 사용하여 첨가 할 살충제 활성 성분 (AI)의 양을 계산하십시오.
(1) - 저장 튜브 (더 큰 부피에 권장되는 15 mL 원뿔형 튜브, 1 mL 이하의 부피에 권장되는 1.5 mL 마이크로 원심분리 스크류 캡 튜브)를 준비하고 살충제 및 용매 이름, 목표 농도 및 준비 날짜가 표시된 라벨을 준비하십시오. 튜브와 뚜껑을 랙 또는 홀더 내의 저울에 놓고 저울을 깎아냅니다.
- 단계 2.1.1에서 결정된 원하는 양의 고체 또는 액체 살충제 AI를 계량합니다. (예를 들어, 대표적인 데이터에 사용되는 델타메트린) 튜브 내로 질량을 기록한다.
- 스케일을 꿰매고 원하는 부피의 용매 (목표 부피와 동일)를 튜브에 넣고 즉시 뚜껑을 닫고 질량을 기록하십시오. 증발을 피하기 위해 용매 (여기에 사용 된 아세톤)를 첨가 한 직후에 튜브의 뚜껑을 닫고 용액을 혼합하십시오.
- 실내 온도를 기록하십시오. 아세톤과 같은 일부 용매는 온도에 따라 부피 (및 결과적으로 밀도)에 상당한 변화를 가질 수 있습니다.
- 즉시 보관하는 경우 튜브 뚜껑을 파라필름으로 감싸고(증발을 줄이기 위해), 튜브 랙/홀더에 넣고(똑바로 세우고 누출을 방지하기 위해), 호일로 덮고(UV 노출을 방지하기 위해), 재밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣고(증발을 줄이기 위해), 가방을 -20°C 냉동고에 넣습니다. 즉시 보관하지 않으면 뚜껑이 고정되어 있는지 확인하고 호일 또는 빛으로 보호 된 용기에 덮으십시오.
- 추가 된 살충제 AI의 질량을 첨가 된 용매의 양 (및 액체 형태의 경우 첨가 된 살충제의 부피)으로 나눔으로써 원액의 실제 농도 (mg / mL)를 계산하십시오. 첨가 된 용매 (또는 액체 살충제)의 부피를 계산하려면 첨가 된 질량을 기록 된 온도에 적합한 알려진 밀도로 나눕니다.
- 첨가 된 총 질량 (살충제 및 용매)을 첨가 된 총 부피 (액체 형태의 경우 용매 및 살충제)로 나눔으로써 원액의 밀도 (g / mL)를 계산하십시오. 액체 질량을 부피로 변환하기 위한 단계 2.1.7을 참조한다.
- 첫 번째 원액에 대한 목표 살충제 농도 및 목표 부피 (냉동실에 보관할 때 유출을 방지하기 위해 15 mL 원뿔형 튜브를 사용하는 경우 최대 10 mL 권장)를 결정하고 Eq (1)를 사용하여 첨가 할 살충제 활성 성분 (AI)의 양을 계산하십시오.
- 10% 희석을 통해 초기 원액을 연속적으로 희석합니다. 필요한 경우 이러한 연속 희석을 사용하여 초기 용량-반응 곡선을 만들어 생물 분석을위한 살충제 농도의 목표 범위를 확인하십시오.
- 각 튜브에 첨가할 살충제 원액 및 용매의 부피를 계산한다 (예를 들어, 이전 농도의 10%의 10 mL 희석을 위해 9 mL의 용매에 희석된 1 mL의 살충제 원액).
- 10 초 동안 원액을 소용돌이 치십시오. 스케일에 미리 표지된 첫 번째 희석 튜브를 겉으로 겹쳐씁니다. 피펫을 사용하여 첫 번째 희석 튜브에 필요한 부피의 원액을 추가하십시오. 즉시 두 튜브의 뚜껑을 닫고 첫 번째 희석 튜브에 질량을 기록하십시오.
- 첫 번째 희석 튜브를 다시 꿰매고 필요한 부피의 용매를 첨가하십시오. 뚜껑을 즉시 닫고, 첨가된 용매의 질량을 기록하고, 첫 번째 희석액을 10초 동안 와류시킨다.
- 나머지 희석액에 대해 2.2.2 단계와 2.2.3 단계를 반복하십시오.
- 단계 2.1.6에서 위에서 설명한 바와 같이 모든 희석액을 저장하십시오.
- 단계 2.1.7에 따라 희석액의 실제 농도를 계산하십시오.
- 첨가된 총 질량(살충제 용액 및 용매)을 첨가된 총 부피(살충제 용액 및 용매)로 나눔으로써 각 살충제 희석액의 밀도를 계산한다. 각 연속 희석에 대해 이전 살충제 재고 희석액의 밀도를 사용하여 Eq (2)에 따라 새로운 희석액의 밀도를 계산하십시오.
(2)
- 선택 사항 : 연속 희석에 의해 더 작은 증분으로 살충제 희석액을 만듭니다.
- 초기 연속 희석, 이전 시험 또는 출판 된 문헌의 용량 - 반응 곡선을 사용하여 만들 각각의 새로운 용액의 농도와 부피를 선택하십시오.
참고: 선택한 농도는 0-100%의 사망률 범위를 가져와야 하며, Probit 분석을 허용하려면 이 범위에서 최소 세 가지 농도가 있어야 합니다. - 연속 희석액을 스톡 용액으로 사용하여 각각의 새로운 희석을 만들고 단계 2.2를 수행하여 10배 희석물 사이에 새로운 희석을 생성합니다.
- 초기 연속 희석, 이전 시험 또는 출판 된 문헌의 용량 - 반응 곡선을 사용하여 만들 각각의 새로운 용액의 농도와 부피를 선택하십시오.
- 선택 사항 : 살충제 용액을 Aliquot. 더 많은 양의 살충제 용액이 만들어지면 용액을 1.5 mL 스크류 캡 튜브에 분취하여 잦은 취급 및 빛에 노출되어 스톡 용액의 오염, 증발 및 분해를 방지하십시오.
- 가장 낮은 농도에서 시작하여 용액을 분취하여 잠재적 인 오염을 줄이기 위해 최고 농도로 작업합니다. 개봉 전에 10초 동안 볼텍싱하여 각각의 원액을 혼합하고, 원하는 부피(예를 들어, 0.5 mL)를 미리 라벨링된 스크류 캡 튜브 내로 피펫팅한다.
- 분취량을 -20°C 냉동고의 내광성 용기에 보관한다.
