使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用

摘要

本文介绍了一组用于表征蛋白质与细胞或微囊泡膜相互作用的方法。

摘要

在人体内，大多数与免疫反应和血液凝固相关的重要生理反应均发生在细胞膜上。任何依赖膜的反应的重要第一步是蛋白质与磷脂膜的结合。目前已有采用荧光标记蛋白质和流式细胞术来研究蛋白质与脂质膜相互作用的方法。该方法可用于研究活细胞以及天然或人工磷脂囊泡中的蛋白质-膜相互作用。此方法的优势在于试剂和设备简单且易于获取。在该方法中，蛋白质通过荧光染料进行标记，但也可使用自制或商业化的荧光标记蛋白质。蛋白质与荧光染料偶联后，与磷脂膜来源（微囊泡或细胞）共同孵育，随后通过流式细胞术分析样品。所获得的数据可用于计算动力学常数和平衡解离常数 K_d。此外，还可利用特殊的校准微球估算磷脂膜上蛋白质结合位点的大致数量。

引言

生物膜将动物细胞的内部成分与细胞外空间分隔开来。需要注意的是，细胞生命周期中形成的微囊泡以及细胞器也均由膜结构包裹。细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。膜蛋白具有信号传导、结构支持、物质运输和黏附等多种功能。然而，脂质双分子层对于动物细胞与细胞外空间之间的相互作用同样至关重要。本文提出一种研究外源性蛋白质与脂质膜外周相互作用的方法。

动物细胞外膜层上发生的反应最显著的例子是血液凝固反应。血液凝固的一个重要特征是，所有主要反应均发生在细胞及其衍生的微囊泡的磷脂膜上，而非血浆中^1,2,3。依赖膜的反应包括凝血启动过程（在内皮下层细胞、炎症内皮细胞或活化的免疫细胞的细胞膜上，由组织因子参与）；凝血级联反应中因子IX、X和凝血酶原的主要激活反应；凝血酶在活化的血小板、红细胞、脂蛋白和微囊泡膜上对因子XI的激活；蛋白C通路的反应；凝血酶在内皮细胞膜上被灭活的过程（由血栓调节蛋白辅因子、内皮蛋白C受体和硫酸乙酰肝素参与）；以及接触激活通路的反应（在血小板和某些微囊泡膜上，由未知辅因子参与）。因此，若不研究各种血浆蛋白与血细胞膜之间的相互作用，就无法深入研究血液凝固过程。

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于表征蛋白质与细胞或微囊泡脂质膜之间的相互作用。该方法最初被提出用于研究血浆与血小板及人工磷脂囊泡之间的相互作用。此外，大多数被研究的蛋白质可直接与带负电荷的膜磷脂相互作用，特别是与磷脂酰丝氨酸^4,5。同时，也存在一些蛋白质，其与膜的相互作用是通过特异性受体介导的⁶。

流式细胞术的一个重要能力是在无需额外分离步骤的情况下区分游离配体与结合配体。细胞术的这一特性使得研究人员能够在终点研究配体的平衡结合状态，并有助于进行连续的动力学测量。该技术操作简便，不需要复杂的样品制备过程。流式细胞术已被广泛用于定量研究荧光肽、受体和G蛋白在完整或去污剂通透性中性粒细胞中相互作用的动力学过程⁷。该方法还可用于实时探索蛋白质-DNA相互作用以及核酸内切酶活性的动力学⁸。随着时间的发展，该技术已被用于定量研究高亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用，例如与纯化的脂质囊泡之间的相互作用⁹，或更广泛地，与在高效Sf9细胞表达系统中表达的膜蛋白之间的相互作用¹⁰。此外，已有定量方法被报道用于利用流式细胞术表征跨膜蛋白与脂质体之间的蛋白质-脂质体相互作用¹¹。

该技术使用自制的校准微球，以避免使用 commercially available 微球⁷。先前使用的校准微球⁷专为荧光素设计，这在实质上限制了可用于蛋白质的荧光配体种类。此外，本文提供了一种新的方法，可用于获取和分析具有合理时间分辨率的动力学数据。尽管本方法以人工磷脂囊泡为例进行描述，但其在应用于细胞、天然囊泡或具有不同脂质组成的人工磷脂囊泡时，并无明显限制。本文所述方法可估算相互作用参数（k_on、k_off）和平衡参数（K_d），并有助于对膜上蛋白质结合位点数量进行定量表征。需注意，该技术仅能对结合位点数量提供近似估计。该方法的优点在于其相对简单、易于实施，并可适用于天然细胞以及天然和人工微囊泡。

