Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nitroreductase/metronidazolmedieret ablation og en MATLAB-platform (RpEGEN) til undersøgelse af regenerering af zebrafiskens retinale pigmentepitel

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver metoden til genetisk at ablate retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af en transgen zebrafiskmodel. Tilpasning af protokollen til at inkorporere signalvejsmodulering ved hjælp af farmakologiske forbindelser er udførligt detaljeret. En MATLAB-platform til kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering blev udviklet og præsenteres og diskuteres.

Abstract

Retinalpigmentepitelet (RPE) befinder sig på bagsiden af øjet og udfører funktioner, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af tilstødende retinale og vaskulære væv. På nuværende tidspunkt har den begrænsede reparative kapacitet hos pattedyrs RPE, som er begrænset til små skader, hindret fremskridt med hensyn til at forstå in vivo RPE regenerative processer. Her tilvejebringes en detaljeret metode til at lette undersøgelsen af in vivo RPE-reparation ved hjælp af zebrafisken, en hvirveldyrmodel, der er i stand til robust vævsregenerering. Denne protokol beskriver et transgent nitroreduktase/metronidazol (NTR/MTZ)-medieret skadesparadigme (rpe65a:nfsB-eGFP), som resulterer i ablation af de centrale to tredjedele af RPE efter 24 timers behandling med MTZ med efterfølgende vævsgenopretning. Der fokuseres på RPE-ablationer i larvezebrafisk, og metoder til test af farmakologiske forbindelsers virkninger på RPE-regenerering er også skitseret. Generering og validering af RpEGEN, et MATLAB-script oprettet for at automatisere kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering, diskuteres også. Ud over aktive RPE-reparationsmekanismer kan denne protokol udvides til undersøgelser af RPE-degeneration og skadesresponser samt virkningerne af RPE-skader på tilstødende retinale og vaskulære væv, blandt andre cellulære og molekylære processer. Dette zebrafiskesystem har et betydeligt løfte om at identificere gener, netværk og processer, der driver RPE-regenerering og RPE-sygdomsrelaterede mekanismer, med det langsigtede mål at anvende denne viden på pattedyrssystemer og i sidste ende mod terapeutisk udvikling.

Introduction

Metoden beskrevet heri beskriver en protokol til genetisk ablat retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af larvezebrafisk. RPE strækker sig over bagsiden af øjet og befinder sig mellem de stratificerede lag af den neurale nethinde og det lag af vaskulatur, der udgør choroid. Trofisk støtte, absorption af fototoksisk lys og vedligeholdelse af visuelle cyklusproteiner er kun nogle af de kritiske funktioner, RPE udfører, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af disse tilstødende væv1. Skader på pattedyrs RPE kan repareres, når læsionerne er små2; Skader, der er lidt af større skader eller progressiv degenerativ sygdom, er imidlertid irreversible. Hos mennesker fører RPE-degenerative sygdomme (f.eks. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og Stargardt-sygdom) til permanent synstab og, med få behandlingsmuligheder til rådighed, nedsat patientkvalitet. Den begrænsede evne for pattedyrs RPE til selvreparation har skabt et vidensgab inden for RPE-regenerative processer. I betragtning af zebrafiskens robuste regenerative kapacitet på tværs af mange forskellige vævstyper blev denne protokol udviklet til at etablere et in vivo-hvirveldyrsystem for at lette undersøgelser af iboende regenerering af RPE og afdække mekanismer, der driver dette svar. Ved hjælp af ablationsparadigmet, der er skitseret her, er den kanoniske Wnt-signalvej3, mTOR-vejen4 og immunrelaterede responser5 blevet identificeret som kritiske mediatorer for RPE-regenerering, sandsynligvis med overlappende funktioner.

I dette genetiske ablationsparadigme udtrykker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafisk det bakterieafledte nitroreduktase (NTR/nfsB) gen6 smeltet sammen med eGFP under kontrol af RPE-forstærkerelementet, rpe65a7. Ablation opnås ved at tilsætte prodrug, metronidazol (MTZ), til systemvand, der huser zebrafisk. Intracellulær aktivering af MTZ ved nitroreductase resulterer i DNA-tværbinding og apoptose i NTR/nfsB-ekspressionerende celler 8,9. Denne teknologi er blevet anvendt i vid udstrækning i zebrafisk til at ablatere celler i nethinden 10,11,12,13 og andre væv 8. Tilsammen muliggør disse elementer målrettet ekspression (rpe65a) af en inducerbar celleablationsmetode (NTR/MTZ)8,9 og en fluorescerende markør (eGFP) til visualisering.

Der findes også andre interessante in vivo-modeller, der kan bruges til at studere RPE14's regenerative potentiale. Disse er brede og omfatter RPE-til-retina transdifferentiering post-retinektomi hos padder, hvor RPE-celler tabt til retinal genvækst erstattes15,16; RPE-restaurering efter skade i "super healing" MRL / MpJ-musen17; og eksogen stimulering af RPE-spredning i en rottemodel af spontan RPE og retinal degeneration18, blandt andre. Der er også udviklet in vitro-modeller, f.eks. voksne humane RPE-stamceller (RPESC'er)19. Disse modeller er alle værdifulde værktøjer, der arbejder for at afdække de cellulære processer relateret til RPE-regenerering (f.eks. Spredning, differentiering osv.); zebrafisken er dog unik i sin evne til iboende RPE-reparation efter ablation.

Mens metoden her er skrevet for at fokusere på at forstå de mekanismer, der driver RPE-regenerering, kan Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -linjen og denne genetiske ablationsprotokol bruges til at studere andre cellulære processer såsom RPE-apoptose, RPE-degeneration og effekten af RPE-skade på tilstødende retinale og vaskulære væv. Ablationsprotokollen kan også ændres til at omfatte farmakologisk manipulation, hvilket er en bekvem foreløbig strategi til at screene signalveje af interesse. For eksempel har blokering af den kanoniske Wnt-vej ved hjælp af Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 vist sig at forringe RPE-regenerering3. Dette blev gentaget her for at guide brugerne gennem et farmakologisk manipulationseksperiment og tjene som proof-of-concept for at validere et MATLAB-script (RpEGEN), der blev oprettet for at kvantificere RPE-regenerering baseret på genopretning af pigmentering. Ligesom den transgene linje og ablationsprotokollen er RpEGEN-scripts tilpasningsdygtige og kan bruges til at kvantificere andre markører / cellulære processer inden for RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er skitseret heri, er i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh.