참고 : 정기적으로 (매월) 분취량을 재고 살충제 희석액에서 직접 채취 한 작은 새로운 분취량으로 교체하는 것이 좋습니다. 이것은 샘플이 벤치에서 사용되는 동안 증발 또는 UV 분해로 인한 오염 또는 다른 실험으로 이월되거나 변화될 가능성을 제한할 것이다. 이 프로토콜은 살충제 용액이 제대로 보관되고 (단계 2.1.6 참조) -20 °C 냉동고에 보관되는 한 여기에서 일시 중지되고 몇 년 후에도 다시 시작될 수 있습니다.
- 용매 증발을 모니터링하기 위해 보관하기 전에 영구 마커 펜을 사용하여 반월 연골을 표시하십시오. 분취량을 만들기 위해 살충제 용액을 제거 할 때 용액이 제거 될 때마다 반월 연골을 표시하십시오.
(1)
(2)3. 국소 적용 생물 분석 작업 공간 준비
참고 : 모기 나 파리를 탈출하기 쉽도록 벤치 탑 곤충 처리 텐트에서 작업하는 것이 좋습니다. 곤충 취급 텐트의 이미지에 대해서는 보충 그림 S1 을 참조하십시오.
- 냉동실에서 필요한 살충제 용액을 제거하고 즉시 와류시킨 다음 실온에서 내광성 용기에 넣어 살충제를 사용하기 전에 실온으로 따뜻하게하십시오.
참고 : 살충제 AI는 더 시원한 온도에서 용매와 분리 될 수 있습니다. 또한, 아세톤 부피는 온도에 따라 변하여 적용된 살충제 복용량을 변경할 수 있습니다. 용액을 혼합하고 실온으로 따뜻하게하면 살충제 용액을 사용할 때 일관성을 보장하는 데 도움이됩니다. - 재료 표에서 참조된대로 곤충 취급 텐트에서 국소 적용 분석에 필요한 모든 도구와 재료를 제시하십시오.
- 아세톤 분취량 당 5 회 세척을 완료하여 분석 등급 아세톤으로 주사기 배럴과 바늘을 청소하십시오. 총 25 회 세척을 위해 5 개의 개별 분취량으로 완료하십시오. 주사기 및 리피터 피펫터 부품에 대한 보충 그림 S2 를 참조하십시오.
- 각각 0.5 mL의 아세톤으로 5 개의 마이크로 원심분리 튜브를 준비하십시오.
- 주사기 배럴을 첫 번째 튜브에서 0.025 mL의 아세톤으로 채운 다음 플런저를 신속하게 밀어 아세톤을 폐기물 용기로 배출하십시오. 네 번 더 반복하여 동일한 아세톤 분취액으로부터 총 다섯 개의 아세톤 세척을 완료한다. 그런 다음 주사기 배럴을 공기로 완전히 채우고 공기와 잠재적 인 아세톤 잔해를 폐기물 용기로 배출하십시오. 두 번 더 반복하여 공기로 세 번의 "세척"을 완료하십시오.
- 아세톤의 나머지 4 개의 튜브에 대해 3.3.2 단계를 반복하십시오.
- 주사기 플런저와 바늘 상단 사이의 배럴 내에 플런저를 배럴 (~ 5mm)에 약간 당겨 공기 주머니를 만듭니다.
참고 :이 공기 주머니는 플런저가 살충제 용액과 접촉하지 않도록 보호하고 살충제 운반을 줄입니다. - 국소 적용에 사용할 준비가 될 때까지 주사기를 따로 두십시오.
- 적용 할 복용량을 포함하는 키를 만들고 난수 또는 문자 생성기 다음에 임의의 ID를 할당하십시오 ( 보충 파일 1 참조).
- 블라인드 사망률 평가를 위해 플라스틱 보관 컵에 임의의 ID로 라벨을 붙입니다.
참고: 필요한 경우 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 일시 중지하는 동안 몇 시간 이상이 경과하면 주사기가 깨끗한지 확인하고 곤충을 투여하기 전에 약 1 시간까지 살충제 용액을 냉동실에 다시 넣은 다음 3.1 단계를 반복하기 위해 3.3 단계를 반복하는 것이 좋습니다.
4. 국소 생물 분석을위한 표본을 준비하십시오. 절차 개요 는 그림 1 을 참조하십시오.
- 모기를 분류하고 무게를 측정하십시오.
- 흡입으로부터의 흡입에 의해 구동되는 흡인기기를 사용하여, 손상된 개인을 설명하기 위해 과잉을 포함하여 분석에 필요한 3-5 일 된 성인 모기의 원하는 수를 흡인하십시오. 모기를 원뿔형 튜브 (튜브 당 최대 100 마리의 모기)로 옮기고 팁을 감싸고있는 면화로 튜브에 넣고 부드럽게 내뿜고 흡인물을 두드리십시오. 흡입기 팁을 제거할 때 면을 사용하여 튜브를 꽂은 다음 뚜껑을 뚜껑으로 꽂습니다. 한 번에 너무 많은 모기로 흡입기와 튜브를 채우지 마십시오.이 모기는 모기에 추가 스트레스를 가중시키고 사망을 초래할 수 있습니다.
- 튜브의 모기를 4 °C에서 최소 10 분 동안 두거나 얼음 쟁반에 얼음 아래에 묻어 간단히 쓰러 뜨립니다.
참고 : 모기는 최소 사망률29로 몇 시간 동안 2 °C에서 유지 될 수 있습니다. 그러나 잠재적 인 부정적인 영향을 줄이기 위해 모기가 얼음 위에있는 기간을 최소화하는 것이 가장 좋습니다. - 쓰러진 모기를 곤충 취급 텐트로 옮기고 조심스럽게 모기를 얼음 위에 놓인 플라스틱 트레이 (예 : 페트리 접시)에 넣으십시오. 한 번에 약 50 마리의 모기 만 부어 각 모기가 그 아래의 시원한 쟁반에 닿고 쓰러진 상태를 유지하십시오.
- 포셉으로 다리 (또는 날개)로 부드럽게 모기를 집어 들고 각 성별을 별도의 홀딩 컵에 넣어 성별로 모기를 분류하십시오. 분류하는 동안 각 성별의 모기 수를 계산하고 원하는 수에 도달하면 중지하십시오. 분류하는 동안, 부상당한 모기 (예를 들어, 다리가 누락 됨) 또는 매우 큰 모기 (예를 들어, 비정상적으로 확대 된 복부) 또는 작은 모기 (육안으로 쉽게 구별 할 수 있음)를 제거하십시오 그 집단의 평균 모기 크기보다 작음).