方案

1. 荧光蛋白标记

1. 材料准备
   1. 配制 1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 9.0，4 °C 保存，一周内使用。
   2. 使用前立即配制 1.5 M 盐酸羟胺缓冲液，pH 8.5。
   3. 在二甲基亚砜中配制 10 mg/mL 的荧光染料溶液（参见材料表）。
      注：该溶液可在 -20 °C 避光保存一个月。
   4. 将纯化的抗体或其他蛋白质配制成 1–10 mg/mL 的溶液。
      注：避免使用含铵离子或伯胺的缓冲液。通过透析将含 Tris 或甘油的缓冲液置换为磷酸盐缓冲盐水（PBS）。叠氮化钠（≤3 mM）或硫柳汞（≤1 mM）不会显著影响偶联反应。
   5. 将用于蛋白质纯化的凝胶过滤介质（参见材料表）在室温下置于 PBS 中孵育过夜，或在 60 °C 孵育 2 小时。将凝胶过滤介质装入带有 0.2 µm 膜的离心柱中。
2. 根据待标记蛋白质的浓度，使用公式（1）计算每次反应所需的活性染料用量。
   
   其中 V_dye 为染料储备液的体积；C_pr、V_pr 和 MW_pr 分别为蛋白质的浓度、体积和摩尔质量；MW_dye 为染料的摩尔质量；100 为单位换算系数；MR 为反应体系中染料与蛋白质的摩尔比。
   注：IgG 标记反应推荐使用以下 MR 值：当抗体浓度为 1–3 mg/mL 时，MR = 40；当抗体浓度为 4–10 mg/mL 时，MR = 30。对于凝血因子，通常使用 MR = 5。
3. 偶联反应
   1. 在反应管中，将蛋白质溶液与体积为其 1/10 的 1 M 碳酸氢盐溶液混合。
   2. 边持续搅拌边加入所需量的荧光染料（见步骤 1.2）。
   3. 将反应混合物在室温下避光孵育约 1 小时，并持续搅拌。
   4. 每 200 µL 蛋白质溶液中加入 5 µL 的 1.5 M 盐酸羟胺。
   5. 将反应混合物在室温下避光孵育约 30 分钟，并持续搅拌。
4. 准备离心柱
   1. 向柱中加入 500 µL 用于蛋白质纯化的凝胶过滤介质。以 1,000 × g 离心 3 分钟。
   2. 弃去收集管中的缓冲液。若柱未填满，补充更多凝胶过滤介质，并以 1,000 × g 离心 3 分钟。重复此步骤直至柱完全填满。
5. 纯化
   1. 将反应混合物（来自步骤 1.3.5）以 17,000 × g 离心 5 分钟，去除沉淀。
   2. 将上清液转移至含有凝胶过滤介质的离心柱中，使溶液渗入凝胶床。
   3. 使用空的收集管承接离心柱，并以 1,000 × g 离心 5 分钟。离心后，从收集管中收集标记的蛋白质。
6. 标记程度的测定
   1. 通过测量游离染料在 280 nm 处的吸光度（A₂₈₀）以及染料的λ_max处的吸光度（A_max），校正染料对A₂₈₀吸光度的贡献（见公式（2））。
          （2）
   2. 测量蛋白-染料偶联物在 280 nm 处的吸光度（A₂₈₀）以及染料在λ_max处的吸光度（A_max），并使用公式（3）计算蛋白质浓度。
          （3）
      其中 ε_M 为蛋白质在 280 nm 处的摩尔消光系数；d 为吸光度测定时的光程长度；CF 为染料对 A₂₈₀ 吸光度的贡献（步骤 1.6.1）。
   3. 使用公式（4）计算标记程度（DOL）。
          （4）
      其中 ε_{M dye} 为染料在 λ_max nm 处的摩尔消光系数；d 为吸光度测定时的光程长度；C_protein 为蛋白质浓度（步骤 1.6.2）。