1. Forberedelse forud for indsamling af zebrafiskembryoner

  1. Indstil embryoinkubator til 28,5 ° C.
  2. Der fremstilles en 25x stamopløsning af melanogenesehæmmeren, N-phenylthiourea (PTU)21,22. Denne stamopløsning skaleres ud fra en almindelig opskrift22, og 1x er lig med 0,003% vægt pr. volumen (% w/v) (f.eks. 0,003 g PTU-pulver til 100 ml flydende opløsningsmiddel).
    1. For at fremstille en stor 25x PTU-stamopløsning tilsættes 0,75 g PTU-pulver til 1 liter renset deioniseret vand (i det følgende benævntdH20) og blandes grundigt ved stuetemperatur (~ 25 °C) ved hjælp af en omrøringsstang og omrøringsplade. Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder beskyttet mod lys.
      BEMÆRK: Det er svært at få PTU til at gå i vandig opløsning, og forlænget omrøring natten over kan være nødvendigt.
      FORSIGTIG: PTU er farlig, og der skal udvises forsigtighed for at forhindre indtagelse, indånding og / eller kontakt med huden eller øjnene. PTU-pulver og alle PTU-flydende derivater, der er beskrevet heri, skal muligvis bortskaffes som kemisk affald afhængigt af statslige og institutionelle regler. Bekræftelse af korrekte PTU-affaldshåndteringsmetoder, hvis nogen, anbefales inden brug.
    2. For at lave en 1,5x PTU-arbejdsløsning (i det følgende benævnt 1,5x PTU) tilsættes 60 ml 25x PTU-stamopløsning til 940 ml vand fra zebrafiskeanlæg (i det følgende benævnt systemvand). Der er beskrevet optimale vandkvalitetsparametre for zebrafisk23 , og akvatikanlæg bør have standardprocedurer for vandovervågning. Opbevar 1,5x PTU ved 28,5 °C i 1-2 uger beskyttet mod lys.
      BEMÆRK: Denne protokol udføres rutinemæssigt ved hjælp af PTU-koncentrationer, opløsningsmidler og opbevaringsparametre beskrevet i trin 1.2. For en sikkerheds skyld bør embryoner/larver observeres hver 1.-2. dag, mens de er i PTU, for at validere effekten og bekræfte vedvarende depigmentering. Opløsnings- og/eller opbevaringsbetingelserne bør optimeres, hvis der er mistanke om fald i PTU-opløselighed/-effekt.
  3. Der fremstilles en stamopløsning af 0,05 % w/v methylenblåt, en svampevæksthæmmer, ved at tilsætte 0,05 g methylenblåt pulver til 100 mldH20. Bland grundigt med en omrøringsstang og omrøringsplade. Opbevares ved 4 °C.
  4. Forbered pipetter til embryo/larvemanipulation (f.eks. flytning af embryoner/larver mellem petriskåle, adskillelse af larver under fluorescensscreening, opsamling af aflivede larver i mikrocentrifugerør til fiksering osv.) ved at skære den tilspidsede ende af en Pasteur-pipette af glas tilbage ved hjælp af en diamantspidsskrivepen. Æts rundt om pipettens omkreds med diamantpennen, og træk eller klik forsigtigt enden af for at gøre en ren pause.
    BEMÆRK: Pipettens mund skal være glat og bred nok til let at tage et embryo op, der stadig er inde i korionen uden at skære. Brug en pæretrækoverførselspipette som et alternativ. Tilberedte pipetter kan også bruges til at fjerne væske under vandforandringer (i stedet for at hælde) for at minimere embryo / larve tab.
  5. Forbered en 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i 1x phosphatbufret saltvand (PBS) (tilsæt f.eks. 10 ml 16% PFA til 4 ml 10x PBS og 26 mldH20). Opbevares ved 4 °C i op til 4 uger beskyttet mod lys.
    FORSIGTIG: Paraformaldehyd er et farligt kemikalie og skal håndteres i en kemisk røghætte og bortskaffes korrekt. Der skal være forsigtighed, og personlige værnemidler (PPE) skal bæres for at forhindre indtagelse, indånding og / eller kontakt med huden eller øjnene.

2. Indsamling og vedligeholdelse af zebrafiskembryoner før genetisk ablation (0-5 dage efter befrugtning)

  1. Vedligehold voksne zebrafisk som beskrevet tidligere 3,4,5. Eftermiddagen/aftenen før embryoopsamlingen adskilles voksne zebrafisk i yngletanke til gydning.
  2. Den følgende morgen (0 dage efter befrugtning (dpf)) samles embryoner i petriskåle med en diameter på 10 cm i systemvand og fjerner alle ikke-levedygtige eller ubefrugtede æg, som vil fremstå uigennemsigtige og/eller vise uregelmæssig cytoplasma og mislykket spaltning24.
    BEMÆRK: Normale spaltnings- og udviklingsmæssige iscenesættelseshændelser vil være tydelige hos raske embryoner som beskrevet25. Petriskåle skal holdes tre fjerdedele fulde (~ 30 ml til en skål med en diameter på 10 cm) i hele protokollen.
    1. Tilsæt to dråber 0,05 % m/v methylenblåt til hver petriskål, bland forsigtigt, og opbevar embryoner ved 28,5 °C i resten af protokollen.
  3. Omkring 6 timer efter befrugtning (hpf)4,5,26, udskift systemvand i embryo petriskåle med 1,5x PTU (arbejdsløsning fremstillet i trin 1.2.2) og genopfyld methylenblåt.
    BEMÆRK: PTU skal tilsættes embryoner inden pigmenteringsbegyndelsen (dvs. før 24 hpf)25, da allerede pigmenteret væv ikke depigmenteres ved tilsætning af PTU21. Det skal dog bemærkes, at reduceret øjenstørrelse, okulære og kraniofaciale underskud og forstyrrelse af nogle signalveje (f.eks. Skjoldbruskkirtelsignalering) er blevet rapporteret i PTU-behandlede zebrafisk 27,28,29. PTU's udviklingstoksicitet synes at være afhængig af koncentration og timing af PTU-tilsætning27,29. Som nævnt ovenfor til validering af PTU-effektivitet (trin 1.2) bør tegn på PTU-toksicitet også overvåges nøje, og hvis der er mistanke om det, bør arbejdskoncentrationen og/eller tidspunktet for PTU-tilsætning optimeres.
  4. På 2-3 dpf, dechorionate embryoner ved anvendelse af frisklavet pronaseopløsning.
    1. Pronase opløses i 1,5x PTU i en koncentration på 2 mg/ml ved hvirvel.
      FORSIGTIG: Pronase er pakket som et meget fint pulver og er irriterende. Træffe foranstaltninger for at undgå indånding og/eller kontakt med hud, øjne osv.
    2. Adskil udklækkede embryoner fra uudklækkede embryoner og pronase-behandl kun uudklækkede embryoner.
    3. Udskift 1,5x PTU med 2 mg/ml pronaseopløsning fremstillet i trin 2.4.1, og lad det stå på uudklækkede embryoner i 4-5 minutter med blid omrøring (f.eks. på en bordrotator/shaker eller ved manuel hvirvlen).
    4. Hæld pronaseopløsningen af og skyl straks med frisk 1,5x PTU. Triturer forsigtigt 1,5x PTU skyl over embryoner med en pære-træk overførselspipette.
    5. Gentag en anden 1,5x PTU-skylning for at kassere alt korionaffald, og genopfyld derefter 1,5x PTU til vedligeholdelse.
      BEMÆRK: Embryoner kan også deforiseres manuelt ved hjælp af fintippede tang. I dette tilfælde skal korionaffald fjernes og 1,5x PTU genopfyldes efter manuel dechorionation.
  5. Overvåg embryo / larve sundhed og genopfyld 1,5x PTU hver 1-2 dage. Embryoner/larver opbevares i 1,5x PTU indtil ablation ved 5 dpf.
    BEMÆRK: Betydningen af trin 2.3 og 2.4 behandles yderligere i afsnittet Diskussion.