참고 : 부속기에 의한 모기 취급은 부드러운 일차 신체 (예 : 복부)의 구조적 손상을 줄입니다. - 모기의 각 컵의 무게를 0.1mg의 정밀도로 분석 척도를 사용하여 기록하십시오.
- 페트리 접시가있는 빈 컵을 저울에 뚜껑으로 놓고 저울을 깎으십시오. 모기를 용기에 붓고 뚜껑을 위에 놓고 용기를 저울에 놓습니다.
- 점수 시트에 표본의 합산 무게와 수를 기록하십시오 ( 보충 파일 2 참조). 즉시 표본 컵을 얼음 위에 다시 올려 놓고 고정시킵니다.
- 시편의 모든 컵을 칭량할 때까지 4.1.5.1-4.1.5.2단계를 반복합니다.
- 준비된 모기를 무작위 ID로 표시된 얼음 위에 놓인 별도의 컵에 20-25 개의 그룹으로 나눕니다. 모기를 옮길 때 집게로 인한 스트레스와 신체적 손상을 줄이는 것을 목표로합니다. 이상적으로는 포셉을 사용하여 모기를 1-2 번만 선택하십시오 : 분류 / 계량을 위해 한 번, 실험 컵으로 옮길 수있는 잠재적 인 두 번째 시간.
참고 : 컵 당 모기의 이상적인 수는 20-25이며, 이는 복제하기에 충분하며 사망률을 평가하는 것이 합리적이며 컵에서 밀도로 인한 스트레스 / 사망을 초래해서는 안됩니다.
- 초파리를 분류하고 무게를 측정하십시오.
- 7 초 동안CO2 를 사용하여 파리를 마취하십시오.
참고: 파리가 7초 이상CO2 에 노출되면30초를 깨울 때 크롤링과 비행에 어려움을 겪을 수 있습니다. - 파리를 벤치 종이로 싸인 얼음 팩에 붓고 미세한 페인트 브러시를 사용하여 남성과 여성을 분리하고 계산하십시오.
- 페인트 브러시를 사용하여 선택한 파리를 부드럽게 집어 들고 깨끗하고 빈 재고 병에 넣으십시오. 동일한 수의 수컷과 암컷 초파리(예: 수컷 15마리와 암컷 15마리)를 선택하고 스톡 병에 균주 이름과 초파리 합계(예: Canton-S, 30마리의 파리)라고 표시하십시오.
참고 : 수컷 초파리는 암컷31의 존재에서 제거 된 후 서로에 대한 공격성이 높아질 수 있기 때문에 암컷과 수컷 초파리를 동등하게 갖는 것이 중요합니다. 따라서 살충제가 아닌 사망률이나 부상을 피하려면 남성과 여성의 수를 동일하게 유지하는 것이 가장 좋습니다 (또는 수컷 초파리를 완전히 생략하십시오). - 분석 척도를 사용하여 초파리의 각 병의 무게를 기록하십시오.
- 페트리 접시를 뚜껑으로 씌운 빈 바이알(임의의 ID로 라벨이 붙어 있고, 3.4단계 참조)을 저울에 뚜껑으로 놓고 저울을 깎아냅니다.
참고 : 유리 병은 정적을 크게 줄이기 때문에 초파리와 함께 사용하는 것이 좋습니다. - 7초 동안CO2 를 사용하여 바이알의 랜덤 ID에 해당하는 초파리의 병을 마취시킨다.
- 초파리를 계량 용지에 붓고 종이를 깔때기로 사용하여 파리를 바이알에 도입하십시오. 페트리 접시 뚜껑을 초파리의 바이알 위에 놓고 저울에 놓습니다.
- 점수 시트에 표본의 무게와 수를 합친 다음 즉시 초파리의 바이알을 얼음 쟁반에 놓고 뚜껑을 맨 위에 올려 파리가 빠져 나가는 것을 방지하십시오.
- 초파리의 각 병에 대해 4.2.4.1-4.2.4.4 단계를 반복하십시오.
- 페트리 접시를 뚜껑으로 씌운 빈 바이알(임의의 ID로 라벨이 붙어 있고, 3.4단계 참조)을 저울에 뚜껑으로 놓고 저울을 깎아냅니다.
- 7 초 동안CO2 를 사용하여 파리를 마취하십시오.
- 위의 단계가 완료되면 즉시 다음 섹션으로 이동하십시오.
5. 복용량 표본
- 적절한 살충제 농도로 주사기를로드하십시오. 최소 농축 용량으로 시작하여 각 유기체 그룹과 함께 가장 집중된 복용량으로 작업하십시오. 폐기물을 방지하려면 주사기에 필요한 양의 살충제와 권장 된 추가 2 μL 만 적재하십시오.
- 얼음 위의 트레이 위에 놓인 계량 용지에 시편을 팁으로 씌우십시오. 깨끗하고 살충제가없는 페인트 브러시 또는 면봉을 사용하여 서로 가까운 표본을 분리하여 투약을 위해 각 표본에 쉽게 접근 할 수 있도록하십시오. 모기의 경우 페인트 브러시를 사용하여 각 표본이 도섬에 누워 있고 복부 표면이 위를 향하고 있는지 확인하십시오.
- 주사기를 사용하여 살충제 용액 (또는 대조군을위한 아세톤) 한 방울을 모기의 복부 흉부 및 복부 부위와 초파리의 도섬에 바르십시오. 초파리와 같은 작은 크기의 곤충에는 0.2 μL 액적 (10 μL 주사기가 필요함)을 바르고 모기에는 0.5 μL 액적 (25 μL 주사기가 필요함)을 바르십시오.
참고 : 살충제 민감성은 부속기 (예 : 날개, 다리 또는 코)와 비교하여 주요 신체 부위 (예 : 머리, 흉부 및 복부)간에 크게 다르지 않습니다.32. 따라서, 적용 부위는 투여량 액적이 일차체에 적용되는 한 정확할 필요는 없다. 복부 흉부와 복부 영역은 종종 쓰러 질 때 등쪽에 누워 있기 때문에 모기로 선택되는 반면, 도섬은 종종 쓰러 질 때 복부 쪽에 누워 있기 때문에 초파리로 선택됩니다. 이렇게 응용 프로그램 사이트의 특이성이 감소하면 이 메서드의 처리량을 늘리는 데 도움이 됩니다. - 즉시 표본을 라벨이 붙은 플라스틱 컵에 다시 붓고 그물망과 고무 밴드로 컵을 덮으십시오. 컵을 홀딩 트레이에 넣고 컵에 이 과정에서 죽거나 손상되거나 탈출한 표본을 기록해 둡니다(컵에 있는 표본의 최종 개수에서 제외하기 위해). 첫 번째 컵의 경우, 투약이 완료된 시간을 기록하십시오.