2. 磷脂囊泡的制备

1. 脂质混合物的制备与保存
   1. 按适当比例混合脂质（磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱的摩尔比为20%至80%）。
   2. 经冻干或蒸发干燥脂质混合物后，将其在惰性气氛下保存于玻璃安瓿瓶中。
2. 脂质膜的制备
   1. 打开安瓿瓶，用少量氯仿（约100 µL）重新悬浮脂质混合物。
      注意：氯仿用量不宜过多，因其无法完全挥发。
   2. 加入终浓度为0.2 mol%的DiIC16(3)乙醇溶液。将脂质混合物转移至圆底烧瓶中，通过旋转烧瓶使混合物均匀铺展于瓶壁。在氩气流下干燥脂质混合物30分钟。
3. 脂质混合物的水合
   1. 向含有脂质膜的烧瓶中加入适量温热（约55 °C）的水相缓冲液（20 mM HEPES，140 mM NaCl，pH 7.4），体积应与预期的脂质浓度相对应。在55 °C下涡旋孵育30分钟，以确保充分水合。
   2. 将样品管置于冷冻设备或恒温设备中，使脂质悬浮液经历3–5次冻融循环。
4. 通过挤出法形成脂质体
   1. 按照制造商说明准备挤出装置。将所有挤出组件预热至脂质混合物的相变温度。
   2. 用一支挤出器注射器吸取水合后的脂质混合物。静置5–10分钟，使脂质悬浮液温度与挤出装置温度达到平衡。
   3. 使脂质混合物至少通过膜过滤10次。最后一次挤出时，将脂质悬浮液转移至另一支注射器中，并观察其外观由微浊变为澄清。
   4. 将所得脂质体混合物在4 °C下保存，最好置于氩气或氮气等惰性气氛中，保存时间为3–4天。切勿冷冻。

3. 从全血中分离血小板

1. 使用含有3.2%柠檬酸钠的采血管从健康供体采集全血。
2. 向血液中加入前列腺素E1（PGE1）（1 µM）和腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase）（0.1 U/mL），随后在室温下以100 × g 离心8分钟。
3. 离心后，取富血小板血浆，并加入柠檬酸钠溶液（106 mM，pH 5.5），使血浆与柠檬酸钠的体积比为3:1。将血浆在室温下以400 × g 离心5分钟。
4. 弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL不含BSA的Tyrode缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，2.7 mM KCl，1 mM MgCl₂，0.4 mM NaH₂PO₄，2.5 mM CaCl₂，5 mM葡萄糖，pH 7.4）中。通过血小板纯化用凝胶过滤介质进行凝胶层析，以去除血浆蛋白，纯化血小板（参见材料表）。

4. 通过流式细胞术检测蛋白质-脂质相互作用

1. 动力学结合实验
   1. 将步骤 2.4.4 中的磷脂囊泡用 Tyrode 缓冲液（20 mM HEPES、150 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、0.4 mM NaH₂PO₄、2.5 mM CaCl₂、5 mM 葡萄糖、0.5% BSA，pH 7.4）稀释至浓度为 1 µM，总体积为 250 µL。
   2. 将步骤 1 中获得的荧光标记凝血因子 X（fX-fd）以 500 nM 浓度与步骤 4.1.1 中的磷脂囊泡按 1:1 比例混合（最终囊泡浓度为 0.5 µM，fX-fd 中 fX 的浓度为 250 nM），总体积为 500 µL。
   3. 立即将 500 µL 混合悬液（以低流速分析约需 20 分钟）注入流式细胞仪。使用低流速，并将 FL2 通道（激发波长 488 nm，发射滤光片 585/42 nm）的阈值设为 200。测量 FL4 通道（激发波长 633 nm，发射滤光片 660/20）中来自材料表中荧光染料的平均荧光强度。
      注：选择无自动进样器的流式细胞仪。这将加快样品注入检测池的过程。
   4. 当结合达到饱和（5 分钟内荧光无显著增加）时，迅速用 Tyrode 缓冲液将样品稀释 20 倍，并监测解离过程，直至荧光恢复至基线水平（完全解离）或达到平台期（5 分钟内荧光无显著下降）。
      注：作为对照，加入 10 µM EDTA 并监测完全解离过程持续 5 分钟。
2. 平衡结合实验
   注：利用结合动力学曲线确定达到饱和所需时间；fX-fd 与人工囊泡的饱和时间为 20 分钟。
   1. 在 Tyrode 缓冲液中，将人工磷脂囊泡（5 µM）与不同浓度的 fX-fd（0 至 1,000 nM）共同孵育 20 分钟，用于结合实验。
   2. 将步骤 4.2.1 中的每个样品用 Tyrode 缓冲液稀释 20 倍，最终体积为 200 µL。在 30 秒内立即使用流式细胞术分析稀释后的样品。采用步骤 4.1.3 中的仪器设置。
      注：为检测非特异性结合，使用含 EDTA（10 µM）的类似样品并孵育 5 分钟作为对照。