3. Screening af zebrafisklarver for rpe65a:nfsB-eGFP og genetisk ablation af retinalpigmentepitelet (5-6 dage efter befrugtning)

  1. Lav en frisk 10 mM metronidazol (MTZ) opløsning på 5 dpf (ablationsdag). Denne proces tager 2 timer at fuldføre.
    1. Tilsæt MTZ-pulver til systemvand uden PTU og bland grundigt ved kraftig omrystning (f.eks. 250 rotationer pr. minut) i 1 time ved 37 °C.
    2. Afkøl 10 mM MTZ-opløsning i yderligere 1 time ved stuetemperatur på en bordplade rotator/shaker og sørg for fuldstændig opløsning inden tilsætning til petriskåle med larver.
      BEMÆRK: Fluorescensscreening og adskillelse af eGFP+- larver (trin 3.2) kan udføres under inkubationerne på 37 °C og stuetemperatur.
      FORSIGTIG: MTZ er farlig, og der skal udvises forsigtighed for at forhindre indtagelse, indånding og / eller kontakt med huden eller øjnene. MTZ-pulver og alle flydende derivater, der er beskrevet heri, skal muligvis bortskaffes som kemisk affald afhængigt af statslige og institutionelle regler. Bekræftelse af korrekte MTZ-affaldshåndteringsmetoder, hvis nogen, anbefales inden brug.
  2. Screen zebrafisk larver for rpe65a: nfsB-eGFP transgen.
    1. Bedøve larver med 0,168 g/l tricain (MS-222) og adskille transgene (eGFP+) larver (figur 1) fra ikke-transgene (eGFP-) larver ved hjælp af et fluorescensstereomikroskop med en 488 nm excitationslaser/filter.
      BEMÆRK: Tricain bør tilsættes til 1,5x PTU og/eller farmakologiske sammensatte opløsninger, da larver skal forblive nedsænket i behandlingen, mens de screenes for eGFP. Inkuber kun larver i trikain under screeningen (f.eks. ≤10 min for en enkelt 10 cm petriskål indeholdende 50 larver).
    2. Væk screenede larver med det samme ved at pipettere direkte i en petriskål med frisk 1,5x PTU uden tricain.
    3. Efter afslutningen af screeningen adskilles eGFP+- larverne yderligere i to grupper af petriskåle: en gruppe, der skal modtage MTZ-behandling (ableret/MTZ+), og en gruppe, der skal være den ikke-ablerede (MTZ-) kontrol.
  3. Ablat retinal pigmentepitel.
    1. Fjern 1,5x PTU fra de utilblated (MTZ-) kontrolskåle, og tilsæt ferskvand uden PTU.
    2. Fjern 1,5x PTU fra de ablated (MTZ+) behandlingsskåle, og tilsæt den frisklavede 10 mM MTZ-opløsning (trin 3.1.).
    3. Fjern 10 mM MTZ-opløsningen efter nøjagtigt 24 timer (betegnet 1 dag efter skade (dpi)) og tilsæt ferskvand i systemet uden PTU. Skift det friske systemvand ud uden PTU på MTZ-skålen (e). Larver vil ikke blive udsat for PTU igen i resten af protokollen.
      BEMÆRK: Det kan være vanskeligt at pipette eller hælde alle 1,5x PTU (trin 3.3.1 og 3.3.2) eller 10 mM MTZ (trin 3.3.3) mellem opløsningsudvekslinger uden tab af larve, da dyrene aktivt svømmer rundt. I dette tilfælde kan vask (er) af systemvand uden PTU tilsættes for at sikre en vellykket udveksling af opløsninger.

4. Larvevedligeholdelse efter genetisk ablation (6+ dage efter befrugtning)

  1. Kontroller larver og genopfyld systemvand uden PTU dagligt indtil eutanasi (trin 5.6) eller vend tilbage til zebrafiskens staldfacilitet.
  2. Overvåg succesen og omfanget af ablation in vivo på 2 dpi (7 dpf) ved hjælp af transmitteret lysbelysning på et stereomikroskop (figur 2).

5. Indarbejdelse af farmakologisk behandling i zebrafisk retinal pigmentepitelablationsprotokol

BEMÆRK: Som tidligere udført3 er behandling med 15 μM IWR-1 eller volumenmatchet dimethylsulfoxid (DMSO) køretøjskontrol, der starter ved 4 dpf, skitseret her som et eksempel på eksperiment til test af RpEGEN. Koncentrationer og tidslinjer kan variere med forskellige farmakologiske forbindelser, og anbefalinger til dosis-responsvalidering, behandlingsvarighed, screening og andre aspekter af eksperimentelt design til farmakologiske manipulationsundersøgelser behandles i afsnittet Diskussion. Følg trin 6 og 7, hvis billedanalyse er påkrævet.

  1. Indsamle og vedligeholde embryoner som beskrevet i trin 2. Dekriionate embryoner på 2 dpf.
  2. Screen eGFP+ larver på 4 dpf som beskrevet i trin 3.2. I stedet for petriskåle skal du placere eGFP + larver i 6-brøndsplader med en tæthed på n ≤ 10 larver pr. 6-brønd til farmakologisk behandling. Udpeg separate 6-brøndsplader til larver, der vil være ubibelerede (MTZ-) og larver, der vil blive ableret (MTZ+).
    BEMÆRK: eGFP-signalet er synligt på 4 dpf, men ser lysere ud end signalintensiteten på 5 dpf.
  3. Forbehandle 4 dpf eGFP+ larver med 15 μM IWR-1 eller volumenmatchet DMSO-køretøjskontrol i nøjagtigt 24 timer før genetisk ablation med 10 mM MTZ-opløsning.
    BEMÆRK: Ofte er der brug for meget lidt forbindelse til farmakologiske behandlingsforsøg. For at undgå afvejning af små mængder IWR-1-pulver købes denne farmakologiske forbindelse allerede i DMSO-opløsning i en koncentration på 25 mM og aliciteret i mindre mængder ved ankomsten for at undgå gentagne fryse-optøningscyklusser.
    1. Bestem mængden af nødvendige farmakologiske behandlinger og køretøjskontrolbehandlinger, og aliquot 1,5x PTU i koniske rør i overensstemmelse hermed. Et volumen på 5 ml / brønd af en 6-brønds plade anbefales.
    2. Tilsæt IWR-1-lager til 1,5x PTU for en endelig koncentration på 15 μM IWR-1 (f.eks. 3 μL 25 mM IWR-1 pr. 5 ml 1,5x PTU). Tilføj et matchet volumen DMSO-lager til 1,5x PTU (f.eks. 3 μL ≥ 99,7% DMSO pr. 5 ml 1,5x PTU). Her vil dette ende med at give en endelig koncentration på 0,06% volumen /volumen (% v / v) DMSO. Bland godt ved hvirvel og bekræft visuelt opløsning af forbindelser.
      FORSIGTIG: DMSO, IWR-1 og andre farmakologiske forbindelser og opløsningsmidler skal muligvis bortskaffes som kemisk affald afhængigt af statslige og institutionelle regler. Bekræftelse af fareniveauet og korrekte metoder til bortskaffelse af affald for disse forbindelser, hvis nogen, anbefales inden brug.
    3. Fjern 1,5x PTU fra eGFP+ larverne i 6-brønds plader og tilsæt 5 ml/brønd frisklavede 0,06% v/v DMSO eller 15 μM IWR-1 behandlinger fra trin 5.3.2.
  4. På 5 dpf skal du ablate RPE. Ud over 24 timers forbehandling (trin 5.3) vil larverne forblive nedsænket i farmakologiske og køretøjskontrolbehandlinger under 24 timers genetisk ablation med 10 mM MTZ og under genopretning efter ablation, indtil fiksering (f.eks. fra 4-9 dpf).
    1. Lav 10 mM MTZ-opløsning 2 timer før udførelse af genetisk ablation (trin 3.1).
    2. Bestem mængden af farmakologiske behandlinger og køretøjskontrolbehandlinger, der er nødvendige for både ubibelerede (MTZ-) og ablerede (MTZ+) 6-brøndsplader og aliquot passende mængder af enten ferskvandsvand uden PTU (MTZ-) eller 10 mM MTZ-opløsning (MTZ+) i koniske rør. Dette vil give fire behandlingsbetingelser: 1) 0,06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v/v DMSO, MTZ+; og 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Tilføj IWR-1- og DMSO-stamopløsninger til de respektive koniske rør som udført i trin 5.3.2. Bland godt ved hvirvel og bekræft visuelt opløsning af forbindelser.
    4. Fjern 0,06 % v/v DMSO og 15 μM IWR-1-behandlinger i 1,5x PTU (trin 5.3.2) fra udpegede utilblerede (MTZ-) og ablerede (MTZ+) 6-brøndsplader, og genopfyld med de relevante behandlinger foretaget i trin 5.4.3.
    5. Fjern 0,06% v/v DMSO og 15 μM IWR-1 behandlinger i 10 mM MTZ-opløsning efter præcis 24 timer og genopfyld med behandlinger i ferskvand uden PTU. Genopfyld 0,06 % v/v DMSO og 15 μM IWR-1-behandlinger i ferskvand uden PTU på den eller de 6-brønds plader( ikke-ablerede (MTZ-).
  5. Følg larvevedligeholdelse efter ablation som beskrevet i trin 4, og genopfyld 0,06 % v/v DMSO- eller 15 μM IWR-1-behandlinger dagligt i systemvand uden PTU.
  6. Afliv larver på 9 dpf (4 dpi for aldersmatchede MTZ-behandlede søskende) ved at nedsænke dyr i 0,3 g / l tricainopløsning (dødelig overdosis) kombineret med hurtig nedkøling (f.eks . Læg petriskåle på is) i mindst 20 minutter30. Kontroller, at larverne ikke reagerer på at røre ved og fiksere i 4% PFA (trin 1,5) i 3 timer ved stuetemperatur eller ved 4 ° C natten over.
  7. Behandl larvevæv efter fiksering til z-stack billedanskaffelse på et konfokalmikroskop som beskrevet tidligere 5,31 og her i afsnittet Repræsentative resultater. Analyse i trin 6 og 7 vil som minimum kræve erhvervelse af nukleare markører (f.eks. DAPI) og brightfield z-stack-billeder.