- 복용량 사이의 살충제 오염을 피하기 위해 시편이 놓인 계량 용지를 교체하십시오.
- 모든 표본이 적절한 살충제 농도로 투여 될 때까지 각 컵에 대해 투약을 반복하고 모든 표본이 투여 된 종료 시간을 기록하십시오.
- 젖은 면봉을 통해 각 컵에 10 % 자당 용액을 제공하고 다음날 사망률이 평가 될 때까지 컵을 따로 두십시오. 모기를 27 ± 1 °C에서 75 ± 5 % 상대 습도 5로 저장하고 초파리는 23 ± 1 °C에서 60 ±5 % 상대 습도로 보관하십시오.
참고: 코튼 볼을 압착하는 동안 과포화나 불포화를 피하기 위해 주의하십시오. 면봉은 촉촉해야하지만 물방울이 떨어지지 않아야합니다. 컵에 설탕 물을 떨어 뜨리면 표본의 사망률이 발생할 수 있으므로 살충제의 사망률 평가에 영향을 줄 수 있습니다.
6. 사망률 평가
- 살충제 노출 시작 후 24 시간에 표본 사망률을 기록하십시오. 모기가 날고 똑바로 설 수 있다면 살아있는 것으로 분류하십시오. WHO 6에 설명 된대로 움직이지 않거나 운동 실조증 (비행기를 위해 서거나 이륙 할 수 없음)인 경우 사망 한 것으로간주됩니다. 초파리 8,33에 대해 동일한 사망률 평가를 따르십시오.
참고 : 지연된 사망률을 평가하기 위해 사망률은 매일 설탕 물 변화로 48 및 72 시간 후에 추가로 평가할 수 있습니다. - 사망률이 기록된 후, 모든 표본 컵을 적어도 1시간 동안 냉동실에 담긴 봉지에 넣어 폐기 또는 후속 사용(예: 분자 또는 화학적 분석)하기 전에 모든 표본이 죽었는지 확인합니다.
7. 반복실험 수행
- 새로운 표본 세트에 대해 3-6 단계를 반복하고, 살충제 감수성이34 일의 시간에 따라 변할 수 있으므로 매일 동시에 복제를 수행하도록주의하십시오.
- 표본의 50%를 죽이는 치사량의 정확한 추정을 위해 각 농도에 대해 최소 3번의 반복실험(LD50)을 보장하십시오. 높은 수준의 변동성이 관찰되는 경우 더 많은 반복실험을 포함하십시오.
- 모든 데이터가 수집된 후 분석을 완료합니다.
8. 결과 분석
- 스프레드시트 프로그램에 데이터를 기록하고 임의 ID 키를 사용하여 데이터의 마스크를 해제합니다(3.4단계 참조). 통계 프로그램 R( 35)(보충 파일 4의 예제 R 코드 참조) 또는 선택(36 )의 다른 소프트웨어에서 분석하기 위해 데이터를 텍스트 파일( 보충 파일 3의 예제 데이터 참조)로 저장합니다.
- 소프트웨어 프로그램 내에서 다음 분석을 완료하십시오. 예제 R 코드는 보충 파일 4 를 참조하십시오.
- 아래의 Eq (3)에 따라 표본 질량 (mg) 당 살충제 (ng)의 복용량을 계산하십시오.
(3) - 사망률을 계산하고 Abbott의 공식37 을 적용하여 각 대조군37에서 관찰 된 사망률과 관련된 사망률을 수정하십시오. 또는 Schneider-Orelli (1947) 공식을 사용하여 사망률을 교정하십시오38. 어느 한 공식으로, 제어 데이터가 비정상적으로 높지 않는 한, 앞서 설명된 바와 같이, 각 대조군(37 )에서 사망률에 관계없이 모든 데이터에 보정을 적용하고(39) 구현하였다(아래 논의 참조).
참고: Abbott의 공식과 슈나이더-오렐리 공식과 같은 동등한 대안은 대조군에서 관찰되지 않은 사망률의 정도에 비례하여 사망률 값을 조정하고 사망률이 100%인 컵의 사망률을 감소시키지 않습니다. 자세한 내용은 이러한 수식에 대해 인용된 참조를 참조하십시오. - 보정된 사망률 데이터를 확률 단위(probability unit) 값40 으로 변환하고 살충제 용량과 변환된 사망률 데이터 사이의 선형 회귀를 수행합니다. 카이-제곱 검정을 사용하여 선형 모델의 적합도를 평가합니다.
참고: 프로빗 변환을 완료하기 전에 0(사망률 0%) 또는 1(사망률 100%)의 사망률 값이 데이터에서 제거됩니다. 이것은 프로빗 변환의 특성 때문에 필요합니다. 따라서 그래프로 표시된 데이터에는 양성 또는 음성 대조군 또는 0% 또는 100% 사망률을 초래한 기타 데이터(Abbott의 교정이 적용된 후)가 포함되지 않습니다. - 이전에 발표된 방법 39,41,42에 따라 시편 균주, 집단 및/또는 성별당 LD50 및95% 신뢰 구간(CI)을 계산합니다.
- 참고: 두 균주의 95% CI가 겹치지 않는 경우, 균주는 상당히 다른 용량 반응을 갖는다.
- 적용 가능한 경우, 관심 균주의 LD50을 기준/제어 균주의LD50으로 나눔으로써 저항비(RR)를 계산한다.
- 아래의 Eq (3)에 따라 표본 질량 (mg) 당 살충제 (ng)의 복용량을 계산하십시오.
(3)
그림 1: 국소 적용 분석 프로토콜 다이어그램. 국소 적용 분석 프로토콜은 (A) 얼음 위에서 표본을 분류하고, (B) 분석 척도로 표본을 칭량하고, (C) 살충제 용액으로 표본을 투약하고, (D) 10 % 수크로오스 용액 Ad libitum (담근 면봉을 통해)에 접근 할 수있는 살충제 노출 후 24 시간의 대기 기간 동안 사망률 평가로 시작합니다. 빨간색 화살표는 모기 (왼쪽)와 초파리 (오른쪽)의 대상 살충제 적용 위치를 나타냅니다. 이미지의 크기를 조정하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
이러한 대표적인 결과는 Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) 및 플로리다로부터의 분리된 필드 균주의 두 가지 상이한 균주를 특징으로 하며, 알려진 녹다운 내성 돌연변이 F1534C 및 V1016I (IICC 유전자형)를 갖는다. 또한, 초파리 멜라노가스터 (광저우 : S 균주)가 특징입니다.
