本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
勘误通知
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
摘要
摘要
视网膜色素上皮（RPE）层位于光感受器后方，具有复杂的代谢系统，在维持光感受器功能方面发挥多种关键作用。因此，RPE的结构与功能对于维持正常视觉至关重要。本文介绍了一种已建立的小鼠原代RPE细胞分离方案。RPE分离是研究不同小鼠眼病模型中RPE病理机制的重要工具。此外，RPE分离有助于比较来自野生型与基因修饰小鼠的原代RPE细胞，并可用于测试药物，从而加速视觉障碍治疗策略的开发。本文提供了一步一步的RPE分离操作流程，整个过程从眼球摘除到细胞接种约需4小时。接种后5–7天内不应更换培养基，以确保分离细胞在无干扰条件下生长。随后对细胞的形态、色素沉积及特异性标志物进行表征分析 视网膜色素上皮，原代细胞分离，小鼠模型，眼部疾病，细胞培养，光感受器，代谢功能，分子机制，药物筛选，细胞表征 通过 免疫荧光。细胞最多可传代三到四次。
引言
视网膜色素上皮（RPE）细胞位于脉络膜与神经视网膜之间，形成一层简单的立方形细胞单层，位于光感受器（PR）细胞后方1视网膜色素上皮（RPE）在维持光感受器细胞的健康环境中起着关键作用，主要通过减少活性氧（ROS）的过度积累及其引发的氧化损伤来实现。1. 视网膜色素上皮细胞（RPE）负责多种功能，包括视黄类物质的转化与储存、散射光的吸收、液体和离子的转运，以及对脱落的光感受器外节膜进行吞噬。2,3视网膜色素上皮细胞（RPE）的形态或功能改变可损害其正常功能，进而导致视网膜病变，这是多种眼病共有的特征4许多眼部疾病与视网膜色素上皮（RPE）细胞的形态和功能改变有关，包括一些遗传性疾病，如视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙和白化病4,5,6以及与年龄相关的眼部疾病，如糖尿病视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD）7,8人类细胞是最理想的，因此在形成视网膜色素上....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
动物使用遵循奥克兰大学IACUC动物实验方案编号21063以及眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明的指导原则。
1. 溶液配制
- 通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/F-12 营养混合物（DMEM/F12）中添加 25% 胎牛血清（FBS）、1.5% 青霉素/链霉素和 0.02% 庆大霉素，配制完全的 RPE 细胞培养基。
- 通过将 741 µL 的 Hank 平衡盐溶液（HBSS）与 127 µL 胶原酶储备液和 132 µL 透明质酸酶储备液混合，配制酶 A。最终体积为 1 mL，可用于处理四只眼睛。
- 通过将 1 mg 来自Clostridium histolyticum的胶原酶溶解于 41 mL HBSS 中，配制胶原酶储备液（19.5 单位/mL）。
- 通过将 1 mg 来自牛睾丸的透明质酸酶溶解于 18.4 mL HBSS 中，配制透明质酸酶储备液（38 单位/mL）。
- 将两份 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 与三份 HBSS 混合，配制酶 B。注意总体积取决于解剖的眼数；1 mL 酶 B 可用于处理四只眼睛。
2. 去核
- 使用二氧化碳（CO₂....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
验证分离的视网膜色素上皮细胞的特异性、纯度及屏障功能/形成
分离的细胞在光学显微镜下进行观察，以验证其活力、形态和色素沉着情况。P0 和 P1 代细胞的图像图 1A,B）并在 P0 和 P4 时采集图像（图1C,D）以显示细胞在传代过程中形态、大小和色素的变化，直至第四代（黑箭头指向P4代中分离出的RPE细胞）。使用RPE65蛋白抗体以验证分离细胞的身份。对分离的细胞进行免疫荧光染色，采用抗RPE65抗体孵育后，通过荧光显微镜观察（图1E,F：低倍镜下，以及 图 1G,H：高倍放大，显示呈绿色阳性染色的视网膜色素上皮（RPE）细胞以及蓝色的细胞核标记物DAPI。RPE65是一种在视网膜色素上皮中表达的异构水解酶，对视杆细胞和视锥细胞介导视觉所必需的视觉色素的再生至关重要21 .为了验证分离的屏障功能
细胞中细胞骨架蛋白F-actin和紧密连接蛋白ZO.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案是一种已报道、经修改并简化的从小鼠眼球中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的详细操作流程。该方案包括小鼠眼球摘除、解剖、细胞收集、接种、培养以及从小鼠眼球中分离出的RPE细胞的鉴定。