6. Konfokalmikroskop z-stack billedforbehandling i FIJI (ImageJ)

  1. Importer og formater konfokalmikroskop z-stack-billeder ved hjælp af FIJI32.
    1. Åbn mikroskopbilleder ved hjælp af importindstillingerne for bioformater , der er indstillet til Vis stak med: Hyperstack og Farvetilstand: Gråtoner.
    2. Generer en maksimal intensitetsprojektion af det importerede mikroskopbillede ved at vælge Billede | Stakke | Z-projektet. I vinduet ZProjection skal du indstille Start Slice og Stop Slice til at inkludere alle udsnit til det pågældende billede. Indstil f.eks. Start Slice: 1 og Stop Slice: 18 for en z-stack, der har i alt 18 skiver. Vælg Projektionstype: Max intensitet, og klik på OK.
    3. Konverter projektionsfilen med maksimal intensitet til et 8-bit billede (hvis ikke allerede) ved at vælge Billede | Skriv | 8-bit.
    4. Ret billedet om, så den dorsale side er oppe, og distal (dvs. objektivet) efterlades ved at vælge Billede | Transformer | Vend vandret (for den sidste kommando skal du vælge den indstilling, der bedst passer til den retningsbestemthed, der er nødvendig for det pågældende billede). For et flerkanalsbillede skal du klikke på Ja i processtakken? vindue for at omorientere alle kanaler.
      BEMÆRK: Dette trin er kritisk, men ikke nødvendigt, hvis billedet allerede er i dorsal op, distal venstre retning. Se figur 3A-D og figur 4 for billeder med øjne i den korrekte retningsbestemthed til behandling.
    5. Gem den maksimale intensitetsprojektion på 8 bit som en TIF-fil (tagget billedfilformat) ved at vælge Filer | Gem som | Tiff....
  2. Generer RPE-interesseområde (ROI) ved hjælp af FIJI.
    1. Åbn et 8-bit TIF-billede, der er genereret som beskrevet i trin 6.1. Start ROI Manager ved at vælge Analysér | Værktøjer | ROI Manager.
    2. Brug | Zoom og skift mellem DAPI- og lysfeltkanalerne for at identificere det eller de punkter, hvor den apikale side af RPE støder op til spidsen af den ydre begrænsende membran (OLM) (figur 3B', B", D', D"; blå pilespidser). Brug dette anatomiske vartegn som ROI-udgangspunkt.
    3. Opret RPE ROI med polygonvalgsværktøjet (på FIJI-værktøjslinjen) ved hjælp af både DAPI- og brightfield-billedkanalerne og zoomfunktionen (Image | Zoom) for at identificere apikale og basale RPE-grænser. Bring de dorsale og ventrale ender af ROI (dvs. hvor ROI overgår fra den apikale til basale side af RPE) til et skarpt punkt i stedet for at afstumpe eller afrunde (figur 3B', B", D', D"; magentalinjer).
      BEMÆRK: Oprettelse af en spids ROI-ende er et kritisk trin til optimering af slutpunktsregistrering ved hjælp af RpEGEN og behandles i afsnittet Diskussion.
    4. Tilføj ROI ved at klikke på Tilføj i ROI Manager. Juster ROI efter behov, og klik på Opdater i ROI Manager.
    5. Gem ROI-filen ved at vælge Mere>> | Spare... inden for ROI Manager. Brug identiske navne til matchede ROI- og TIF-billedfiler (f.eks. [filnavn].tif og [filnavn].roi).
  3. Kombiner 8-bit TIF- og ROI-filer for hver betingelse i en enkelt mappe. For eksempel vil mappen, DMSO_9dpf, indeholde alle de matchede TIF- og ROI-filer for den 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-behandlede larvegruppe.