도 2 및 도 3은 상기 프로토콜에 따라 시험된 균주 및 성별에 의한 각 유기체의 용량 반응을 도시한다. 각 균주 내의 수컷 및 암컷 모기의 용량-반응 곡선 사이에 차이가 관찰되지 않았기 때문에(ROCK의 경우 t=1.70, p=0.098 및 IICC의 경우 t=0.64, p=0.527), 각 모기 균주 내의 남녀 모두로부터의 데이터가 풀링되었다. ROCK 및 IICC에 대한 질량 상대화 LD50은 각각 0.008 ng / mg (95 % CI : 0-0.104) 및 0.336 ng / mg (95 % CI : 0.235-0.438)입니다. 이들 값의 95% CI는 겹치지 않으며, 이는 균주의 유의하게 상이한 용량 반응을 나타낸다. IICC 균주의 RR (ROCK 균주에 비해)은 41.7이며, 이는 WHO에 따르면 매우 내성이 높은 것으로 간주됩니다5. 광저우 - S 초파리의 경우, 질량 상대화 된 LD 50은 0.213 ng / mg (95 % CI :0-0.490)입니다.
도 2: 국소 적용 생물검정을 이용한 모기의 대표적인 데이터. 델타메트린 및 모기를 이용한 상기 프로토콜에 따른 국소 적용 생물검정으로부터의 대표적인 용량-반응 데이터: (A) 암컷 Aegypti ROCK (n=880) 및 IICC (n=550) 균주, (B) 수컷 Aegypti ROCK (n=880) 및 IICC (n=569) 균주. 델타 메스 린 테스트 농도는 0.00075 ng / μL에서 9.68705 ng / μL까지 다양했으며 평균 모기 질량 (mg) 당 적용된 델타 메스 린 (ng)의 용량은 x 축에 반영됩니다. 사망률은 y축의 비율로 표시됩니다. 각 데이터 포인트 클러스터를 통과하는 검은 선은 변형률 및 성별별 선형 회귀를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 국소 적용 생물검정을 이용한 초파리의 대표적인 데이터. 델타메트린 및 초파리를 이용한 상기 프로토콜에 따른 국소 적용 생물분석으로부터의 대표적인 용량-반응 데이터: D. melanogaster Canton-S 균주 (n=1014). 델타 메스 린 시험 농도는 0.00499 ~ 5.02876 ng / μL의 범위였으며 평균 초파리 질량 (mg) 당 적용된 델타 메스 린 (ng)의 용량은 x 축에 반영됩니다. 사망률은 y축의 비율로 표시됩니다. 검은색 선은 선형 회귀를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1 : 벤치 탑 곤충 취급 텐트. 벤치 탑 곤충 취급 텐트는 국소 적용 분석 중에 모기 또는 파리를 탈출하는 것을 쉽게 포획하는 데 사용됩니다. 구조는 A 에서 닫히고 B에서 열립니다. 이 구조는 PVC 파이프와 미세 메쉬 직물로 지어졌습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 주사기 및 리피터 어플리케이터 장치. 곤충 투약에 사용되는 주사기 및 중계기 어플리케이터 장치. 주요 부품에는 1) 바늘, 2) 주사기 배럴, 3) 플런저, 4) 리피터 및 5) 리피터 버튼이 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 무작위 화 스크립트 : 무작위화 스크립트는 각 실험의 모든 컵에 대해 편향되지 않은 레이블을 만듭니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2 : 사망률 점수 시트 : 사망률 평가를 돕기 위한 사망률 점수 시트. 시트에는 살충제 적용 시작 및 종료 시간과 같이 프로토콜에서 참조되는 다른 모든 중요한 정보를 기록 할 수있는 장소도 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : 사망률 데이터 예 : 그림 2를 만드는 데 사용되는 예제 데이터 파일. 열 제목 설명은 다음과 같습니다: "id" = 각 데이터 포인트의 식별 코드; "종" = 종 이름 (예를 들어, 에데스 애석티); "살충제"= 국소적으로 적용되는 살충제의 이름 (예를 들어, 델타 메트린); "균주" = 모기 균주의 명칭 (예를 들어, ROCK); "날짜"= 시작 날짜 국소 응용 프로그램; "섹스"= 모기의 성별; "나이"= 모기의 나이 (젊은 = 3-5 일, 나이 = 4 주); "total.mosq"= 배치로 무게가 나가는 모기의 총 수; "무게"= 배치 내의 모든 모기의 무게 (mg); "농도"= 살충제의 농도 (μg / mL); "주사기" = 주사기의 액적 부피(mL); "용량" = 각 모기에 적용되는 살충제 활성 성분의 양(ng); "전체"= 각 컵에있는 모기의 수; "죽은"= 각 컵에있는 죽은 모기의 수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4 : R 분석 코드 : Probit 분석을 완료하는 데 사용할 수 있는 예제 R 코드(프로토콜의 단계 8에 설명된 대로). 대표적인 결과(보충 예제 데이터 파일을 통해 액세스할 수 있음)를 이 R 코드와 함께 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 논문은 모기 및 초파리에 대한 국소 적용 분석을위한 적응 된 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 최소한의 특수 장비가 필요하기 때문에 현장 및 다른 유기체와 함께 사용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계, 잠재적 수정, 문제 해결 조언, 방법의 제한 사항 및 이 방법의 중요성은 아래에 설명되어 있습니다.
프로토콜의 중요한 단계: 프로토콜에는 세 가지 중요한 단계가 있는데, 잘못 완료되면 생물 분석의 결과에 큰 영향을 줄 수 있습니다 : 살충제 농도 정확도, 표본 녹다운 및 사망률 평가.
살충제 농도 정확도 :
복제 가능한 용량 반응 곡선과 의미있는 결과를 얻기 위해 정확한 살충제 솔루션을 갖는 것이 매우 중요합니다. 살충제 용액 제제에 대한 용적 접근법은 CDC 병 생물 검정7 및 국소 적용13,14,43 모두에 대한 문헌 내에서 더 일반적이다. 그러나, 여기에 기술된 중량 측정 접근법은 본질적으로 (온도-특이적) 밀도의 포함을 통한 온도의 고려로 인해 더 정확하고, 보다 정확한 제제 제제로 이어진다.