成功的视网膜色素上皮（RPE）细胞分离存在一些限制因素和关键步骤，例如小鼠的年龄、解剖眼的数量、组织培养皿或培养板的尺寸，以及接种后在储存和传代过程中的注意事项。为了能够将分离的细胞传代三到四次，最佳的小鼠年龄为18至21天。为了获得足够数量且能够生长和增殖的分离细胞，单次分离至少需要两个眼球。分离所得的细胞数量与解剖的眼球数量成正比（约每眼220,000个细胞）。建议使用无菌的100 mm培养皿或培养瓶，以便在早期传代（P0）时获得较多细胞。接种后，至少5天内不应移动培养板或将培养板从培养箱中取出，也不应更换培养基。 此外，该技术的另一个局限性在于分离细胞的保存和传代。细胞不能冷冻保存后再复苏使用，且最多只能传代三到四次。传代超过第4代后，细胞开始改变其大小和形态，变得细长（呈纺锤形），同时细胞色素明显减少（图1D）。
.......访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在与本文内容相关的利益冲突。
致谢
本工作由国家眼科研究所（NEI）及国家眼科研究所（NEI）基金R01 EY029751-04资助。我们感谢Pamela Martin博士在RPE分离初期阶段提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 烧杯：100 mL | KIMAX | 14000 | |
| 溶组织梭菌胶原酶 | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | 用于工作酶A |
| 一次性刻度移液管：3.2 mL，无菌 | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | 用于RPE细胞培养的培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | gibco | 26140079 | 用于完全RPE细胞培养基 |
| 庆大霉素试剂溶液 | gibco | 15750-060 | 用于完全RPE细胞培养基 |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS） | Thermo Scientific | 88284 | 用于工作酶（A&B） |
| Heracell VISO 160i CO2 培养箱 | Thermo Scientific | 50144906 | |
| 牛睾丸透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | 用于工作酶A |
| Kimwipes 擦拭纸 | Kimberly-Clark | 34155 | |
| 带针鲁尔锁注射器，21 G × 1 1/2 英寸，无菌，一次性使用，3 mL | B-D | 309577 | |
| 微量离心管：2 mL | Grainger | 11L819 | |
| 小鼠单克隆抗RPE65抗体 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | 用于免疫荧光染色 |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | gibco | 15140-122 | 用于完全RPE细胞培养基 |
| 正向作用镊子，型号5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| 标准直头虹膜剪，11.5 cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 离心机 | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 体视显微镜 | Zeiss | n/a | |
| 手术刀片，#11，不锈钢 | Bard-Parker | 371211 | |
| 悬浮培养皿，60 mm × 15 mm 型 | Corning | 430589 | |
| 组织培养皿：100 mm × 20 mm 型 | Corning | 353003 | |
| Tornado 管：15 mL | Midsci | C15B | |
| Tornado 管：50 mL | Midsci | C50R | |
| 胰蛋白酶EDTA（1×）0.25% | gibco | 2186962 | 用于工作酶B |
| 镊子5MS，8.2 cm，直头，尖端0.09×0.05 mm | Dumont | 501764 | |
| 正向作用弹簧镊，型号5，生物用，Dumostar，抛光表面，全长110 mm | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| 中等吸水垫：23" × 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas 弹簧剪，2.5 mm 刃口 | FST | 15000-08 | |
| 蔡司AxioImager Z2 显微镜 | Zeiss | n/a | |
| 蔡司Zen Blue 2.6 软件 | Zeiss | n/a |
参考文献
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 80....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