7. Kvantificering og visualisering af RPE-regenerering ved hjælp af RpEGEN-scripts

  1. Installer og forbered RpEGEN-scripts.
    1. Download de nyeste RpEGEN-scripts fra GitHub-lageret (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) ved at klikke på Code | Hent ZIP.
    2. Pak mappen ud, og placer den på den ønskede placering i arbejdsområdet (f.eks. Skrivebord).
    3. Åbn MATLAB.
    4. Naviger til RpEGEN-mappen i ruden Aktuel mappe (normalt i venstre side).
    5. Højreklik på RpEGEN-mappen , og vælg Føj til sti | Valgte mapper og undermapper. Dette føjer mappen til MATLAB-stien, så den automatisk kan finde og køre alle scripts i mappen.
    6. Dobbeltklik på RpEGEN-mappen i ruden Aktuel mappe for at få vist alle undermapper og M-filer.
    7. Dobbeltklik på filen RpEGEN.m for at åbne i ruden Editor .
    8. Under afsnittet BRUGERDEFINEREDE VARIABLER i RpEGEN.m-filen skal du angive mappeplaceringerne for de mapper, der indeholder ROI-filerne (.roi), billedfiler (.tif), og hvor outputfiler skal gemmes. Angiv gruppenavnet på den .mat-fil, der skal eksporteres (f.eks. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi osv.), og placeringen af brightfield-kanalen i TIF-billedstakken (f.eks. 3, hvis brightfield er den tredje kanal i en billedstak). Hvis billedfilen kun indeholder brightfield-billedet, skal dette være lig med 1.
  2. Kør RpEGEN.m-scriptet, og valider resultaterne.
    BEMÆRK: RpEGEN kræver, at Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox og Statistics and Machine Learning Toolbox aktiveres på brugeren MATLAB-licensen for at kunne køre. Derudover kræves den frit tilgængelige ReadImageJROI værktøjskasse33 for at importere FIJI ROI'er til MATLAB; det findes dog i RpEGEN-mappen sammen med andre funktion M-filer, der ikke kræver nogen aktivering.
    1. Kør scriptet ved at klikke på knappen Kør i menuen Editor øverst på MATLAB.
      BEMÆRK: Når det er startet, giver kommandovinduet detaljeret output, der angiver scriptets progression. Når du har gemt MAT-filen, der indeholder de udpakkede data, vises en figur med tre paneler og gemmes som en PDF i outputmappen for hver billedkørsel. Disse er kvalitetskontroltal (QC) for at sikre, at alt har kørt korrekt og inkluderer: 1) lysfeltbilledet overlejret af ROI (figur 4A); 2) ROI med centerlinje og tilhørende vinkelafstand (grader) (figur 4G); og 3) ROI med de midterste medianintensitetsværdier (0-255, 8-bit farveskala) (figur 4H). Vent, indtil QC-PDF-filerne er gemt i outputmappen, og det sidste tal er forsvundet, før du fortsætter til næste trin.
    2. Åbn de enkelte PDF-filer, der eksporteres til outputmappen i en hvilken som helst PDF-fremviser, og kontroller, at alle ROI'er matcher lysfeltbillederne, at centerlinjeværdier er rimelige tilnærmelser til midten af ROI'erne, og at medianintensitetsværdierne er korrekt udfyldt med data (dvs. ikke alle de samme værdier på tværs af hele midterlinjen).
      BEMÆRK: En detaljeret beskrivelse og struktur af hver variabel, der er gemt i MAT-filen af RpEGEN.m, findes i tabel 1.
  3. Kør scriptet RpEGEN_PermPlot.m.
    BEMÆRK: scriptet RpEGEN_PermPlot.m bruger output fra RpEGEN.m til at køre statistiske sammenligninger ved hjælp af en permutationssimulering af medianerne for to grupper og giver også koden til gengivelse af plottene i dette papir ved hjælp af den frit tilgængelige GRAMM-værktøjskasse34, som også er inkluderet i RpEGEN-mappen.
    1. Dobbeltklik på filen RpEGEN_PermPlot.m for at åbne i en ny Editor-fane .
    2. Under SEKTION 1 - BRUGERDEFINEREDE VARIABLER i filen RpEGEN_PermPlot.m skal du indtaste mappeplaceringen for outputmappen, der indeholder MAT-filerne fra at køre RpEGEN.m, og indtaste hvert MAT-filnavn, der skal indlæses (f.eks. DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Kør dette afsnit af scriptet ved at klikke på knappen Kør sektion i menuen Editor øverst på MATLAB.
    4. I afsnit 2 skal du indtaste navnene på de to grupper til statistisk sammenligning i data_A og data_B variabler (det er de grupper, hvorfra medianer vil blive afledt ved hjælp af permutationssimuleringen). I variablen bin_sz skal du angive det antal grader, over hvilke medianintensitetsværdierne for datasættene skal integreres (standard er 1-graders placeringer).
      BEMÆRK: Reps-variablen angiver antallet af permutationer, der skal bruges til at opbygge en sandsynlighedsfordeling, og kan indstilles til et hvilket som helst tal (standardværdien er 20.000). Generelt vil et højere antal gentagelser være mere statistisk robuste, men vil øge behandlingstiden.
    5. Kør dette afsnit af scriptet ved at klikke på knappen Kør sektion i menuen Editor øverst på MATLAB. Dette afsnit kan tage lidt tid at fuldføre, afhængigt af antallet af angivne gentagelser, men giver en kontinuerlig statusopdatering i kommandovinduet.
    6. Kør HEATMAP FIGURE og GROUP RESULTS AND P-VALUES sektioner uafhængigt ved hjælp af knappen Kør sektion . Rediger datavariabler i alle sektioner, der kommenteres med "INDTAST DATA HER". PDF-filer med disse figurer gemmes automatisk for hver og kan let ændres i enhver vektorsoftware efterbehandling.
      BEMÆRK: De plots, der genereres i RpEGEN_PermPlot.m-filen , er ad hoc og vil sandsynligvis kræve ændringer baseret på hver brugers specifikke data- og visualiseringsbehov. Tallene giver dog et solidt fundament, der let kan individualiseres ved hjælp af både MATLAB- og GRAMM-websteder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hæmning af den kanoniske Wnt-signalvej er kendt for signifikant at forringe zebrafisk RPE-regenerering ved hjælp af det genetiske ablationsparadigme (rpe65a: nfsB-eGFP) og farmakologisk manipulationsmetode (IWR-1) beskrevet i protokol3. Dette eksperiment blev gentaget her for at validere en automatiseret metode til kvantificering af zebrafisk RPE-regenerering baseret på pigmentering. Resultaterne opsummeret nedenfor omfattede alle trin i protokollen, fra befrugtningsdagen (0 dpf) til kvantificering af RPE-regenerering ved hjælp af RpEGEN.

Implementering af RPE-ablationsprotokollen (med farmakologisk manipulation) i larvezebrafisk
Embryoner indsamlet fra tre separate forældregrupper (N = 3) begyndte behandling med 1,5x PTU omkring 6 hpf, og fravær af pigmentering i RPE og overflademelanoytter blev visuelt bekræftet på 1 dpf. Embryoner blev enzymatisk deforetgjort på 2 dpf ved hjælp af 2 mg/ml pronase (trin 2.4). På 4 dpf blev larver bedøvet ved hjælp af tricain (MS-222) og screenet for eGFP ved hjælp af et fluorescensstereomikroskop (trin 3.2 og 5.2). eGFP+ larver blev flyttet til 6-brønds plader (n = 10 larver/brønd) og blev behandlet med enten 0,06% v/v DMSO (køretøjskontrol) eller 15 μM IWR-1 (trin 5.3). Den larvetæthed, der blev rapporteret her, var oprindeligt baseret på tilnærmelsen af 1 larve /cm2 vækstområde og blev valideret gennem omhyggelig sundhedsovervågning (f.eks. Svømmeblæreudvikling) over tid. Intensiteten af eGFP syntes svag på 4 dpf, så larver blev screenet igen på 5 dpf for at bekræfte et lyst eGFP-udtryk (figur 1). RPE65 (rpe65a i zebrafisk) er en markør for moden RPE7 , og i teleostfisk genereres retinale og RPE-celler kontinuerligt fra den ciliære marginalzone (CMZ), en stamcelleniche ved nethindens distale spids, der støder op til linsen35. I rpe65a: nfsB-eGFP transgen linje findes jo mere umodne RPE således i periferien og vises eGFP- (ca. en tredjedel af det samlede RPE-væv), mens de modne, centrale to tredjedele af RPE udtrykker eGFP (figur 1B; hvide pilespidser). Transgenet var også synligt i pinealkirtlen (figur 1A; gul pilespids), hvilket var forventet, da rpe65a viser pinealudtryk i zebrafisk36. Forholdsvis svage eller eGFP-larver blev trukket fra 6-brønds plader og aflivet på 5 dpf. Præcis 24 timer efter behandling med DMSO eller IWR-1 blev 5 dpf larver behandlet med 10 mM MTZ for at ablate RPE (trin 3.1, 3.3 og 5.4). MTZ blev vasket ud efter nøjagtigt 24 timer (dvs. på 6 dpf / 1 dpi) for at muliggøre RPE-regenerering at finde sted.