표본 녹다운:
표본을 녹다운하는 것은이 방법의 중요한 구성 요소이며 살충제를 정확하게 투여하고 무게를 측정 할 수 있습니다. 그러나 유기체를 무너뜨리는 것은 필연적으로 이전에 입증 된 것처럼 신체적 스트레스와 손상의 위험을 포함합니다30. 따라서 i) 각 표본이 비슷한 기간 동안 녹다운되고, ii) 녹다운의 길이가 최소한으로 유지되고, iii) 녹다운의 방법이 모든 시편에서 일관되게 유지되도록 시편을 녹다운할 때 주의하고 주의해야 합니다. 또한 살충제 적용 전에 녹다운 방법을 별도로 테스트하여 방법이 성공하고 10 % 이상의 통제 사망률을 유도하지 않는지 확인하는 것이 좋습니다. 경험이 없는 사용자의 경우 초기 테스트가 더 오래 걸릴 수 있으며, 이로 인해 녹다운 시간이 길어질 수 있습니다. 따라서 첫 번째 분석의 결과를 해석 할 때는주의해야합니다.
사망률 평가:
사망률을 평가하는 것은 특히 살충제가 완전히 죽이지는 않지만 모기를 쓰러 뜨리거나 불구로 만들 때 어려울 수 있습니다. 따라서 살충제가 표적 유기체에 어떻게 영향을 미치는지 인식하고 시작하기 전에 "죽은"(또는 쓰러진) 유기체에 대한 명확한 정의를 갖는 것이 중요합니다. 또한, 변동을 줄이기 위해 동일한 사람이 복용량과 반복실험 사이의 사망률을 평가하도록하는 것이 좋습니다.
프로토콜 수정: 아래에 설명된 몇 가지 수정 사항을 이 프로토콜에 적용하여 다목적성과 접근성을 향상시킬 수 있습니다.
더 작거나 큰 크기의 곤충에 분석을 적용:
더 작거나 큰 표본을 사용할 때는 각각 더 작거나 큰 용량의 살충제를 적용하는 것이 좋습니다. 일례로, 우리는 0.5 μL 용량을 0.2 μL 용량으로 감소시킴으로써 초파리에 모기 프로토콜을 적응시켰다. 선택한 용량 부피에 대해 올바른 주사기 크기가 선택되었는지 확인하십시오.
현장 곤충에 대한 분석 적응 :
들판 곤충을 사용할 때, 곤충 크기에 더 많은 변화가있을 수 있습니다. 따라서 곤충을 더 작은 그룹 (예 : 컵 당)으로 칭량하는 것이 큰 그룹 (예 : 한 실험에 사용 된 모든 곤충) 대신 권장됩니다. 이것은 현장 곤충 질량의 차이와 관련된 살충제 감수성의 잠재적 인 변화를 포착하는 데 도움이 될 수 있습니다.
장비 개조:
곤충 취급 텐트 : 표본의 투약은 PVC 파이프와 모기장으로 간단하게 건설 된 곤충 처리 텐트 아래에서 완료 할 수 있습니다. 이것은 밀폐 된 방 (예 : 곤충)에 대한 대안이 될 수 있으며 곤충 사육이 발생할 수있는 지역에서 잠재적 인 살충제 오염을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 곤충 취급 텐트는 건설하기 쉽고 저렴한 비용 (~ $ 70)입니다. 또는 곤충 취급 케이지를 구입할 수 있습니다 (~ $ 425).
차가운 테이블 : 얼음 팩 또는 얼음 쟁반은 표본을 쓰러 뜨리거나 표본을 떨어 뜨린 상태로 유지하는 데 사용할 수 있습니다.
인큐베이터 : 인큐베이터는 살충제 처리 후 표본을 사육하고 표본을 24 시간 동안 유지하는 것이 좋습니다. 인큐베이터를 사용할 수없는 경우 인큐베이터를 건설 할 수 있습니다. 인큐베이터를 구축하는 데 필요한 장비에는 절연 컨테이너, 가습기, 열 케이블, 습도 및 온도 컨트롤러, 그리고 이전의 방법(44)에 따라 확장되는 ~$170의 총 비용을 합산해야 하는 조명이 포함된다.
컵 보유 : 플라스틱 컵이 처리 된 표본을 분류하고 보관하는 데 사용되지만 왁스 줄 지어있는 종이 컵 또는 유리 용기가 적합한 대안이 될 것입니다.
유기체 및 생활 단계 수정 :
이 방법은 Culex quinquefasciatus 모기 (32),집 파리 (32) 및 바퀴벌레 (45)와 같은 다른 벡터, 곤충 및 / 또는 절지 동물뿐만 아니라 모기 유충(46)과 같은 비 성인 생활 단계와 함께 사용하기에 매우 적응가능하다.
국소 응용 프로그램 위치 수정 :
이 방법은 모기 (및 초파리의 경우 등받이)에 대한 복부 흉부 및 복부 영역에 살충제를 적용하는 것을 설명합니다. 그러나 노출 사이트가 일관성이 있는 한 다른 응용 프로그램 위치를 사용할 수 있습니다. 살충제 민감도는 적용 위치(32)에 따라 달라질 수 있기 때문에 일관성이 중요하다.
문제 해결 조언 : 이 방법에는 처음에는 어려운 몇 가지 단계가 있습니다. 다음은 발생할 수있는 가장 일반적인 문제 중 일부입니다.
누출 / 증발 살충제 솔루션 :
살충제는 일반적으로 휘발성이 높은 화합물 인 아세톤에 용해됩니다. 이것은 아세톤이 실온에서 빠르게 증발하여 시간이 지남에 따라 살충제 농도가 증가한다는 것을 의미합니다. 살충제 용액이 누출되거나 증발하는 것처럼 보이면 용액을 다시 만들고 튜브의 뚜껑이 단단히 켜져 있는지 확인한 다음 저장 프로토콜이 제대로 준수되고 있는지 다시 확인하십시오 (예 : 파라 필름이 사용되고 튜브가 똑바로 보관되어 있음). 누출이 지속되면 튜브를 더 낮은 부피로 채워서 아세톤이 다른 온도에서 경험하는 부피 변화를위한 더 많은 공간을 확보하십시오. 추가적으로, 아세톤을 용매로서 사용하는 경우, 튜브가 아세톤 저장(예를 들어, FEP, TFE 및 PFA 플라스틱)에 대해 정격화되었는지 확인하십시오. 소수성 살충제를 사용하는 경우 유리 병에 용액을 보관하십시오 (소수성 살충제가 플라스틱보다 유리에 부착되기 때문에). 증발을 모니터링하기 위해 보관하기 전에 용액의 메니스커스를 표시하는 것도 좋은 방법입니다.