5. 流式细胞术数据分析

1. 从流式细胞术数据采集软件中以 FSC 格式导出实验数据至流式细胞仪分析软件（参见材料表）。选择文件 | 导出 | FCS 文件。通过在计算机中选中 FSC 文件并将其拖拽至软件工作区，即可在流式细胞仪分析软件中打开文件进行数据分析。
2. 对微囊泡进行设门：根据亲脂性染料 DiIC₁₆(3) 的荧光信号确定微囊泡所在区域。使用工作表中的菜单命令或绘图按钮，创建以 FL2（染料 DilC₁₆(3)）为纵坐标、SSC 为横坐标的散点图（对数坐标）。点击矩形设门按钮绘制设门区域，确保不含囊泡的对照样本中的事件不落入该区域（图 1B、C）。
3. 分析动力学实验。
   1. 创建点图，以囊泡区域（双击第 5.2 步中的囊泡区域）的荧光信号（FL4）随时间变化为坐标。
   2. 将荧光随时间变化的数据以 csv 格式导出。选择样本 | 右键单击 | 导出 | 选择 FL4 和 参数中的时间 | 选择保存目录 | 选择 CSV 格式 | 导出。
   3. 在任意统计分析软件中打开 CSV 文件（参见材料表），对每 1,000 个事件计算荧光强度和时间的简单移动平均值。
   4. 假设荧光强度的简单移动平均值与时间呈指数关系，拟合其依赖关系曲线（分析 > 拟合 > 非线性曲线拟合），并根据公式（5）计算动力学结合常数。
          （5）
      其中 [X^B] 表示根据第 5.3.3 步的简单移动平均值计算得到的每一时刻结合因子的浓度（自定义单位）；[X] 表示添加因子的浓度；[X]_max 表示最大结合因子浓度；k 为结合常数；t 为时间。
   5. 重复相同的操作步骤（5.3.1–5.3.4），基于公式（6）计算动力学解离常数。
          （6）
      其中 [X^B] 表示每一时刻结合因子的浓度；[X]₀ 表示初始时刻结合因子的浓度；k 为解离常数；t 为时间。
4. 平衡结合实验
   1. 测定在每种选定浓度的 fX-fd 条件下，囊泡区域内 fX-fd 的平均荧光强度。
   2. 假设为简单的单结合位点模型，拟合结合因子荧光强度随添加因子浓度变化的依赖关系。基于至少三次独立重复实验，利用公式（7）计算平均结合参数。
          （7）
      其中 [X^B] 表示结合因子的浓度；[X] 表示添加因子的浓度；n^x 表示每个囊泡上表观结合位点数；K_d 为表观解离常数。

6. 将荧光强度转换为平均结合位点数

1. 准备校准微球。
   1. 将凝胶过滤的血小板（参见步骤 3.3）在室温下与 A23187（10 µM）和 CaCl₂（2.5 mM）共同孵育 10 分钟。
   2. 向活化的血小板中加入不同浓度的 fX-fd（0 至 1,000 nM）。加入 2% v/v 甲醛，孵育 1 小时。随后在室温下用 3 M 甘氨酸和 5% BSA 处理血小板 30 分钟，以终止反应。
   3. 从混合物中纯化去除未反应的染料。将血小板在 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 Tyrode 缓冲液（含 0.5% BSA）中。
      注：重复步骤 6.1.3 三次。
2. 首先使用荧光分光光度计（针对材料表中的荧光染料，激发波长 633 nm，发射波长 670 nm），然后使用流式细胞仪（FL4 通道：激发波长 633 nm，发射滤光片 660/20）测定每个样品中校准微球的荧光水平。使用细胞计数器确定每个样品中微球的数量。
3. 使用荧光分光光度计将各微球样品的荧光强度转换为可溶性荧光染料的浓度。利用公式（8）重新计算每个荧光染料分子对应的浓度。
      (8)
   其中 N_x 为荧光分子数量；C 为荧光染料浓度；N_A 为阿伏伽德罗常数；N_A = 6.02214076×10²³ mol ^-1。
4. 使用任意统计软件（参见材料表），根据每个样品中微球在流式细胞仪中的平均荧光值（步骤 6.2）与荧光分子数（参见步骤 6.3）之间的关系绘制依赖性曲线。通过线性比例拟合该关系（分析 | 拟合 | 线性拟合）。根据公式（9）的拟合结果，计算平均荧光值到结合位点的转换因子。
       (9)
   其中 MF 为流式细胞术测得的微球平均荧光值；Nx 为每个微球上的荧光分子数；CF 表示平均荧光值到结合位点的转换因子。CF 和 b 由线性比例拟合结果获得。
5. 利用公式（10）计算目标囊泡上表观结合位点数。
       (10)
   其中 nx 为每个目标囊泡上的表观结合位点数；MF 为流式细胞术测得的目标囊泡的平均荧光值；CF 和 b 为来自公式（8）的转换因子。