Larver blev observeret dagligt på et stereomikroskop ved hjælp af transmitteret lysbelysning fra 6 dpf / 1 dpi til tidspunktet for eutanasi på 9 dpf / 4 dpi. Succes med genetisk ablation blev bekræftet in vivo på 2 dpi ved fravær af pigment i de centrale to tredjedele af øjet i MTZ + larver (figur 2B; røde pilespidser) sammenlignet med 7 dpf MTZ-kontrol søskende (figur 2A) (trin 4.2). Som forventet syntes området uden pigment på 2 dpi analogt med området rpe65a: nfsB-eGFP transgenekspression observeret på 5 dpf (figur 1B). Vurderingen blev udført på 2 dpi og ikke tidligere, da RPE gennemgår repigmentering efter fjernelse af PTU, og afhængigt af observationstidspunktet in vivo kan en markant forskel mellem den ablerede centrale RPE og skånet (utilblated) perifer RPE være vanskelig at skelne, hvis sidstnævnte ikke er fuldt ud repigmenteret. På trods af muligheden for makroskopisk tvetydighed viste RPE-ablation ved 1 dpi sig tidligere at være let synlig i sektioneret væv, hvilket afslørede et tab af central RPE og ydre nukleart lag (ONL; dvs. fotoreceptor) vævsintegritet sammen med tegn på celledød (pyknotiske kerner) (figur 5)3. I modsætning til vævstab blev robust spredning bestemt til at være en vigtig drivkraft under vævsregenerering i rpe65a: nfsB-eGFP zebrafisk model3. Både det tidlige apoptotiske respons, hvor RPE-ablation fører til degeneration af tilstødende væv (f.eks. Fotoreceptorer og Bruchs membran; Figur 6A-C) og det perifere til centrale proliferative respons, der følger, hvilket giver heterogene regenererings "zoner", der bevæger sig indad i skadestedet (figur 6D-F), er blevet grundigt karakteriseret og diskuteret tidligere3.

Vævsforberedelse, konfokal billedoptagelse og billedforbehandling til automatiseret kvantificering baseret på RPE-pigmentering ved hjælp af RpEGEN
På 9 dpf/4 dpi blev DMSO- og IWR-1-behandlede larver aflivet ved overdosering af tricain og fikseret i 4 % PFA i 3 timer ved stuetemperatur (trin 5.6). Fire larver fra hver uafhængig forældregruppe blev tilfældigt udvalgt til efterfølgende vævsbehandling (N = 3; n = 12 larver pr. Behandling). Kryobeskyttelse, kryosektion (ved 12 μm tykkelse), nuklear modfarvning med DAPI og dækslipmontering blev udført som refereret i trin 5.7 5,31. En central sektion med synlig optisk nerve fra hver larve blev afbildet på et konfokalt laserscanningsmikroskop ved hjælp af et 40x olienedsænkningsmål (numerisk blænde = 1,30) for at erhverve 512 x 512-pixel z-stack-billeder med et 1 μm z-trinsinterval. Hvert billede indeholdt data fra tre kanaler: kanal 1 = 405 nm excitation for DAPI, kanal 2 = 488 nm excitation for eGFP, kanal 3 = transmitteret lys for lysfelt. Da pixelintensiteten blev kvantificeret i lysfeltbilleder, blev de transmitterede lyslampespændingsindstillinger holdt konstante, og alle data, der blev indsamlet til statistiske sammenligninger, blev afbildet samme dag.

Konfokalmikroskop z-stack-billeder blev forbehandlet til automatiseret kvantificering som beskrevet i trin 6 ved hjælp af FIJI. Billeder blev udelukket fra forbehandling og kvantificering, hvis vævet blev kompromitteret på en måde, der ville gøre ROI-generering vanskelig (f.eks. fra rive (Figur 7A; magenta pilespidser) eller skelsættende obstruktion (Figur 7B; magenta ovaler)) eller skæve ROI-intensitetsmålinger (f.eks. fra foldning (Figur 7C; magenta ovaler)). På trods af at nogle få larver udelades med disse udelukkelseskriterier, repræsenterer alle datasæt heri N = 3 med følgende antal biologiske replikater (larver): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Ved hjælp af DAPI-kanalen blev RPE ROI'er indledt ved først at identificere det punkt, hvor den dorsale apikale side af RPE (nethindevendt) var direkte ved siden af OLM's dorsale spids (Figur 3B',D'; blå pilespidser) (trin 6.2.2). Da distal RPE-udvidelse kan variere mellem sektioner, blev OLM brugt som et anatomisk vartegn til at standardisere RPE ROI-slutpunkter og normalisere vinkelafstandsmålinger i MATLAB (hvor 0 ° = dorsal ROI-slutpunkt og 180 ° = ventralt ROI-slutpunkt). Ved udførelse af RPE-ablationer med farmakologisk manipulation eller i en mutant baggrund bør et anatomisk vartegn identificeres og valideres inden forbehandling og kvantificering. Her var OLM tydelig i alle kvantificerede larver og blev ikke kompromitteret ved at rive (som i Figur 7B) eller behandling med DMSO eller IWR-1. Efter at have identificeret det dorsale udgangspunkt blev der genereret ROI'er efter den apikale side af RPE (dorsal-til-ventral), indtil det punkt, der støder op til spidsen af den ventrale OLM, blev nået (Figur 3B",D"; blå pilespidser). Derefter blev der lavet et ventralt ROI-slutpunkt mellem de apikale og basale (choroid-vendte) sider af RPE som diskuteret i trin 6.2.3 (Figur 3B",D"; magenta linje). ROI blev fortsat efter den basale side af RPE (ventral-til-dorsal), indtil den nåede basalsiden ved siden af udgangspunktet ved den dorsale OLM. ROI blev derefter lukket ved at skabe en spids dorsal ende (Figur 3B',D'; magenta linje) som gjort ventralt. Genetisk ablation har vist sig at resultere i et tab af central eGFP-ekspression, der genvindes som regenereringsprovenu (opsummeret i Figur 6)3; Afhængigt af omfanget af regenerering og intensiteten af eGFP på det tidspunkt, hvor eGFP'en er interessant, kan eGFP-kanalen således kun være nyttig til ROI-generering i MTZ- gruppe. Mens konfokale opkøb også indeholdt eGFP-kanalbilleder, blev ROI-genereringen derfor afsluttet ved hjælp af DAPI- og brightfield-kanalerne som nævnt i trin 6.2.3. RPE ROI-generering var ligetil i DMSO- og IWR-1-behandlet MTZ- larvegrupper og omfattede områder med synligt pigmenterede apikale mikrovilli (Figur 3B; rød pilespids) sammen med de fremtrædende pigmenterede cellelegemer. De samme parametre blev anvendt på MTZ+ larvegrupper (Figur 3D; rød pilespids); På grund af resterende beskadiget væv inden for skadestedet var apikale mikrovilli og pigmenteringsgrænser imidlertid vanskelige at afgrænse i lysfeltkanalen alene i nogle tilfælde. I disse områder blev DAPI-kanalen også brugt til at identificere cellulært affald inden for RPE-skadestedet, som var inkluderet i ROI (Figur 3C,D; eksempler på skadestedslokaliseret cellulært affald er angivet med cyanpilespidser). Immunstaining med markører for umoden/moden RPE (f.eks. ZPR2; Figur 6D,E)37 og/eller fotoreceptorer (f.eks. ZPR1)37,38 kunne også anvendes til at gøre det lettere at skitsere RPE ROI'er i ablerede larver.