유기체를 칭량할 때 미세 균형에 표류하는 무게:
스케일의 무게 판독값이 표류하는 경우 (천천히 위 또는 아래로 이동), 이는 정적일 수 있습니다. 드리프트는 플라스틱 품목에서 유기체를 계량 할 때 가장 자주 발생하며, 플라스틱은 정전기를 쉽게 보유 할 수 있기 때문입니다. 이를 피하기 위해 칭량되는 플라스틱 용기 아래에 계량 용지를 놓거나 유리와 같은 비 플라스틱 용기를 사용할 수 있습니다.
비정상적인 사망 결과 :
사망률 결과가 비정상적으로 보일 수있는 여러 가지 방법이 있습니다 (예 : 대조군에서 높은 사망률 또는 모든 살충제 복용량에서 높은 / 낮은 사망률을 관찰하는 것). 각 시나리오의 문제 해결을 위해 다음 사례를 검토합니다.
높은 통제 사망률
대조군(10% 이상)에서 높은 사망률이 있는 경우, 녹다운 방법과 표본이 녹다운되는 시간을 평가한다. 가능하면 표본이 무너지는 시간을 단축하십시오. 대조군에서 높은 사망률을 위해 고려해야 할 다른 잠재적 요인으로는 i) 인큐베이터 설정이 올바른지 확인하는 것, 비정상적인 온도 및 / 또는 습도로 인해 사망률이 증가 할 수 있는지 확인하는 것이 포함됩니다. 온도와 습도는 독립적인 데이터 로거로 확인해야 합니다. ii) 곤충 취급 평가. 곤충을 너무 많이 또는 너무 대충 다루면 사망률이 높아질 수 있습니다. iii) 대조군 또는 계측기를 치료하는 데 사용되는 100 % 아세톤에 살충제 오염이 없는지 확인합니다. 아세톤을 교체하고 아세톤 또는 에탄올로 모든 악기를 청소하십시오. 장갑을 자주 교체하고, 유출을 방지하고, 장비를 청소하여 오염을 피하십시오. 보충 파일 3에서는 최대 두 마리의 모기가 통제 (아세톤 전용) 컵 내에서 사망했습니다. 이 사망률은 높은 것으로 간주되지 않으므로 (10 % 미만) 걱정할 이유가 없었습니다.
모든 노출 된 그룹에서 높은 사망률 (그러나 대조군에서는 아님)
테스트를 위해 더 낮은 살충제 농도 또는 더 적은 용량의 양을 사용하십시오. 사용 된 복용량은 사망률을 유도하지 않는 최소 용량 이상일 수 있습니다. 여러 10 배 희석액을 사용하여 올바른 용량 범위를 확인하고 오염을 배제하십시오. 오염을 피하려면 가장 낮은 농도로 투약을 시작하고 최고 농도로 작업하십시오. 또한 사용 된 모든 장비를 아세톤 및 / 또는 에탄올로 정기적으로 청소하고 시편에 적용되는 복용량이 매우 적으며 사소한 교차 오염조차도 결과에 영향을 줄 수 있는지 확인하십시오.
모든 노출 된 그룹에서 낮은 사망률
더 높은 살충제 농도를 사용하십시오. 사용 된 복용량은 모두 인구에서 사망률을 유발하기에는 너무 낮을 수 있습니다. 정확한 용량 범위를 확인하려면 표본을 몇 가지 10배 더 농축된 용량에 노출시키십시오. 살충제 용액이 만료되거나 분해되지 않았는지 확인하십시오 (잠재적으로 고온 또는 빛 노출로 인해). 솔루션이 만료되었거나 성능이 저하된 것으로 의심되는 경우 솔루션을 다시 만들고 적절한 보관 조건을 준수하는지 확인하십시오.
반복실험/일 사이의 일관성 없는 사망률
곤충이 살충제에 노출되는 시간은 특히 대사 저항성34에 대해 표현 된 내성 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 사망률의 변화에 기여하는 잠재적 변수로서 하루 중 시간을 피하기 위해 매일 같은 시간 동안이 프로토콜을 반복하십시오. 반복실험 사이의 일관성 없는 사망률에 기여하는 다른 잠재적 요인으로는 i) 실험 간에 차별적으로 사육되는 표본이 포함된다. 모든 표본이 동일한 연령 범위이고 동일한 온도와 유사한 밀도 및 식품 가용성에서 사육되었는지 확인하십시오. ii) 살충제 농도가 시간이 지남에 따라 저하되거나 아세톤 증발로 인해 더 농축됩니다. 솔루션을 리메이크하고 적절한 보관 조건을 보장하십시오. iii) 일관성없는 사망률 점수. 동일한 사람이 사망률을 기록하도록 보장하거나 팀 전체에서 일관되게 사용할 수 있는 명확한 프로토콜을 개발하십시오. 블라인드 스코어링을 사용하여 사망률 점수의 편향을 줄입니다.
분류 트레이의 표면에 달라 붙는 곤충 :
아세톤은 페트리 요리와 같은이 프로토콜에 사용 된 플라스틱에 반응합니다. 시편은 Petri 접시 또는 유사한 플라스틱 표면에 아세톤을 사용하는 경우 표면에 부착 될 가능성이 큽니다. 이러한 접착력은 계량 용지로 분류 트레이를 라이닝하거나 플라스틱이 아닌 분류 트레이를 사용하여 피할 수 있습니다. 또한 분류 트레이 또는 홀딩 컵의 플라스틱 표면에 응축되면 곤충이 응축에 달라 붙거나 표본이 너무 차가워서 표면에 얼어 붙을 수 있습니다. 녹다운 방법을 조정하여 응결을 줄이면서 시편이 너무 차가워지거나 얼어붙는 것을 방지합니다(예: 시편과 플라스틱 분류 트레이 사이에 칭량 용지 놓기).
R 분석 오류 :
사망률 데이터가 수집되면 분석 중에 다양한 합병증이 발생할 수 있습니다. R 코드가 데이터 파일에 대한 액션을 완료할 수 없는 가장 일반적인 이유는 데이터 포맷이 코드(예: 열 머리글 및/또는 빈 셀)와 일치하지 않기 때문입니다. 더 심각한 합병증이 발생하면 Rstudio35에 내장된 R 도움말 페이지를 참조하십시오.