结果

本文所述的流式细胞术用于表征血浆凝血蛋白与活化血小板的结合。此外，采用磷脂囊泡PS:PC 20:80作为模型系统。本论文主要以人工磷脂囊泡为例进行说明。流式细胞仪的参数，特别是光电倍增管（PMT）电压和补偿，必须根据每台具体仪器、研究对象（细胞、人工或天然微囊泡）以及所用染料进行优化选择。图1B、C展示了对大小约为1 µm、并掺入亲脂性荧光染料DiIC16(3)的人工磷脂囊泡进行设门的示例。较大的囊泡尺寸和亲脂性荧光染料有助于通过流式细胞仪检测这些囊泡。设门依据是含有相同尺寸但不含荧光染料的人工脂质囊泡的样本（图1B）。分析中仅使用该门内事件的数据。

首先分析了蛋白质与囊泡结合的动力学。该步骤的样品按照步骤4.1所述连续收集。典型的点图如图1D-F所示。所得数据使用流式细胞术软件进行分析，结果曲线见

讨论

该方法可适用于对来源于不同来源和组分的蛋白质与磷脂膜相互作用进行粗略表征。本文所述的定量流式细胞术在多个参数上逊于表面等离子共振（SPR）技术，尤其表现为灵敏度较低、时间分辨率较差，且需要对蛋白质进行荧光标记。荧光标记可能导致许多蛋白质构象改变或活性丧失，因此需进行严格对照。然而，该技术相较于其他方法具有显著优势：它能够研究蛋白质与天然细胞膜之间的相互作用，而此类研究难以通过SPR实现；此外，该方法可估算膜表面蛋白质结合位点的数量，在某些分析任务中具有较高效率。

市面上有针对某些荧光染料的商用微珠可用于计数结合位点。然而，许多广泛使用的染料尚无对应的商用微珠。因此，自制微珠是解决此问题的最佳方法。制备这些微珠所用的细胞与所有其他实验中使用的细胞相同。但由于微珠在洗涤过程中需要较高的离心速度，因此不能使用磷脂囊泡。不过，细胞或囊泡可被带有氨基反应性基团的微珠替代，后者可与所选染料进行偶联。操作步骤将与第6.1步中描述的步骤类似。

该定量流式细胞术方法的局限性与所用流式细胞仪的技术性能相关。已有三种不同型号的流式细胞仪（配备不同的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）	Thermo Fisher Scientific	A37573	荧光染料
马铃薯来源的腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase）	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
牛血清白蛋白	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
氯化钙，无水，粉末，≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Cary Eclipse 荧光分光光度计	Agilent
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3)（1,1'-二十六烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
乙二胺四乙酸二钠盐	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		流式细胞术数据采集软件
FlowJo	Tree Star		用于数据分析的流式细胞仪软件
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
人凝血因子 X	Enzyme research	HFX 1010
盐酸羟胺	Panreac	141914.1209
L-α-磷脂酰胆碱（脑组织，猪源）	Avanti Polar Lipids	840053P
L-α-磷脂酰丝氨酸（脑组织，猪源）（钠盐）	Avanti Polar Lipids	840032P
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		统计分析软件
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，生物技术级	VWR Life Science AMRESCO	97062-732
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541-500G
前列腺素 E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	用于蛋白质纯化的凝胶过滤介质
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	用于血小板纯化的凝胶过滤介质
碳酸氢钠	Corning	61-065-RO
氯化钠	Sigma Aldrich	S3014-500G
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S3139-250G
带 0.2 µm 膜的离心柱	Sartorius	VS0171
柠檬酸三钠二水合物	Sigma Aldrich	S1804-1KG