Tidligere viste ablerede larver behandlet med IWR-1 fra 4 dpf til 4 dpi signifikant svækkelse af RPE-regenerering sammenlignet med DMSO-behandlede søskendekontroller (figur 8C)3. Dette blev rapporteret som procentdelen af central pigmentgenvinding, hvilket krævede betydelig forudgående erfaring med modellen og manuelle målinger af vinkelafstand for at udpege regenereringsgrænser (figur 8B; sorte pilespidser). RpEGEN blev oprettet for at automatisere kvantificering af RPE-regenerering og reducere iboende forstyrrelser. Ikke kun det, RpEGEN muliggjorde også generering af meget robuste datasæt; f.eks. blev der tidligere genereret 10 datapunkter ved manuel kvantificering af n = 10 DMSO-behandlede MTZ+ -larver (figur 8C; % pigmentgenvinding pr. sektionsmålinger)3, mens der blev genereret 174.801 datapunkter fra n = 11 DMSO-behandlede MTZ+ -larver/ROI'er her ved hjælp af RpEGEN (figur 9C; pixelintensitetsmålinger).

RpEGEN blev udviklet til trinvist at vurdere regionale ændringer i pigmentering over hele RPE ved at udlede en skeleteret centerlinje (1-pixel bredde) fra det oprindelige INVESTERINGSAFKAST genereret ved hjælp af FIJI (figur 4A,B). For at inkorporere alle pixels i ROI til analyse (dvs. ikke kun midterlinjepixels) blev der udført en euklidisk afstandstransformation på hver pixel fra midterlinjen for at oprette et kort over det nærmeste centerlineindeks for hver pixel i ROI-masken. Dette kort over indekser gjorde det muligt at tilskrive hver pixel uden for midterlinjen en enkelt centerline pixel, hvilket skabte et omfattende datasæt på tværs af hele RPE for hver larve (figur 4E). RPE's dorsale til ventrale længde var repræsenteret af vinkelafstand (figur 4G; 0-180 °) i modsætning til normaliseret pixelafstand (figur 4F; 0-1 vilkårlige enheder), da dette var mere intuitivt baseret på tidligere målinger af RPE-regenerering 3,4,5 og det faktum, at vinkelafstanden ikke varierer med morfologiske forskelle. Medianintensiteter afledt af 5-graders bins var den metrik, der blev valgt til at fremhæve store tendenser og minimere højfrekvent variabilitet observeret i 1-graders binned data (tabel 1, figur 10A). Permutationssimulering blev valgt for at teste nulhypotesen for at se, om medianerne for de to behandlingsgrupper (her DMSO MTZ+ og IWR-1 MTZ+ (begge 4 dpi), figur 10B) erens 39. Denne resamplingteknik mangler strenge antagelser om fordelingen af dataene og kan bruges på en række teststatistikker (f.eks. gennemsnit, median osv.) til at generere robuste p-værdiestimater. En række af disse parametre (f.eks. bin-størrelse af rå- og mediandata, permutationssimuleringsgentagelser osv.) kan tilpasses og ændres, så de passer til brugernes behov. For sidstnævnte blev der valgt 20 000 gentagelser for at generere en statistisk robust sammenligning, men man bør sørge for at afbalancere beregningseffektivitet med statistisk robusthed, da for få gentagelser kan give fejlagtige p-værdiestimater. Det anbefales, at der køres flere gentagelsesværdier (10.000, 20.000 osv.) for at sikre, at p-værdifordelingen og værdierne er relativt stabile, inden fortolkningerne påbegyndes. Stigende permutationsgentagelser vil øge den statistiske effekt (men vil også tage længere tid at køre), hvilket kan være gavnligt for nogle datasæt.

Konfokale billeddatasæt blev kvantificeret ved hjælp af RpEGEN som beskrevet i trin 7. De kommenterede RpEGEN- og supportscripts er tilgængelige på GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) sammen med 8-bit TIF og tilsvarende ROI-filer, som interesserede brugere kan teste. Heatmaps, der viste rådata fra MTZ-larve-ROI'er, viste en samlet fordeling af mørkere pixelintensiteter (hvor 0 = sort og 255 = hvid, 8-bit farveskala), der spænder over den dorsale (0°) til ventrale (180°) længde af RPE, uanset behandling med 0,06% v/v DMSO eller 15 μM IWR-1 (figur 9A,B). Plotning af median pixelintensiteter lettede visualiseringen mellem alle grupper og viste ligheder mellem MTZ-grupperne på tværs af RPE (figur 10A; sorte og grå linjer). Disse data understøttede tilstedeværelsen af et intakt pigmenteret RPE-monolag (figur 9E,F) og gav baseline median pixelintensitetsværdier (dvs. under 150) for ikke-ableret RPE (figur 10A; sorte og grå linjer). Sammenligneligt viste rå (figur 9C,D) og median (figur 10A; blå og røde linjer) data fra MTZ+ larve-ROI'er en samlet fordeling af lysere pixelintensiteter i den centrale RPE, igen, uanset behandlingstilstand. Ablerede DMSO-behandlede larver viste centraliseret fordeling af lyspixels ved ca. 100 ° (± 15 °) (figur 9C; orange-røde skraldespande). Dette svarede til et synligt fravær af pigmentering på det centrale RPE-skadested i/omkring synsnerven (figur 9G; blå pilespidser). Ablated IWR-1-behandlede larver viste også centraliseret fordeling af lyspixels, der blev udvidet både dorsalt (til omkring 50 °) og ventralt (med ca. 5 °) sammenlignet med MTZ + DMSO-behandlede søskendekontroller (figur 9D; orange-røde skraldespande). Tilstedeværelsen af et udvidet skadested var tydeligt synligt i sektioneret væv (figur 9H; blå pilespidser). Bortset fra to 1-graders skraldespande var den observerede forskel mellem MTZ+-grupperne statistisk signifikant i den centrale RPE (figur 10B; lyseblåt skraveret område mellem ~40-140°; p-værdi ≤ 0,05), hvilket indikerer signifikant mindre central RPE-pigmentering i MTZ+ IWR-1-behandlede larver sammenlignet med MTZ+ DMSO-behandlede søskendekontroller. Fortolkningen af disse rå (figur 9C,D) og median (figur 10A) data med statistisk sammenligning (figur 10B) ved hjælp af RpEGEN blev valideret ikke kun ved at observere sektioneret væv (figur 9G,H), men understøttede også tidligere resultater fra manuel kvantificering (figur 8)3.