전술한 국소 적용 방법의 한계:
국소 적용 방법을 통한 살충제 흡수는 자연 노출을 모방하지 않습니다.
일차 신체에 국소 적용은 살충제 흡수의 자연스러운 방법이 아닙니다. 현장에서 곤충은 대부분 복부 표면에 빠르게 노출되기보다는 작은 에어로졸 입자47,48을 통해 살충제 처리 표면 또는 날개와 접촉하는 시간 동안 다리를 통해 살충제를 흡수합니다. 그러나 알려진 살충제 복용량을 직접 적용하면 유전 적 및 진화 적 연구 또는 공간 또는 시간에 걸친 살충제 감수성의 비교에 필요한 살충제에 대한 표현형 반응을 정확하게 확립 할 수 있습니다. 따라서, 이 접근법은 기술적 저항을 시험하는 데 유익하지만, 실질적인 저항(현장 설정(15)에서의 실제 개입 도구의 효능)을 직접적으로 측정하지는 않을 것이다. 그러나 현재의 표준 방법 (예 : WHO 튜브 테스트 및 CDC 병 생물 분석)은 현장에서 에어로졸 (즉, 포깅에 의해) 살충제 노출을 포획하거나 모방 할 수 없다는 점에 유의해야합니다.
국소 적용 분석은 접촉 흡수 살충제 만 평가할 수 있습니다.
이 방법은 살충제의 접촉 및 흡수를 통해 작동하는 살충제를 대상으로하며 매력적인 독성 설탕 미끼49에 일반적으로 사용되는 붕산과 같은 구강 살충제와 함께 사용하지 않습니다.
방법의 중요성 :
국소 적용 방법은 치사량 (농도가 아님)을 계산하고 기술적 (실용적이지 않은) 내성을 측정함으로써 살충제 생물 검정에 대한 잘 확립 된 표준을 확장합니다15. 아래는 기존의 살충제 감수성 분석에 비해이 방법의 장점과 단점입니다.
치사 용량 계산:
이 방법은 CDC 및 WHO 생물 분석법이 차별적 인 용량11을 확립하기 위해 사용하는 치사 농도보다는 살충제의 치사량을 결정합니다. 치사량은 사망률을 유발하는 것으로 알려진 살충제의 정량화 된 양이기 때문에 더 의미가 있습니다. 대조적으로, 치명적인 농도는 유기체가 실제로 얼마나 많은 살충제를 섭취하는지 고려하지 않습니다. 치사량 계산을 사용할 때, 성별 또는 크기 의존적 감수성 프로파일 간의 차이를 보다 정확하게 관찰하고 정량화할 수 있으므로 이 측정은 더욱 다양해질 수 있습니다.
기술적 저항:
이 방법은 표준화되고 통제된 환경에서 측정되는 저항인 기술적 저항을 평가합니다. 이러한 측정은 살충제 내성의 확산을 감시하고 표현형 저항을 잠재적 마커(15)와 연결하는데 적합하다. 국소 적용 생물 분석으로 인한 사망률의 감소 된 변화로 인해 새로운 저항 마커의 더 나은 식별이 가능합니다. 그러나, 모기에 대한 살충제의 부자연스러운 노출로 인해,이 분석은 특정 집단에서 특정 개입의 효능 추정에 적합하지 않습니다. 이러한 실용적인 저항의 측정을 위해 다른 분석이 필요하다(15).
견본 적응성:
이 방법은 작물 해충 (예를 들어, 콜로라도 감자 딱정벌레), 집 해충 (예를 들어, 바퀴벌레 및 침대 벌레), 또는 수분제 (예를 들어, 꿀벌)와 같은 다른 중요한 절지 동물에 대해 시행 될 수 있으며, 녹다운 접근법 및 / 또는 살충제 용량, 부피 및 / 또는 농도 (위에서 설명한 바와 같이)에 대한 간단한 변경으로 시행 될 수 있습니다. 적응의 용이성은 다양한 연구 분야에서 살충제 내성 연구를 비유하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표본의 50%를 죽이는 치사농도 대신 LD50 값(LC50)을 사용하면 여러 종을 정확하게 비교할 수 있습니다.
비용:
CDC 병 생물 분석 및 WHO 튜브 테스트와 유사하게, 국소 적용 분석을 실행하는 데 드는 비용은 최소화됩니다 ( 재료 표 참조). 필수 장비는 주사기 (약 $ 70)와 디스펜서 (약 $ 100)이며, 이는 분석을 통해 재사용 할 수 있습니다.
필요한 표본의 수:
국소 적용 분석 컵 당 최소 20-25 개의 표본을 사용해야합니다. 실험 당 최소 다섯 가지 살충제 농도를 테스트하는 것이 좋으며 절차에 최소 세 번의 반복실험이 권장됩니다. 전반적으로, 이것은 WHO 튜브 테스트 또는 CDC 병 생물 검정을 사용하여 저항 강도 테스트를 수행하는 데 필요한 표본의 수와 비교할 수있는 완전한 테스트에 필요한 최소 300-375 개의 표본을 초래합니다. 그러나, 국소 적용 생물검정으로 감소된 가변성이 달성된다면, 동일한 수의 표본은 공간 또는 시간에 걸친 감수성 데이터를 비교하기 위해 더 많은 통계적 검정력을 초래할 수 있다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)이 SH에 수여 한 CAREER Award에 의해 수상 번호 2047572로 지원되었습니다. 우리는 초파리 사육 및 국소 적용 분석 준비에 도움을 준 Damien Rivera, 광저우 - S 초파리 균주를 공유 한 위스콘신 - 매디슨 대학의 Ganetzky 박사, 록펠러 균주를 공유하기위한 질병 통제 및 예방 센터, IICC 이소린 균주를 공유하기위한 미국 농무부 의료 농업 및 수의학 곤충학 센터에 감사드립니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/44846 (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/204588 (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , http://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241511575/en/ (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , https://www.cdc.gov/zika/pdfs/CONUS-508.pdf (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/70070 (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , https://www.r-project.org/ (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , https://naarm.org.in/VirtualLearning/vic/e-chapters/Probit_Analysis-ravichandran.pdf (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , Cambridge University Press. Cambridge, England. (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. Roush, R. T., Tabashnik, B. E. , Springer. Boston, MA. (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