Figure 1
Figur 1: rpe65a:nfsB-eGFP transgen ekspression på 5 dage efter befrugtning. (A-C) Helmonteringsbilleder af en PTU-behandlet 5 dpf larve, der viser svagt transgenekspression i pinealkirtlen (A; gul pilespids) og lyse transgenekspression i RPE (B,C) på tidspunktet for screening for genetisk ablation. (B) Transgenekspression er synligt lokaliseret til de centrale to tredjedele af RPE, og hvide pilespidser fremhæver grænsen mellem perifer (umoden) og central (moden) RPE. Grøn = eGFP. Anterior er oppe. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Verifikation af vellykket genetisk ablation af RPE in vivo. Fuldmonterede billeder af (A) tre utilblerede (MTZ-) 7 dpf larver, der viser RPE-pigmentering i hele øjet og (B) tre ablerede (MTZ+) 2 dpi larver, der viser en ablationszone, hvor der er fravær af pigment i de centrale to tredjedele af RPE (røde pilespidser). Anterior er oppe. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: RPE-regioner af interesse (ROI'er) til automatiseret kvantificering ved hjælp af RpEGEN. Tværgående kryolektioner af (A,B) en utilligeret (MTZ-) 9 dpf larve og (C,D) en ableret (MTZ+) 4 dpi larve med RPE ROI'erne fremhævet i magenta. (B,D) Røde pilespidser fremhæver områder, hvor synligt pigmenterede apikale mikrovilli blev inkluderet i ROI. (C,D) Cyan pilespidser peger på eksempler på regioner med skadesstedslokaliseret DAPI+ affald, som blev brugt til at inkludere RPE-celleaffald i ROI. (B',B",D',D") Digitale zooms af både de dorsale og ventrale ROI-områder (sorte stiplete felter i B og D) viser foreslåede ROI-udgangspunkter (blå pilespidser) og de spidse ROI-ender, der er kritiske for slutpunktsdetektion i MATLAB. Brightfield-billeder er også vist i figur 9E,G. Hvid/grå = kerner. Dorsal er oppe og distal er tilbage. (A-D) Skalabjælker = 40 μm. (B',B",D',D") Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: RpEGEN-behandlingsarbejdsgang. (A) Eksempel på et korrekt orienteret 8-bit brightfield-billede og FIJI-genereret ROI (rød) importeret til MATLAB. Dorsal er oppe og distal er tilbage. Farvebjælken repræsenterer 8-bit gråtoneintensitetsværdier, hvor 0 = sort og 255 = hvid. (B) Indledende binær skeletisering (hvid) af ROI-masken (rød), der viser tilstedeværelsen af fejlagtige sporer og afgrænsningen af start- og slutpunkterne for geodætisk pixelafstandsafgrænsning som vist i (C). Farvebjælken i (C) repræsenterer euklidisk pixelafstand. (D) Spurs fjernes ved hjælp af en forenklet vej, der er billigst fra slutpixlen tilbage til startpixlen, hvilket resulterer i en kontinuerlig midterlinje uden sporer (rød). (E) Nærmeste lineære centerlinjeindekser baseret på en afstandstransformation mellem alle pixels i ROI-masken og midterlinjepixlerne (hvid). Disse indeksværdier gør det muligt at tildele hver billedpixel i ROI-masken til den nærmeste midterlinjepixel til analyse. Farvebjælken repræsenterer de lineære pixelindeksværdier for midterlinjen. (F) Et eksempel på den normaliserede pixelafstand langs midterlinjen, hvor 0 (blå, distal-most dorsal pixel) er startpixlen og 1 (rød, distal-most ventral pixel) er slutpixlen. (G) Ligner (F), men bruger vinkelafstanden, hvor 0 grader (blå) er startpixlen og 180 grader (rød) er slutpixlen. (H) Eksempel på medianpixelintensitetsværdierne beregnet for hver centerlinjepixel. Farvebjælken repræsenterer den gennemsnitlige gråtoneintensitetsværdi for alle ROI-pixels, der bidrager til hver given midterlinjepixel. Denne figur viser billeder fra et testdatasæt og ikke larver fra behandlingsgrupperne 0,06 % v/v DMSO eller 15 μM IWR-1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Bevis for RPE-ablation og fotoreceptordegeneration. (A) Tværgående kryoser af en utilligeret 6 dpf larve. (A,A') Efter eksponering for PTU er transgenekspression begrænset til modne RPE-celler, med det lyseste udtryk begrænset til de centrale to tredjedele af RPE. Pilespidser angiver apikale mikrovilli. (A") DIC-billeder (Differential interference contrast) afslører normal ydre nukleart lag (ONL; dvs. fotoreceptor) arkitektur. (B,B') Tværgående kryolektioner af en 1 dpi larve afslører signifikant forstyrrelse af eGFP + cellemorfologi og desorganisering i ONL laminering. Pile angiver delaminerede og pyknotiske kerner. (B") DIC-billeder afslører yderligere den markante forstyrrelse af ONL-arkitekturen. Grøn = eGFP, blå = kerner, gul = ONL. Dorsal er oppe og distal er tilbage. Skalabjælken i (A) repræsenterer 40 μm og kan anvendes på (B). Skalabjælken i (A') repræsenterer 40 μm og kan anvendes på (A",B',B"). Denne figur og figur legende tekst er blevet ændret fra Hanovice et al. 2019 (figur 1)3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Model for RPE-regenerering i larvezebrafisk. (A) nfsB-eGFP udtrykkes i moden RPE i de centrale to tredjedele af øjet. (B) Anvendelse af MTZ fører til apoptose (TUNEL, rød) af RPE og fotoreceptorer. (C) RPE-ablation fører til degeneration af fotoreceptorer og Bruchs membran (prikket linje). (D) Utilbibelt RPE i periferien begynder at sprede sig og strække sig ind i skadestedet (blå). (E) Efterhånden som regenereret eGFP+ RPE vises i periferien, kan RPE opdeles i fire zoner: perifer RPE (pRPE), differentieret RPE (dRPE), overgangszone (TZ) og skadested (IS). (E, inset) Regenereret differentieret RPE (grøn) vises i periferien proksimal til den ikke-blerede perifere RPE og indeholder proliferative celler ved siden af overgangszonen. Overgangszonen består af stadig differentierende RPE-celler (ZPR2, rød) og proliferative celler (blå). Skadestedet omfatter upigmenterede proliferative celler, der ikke udtrykker nogen RPE-differentieringsmarkører. (F) Regenerering af et funktionelt RPE-lag og Bruchs membran er afsluttet med 14 dpi. Denne figur- og figurlegendetekst er ændret fra Hanovice et al. 2019 (figur 14)3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Kompromitterede vævssektioner udelukket fra billedanalyse. (A-C) Tværgående kryolektioner af larver fra 0,06% v/v DMSO og 15 μM IWR-1 datasæt, der opfyldte udelukkelseskriterierne. En larve viser dorsal RPE-vævsrivning (A; magenta pilespidser) og to andre larver viser vævsfoldning, der enten forhindrer et anatomisk vartegn (dorsal OLM) i DAPI-kanalen (B; magenta stiplet ovaler) eller kan skæve RPE-intensitetsmålinger fra lysfeltkanalen (C; magenta stiplet ovaler). Hvid/grå = kerner. Dorsal er oppe og distal er tilbage. Skalabjælker = 40 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Farmakologisk hæmning ved hjælp af IWR-1 forringer RPE-regenerering. Tværgående kryolektioner af ablerede (MTZ+) 4 dpi larver fra (A) 0,06% v/v DMSO og (B) 15 μM IWR-1 behandlingsgrupper. Brightfield-billeder (A,B) og kvantificering af procent RPE-genopretning / sektion (C) viser en betydelig forsinkelse i genopretningen af et pigmenteret monolag i IWR-1-behandlede larver (Student's unpaired t-test, *** p < 0,0001). B) Sorte pilespidser angiver den centrale kant af den regenererende RPE. Dorsal er oppe og distal er tilbage. Skalabjælken i (B) repræsenterer 40 μm og kan anvendes på (A). Denne figur og figur legende tekst er blevet ændret fra Hanovice et al. 2019 (figur 13)3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Rådataoutput fra automatiseret kvantificering af RPE-regenerering i RpEGEN. (A-D) Heatmaps, der viser lysfeltpixelintensitetsfordelinger kompileret fra hele RPE-ROI-området, fra dorsal (x-akser; vinkelafstand = 0°) til ventral (x-akser; vinkelafstand = 180°) for alle larver i hvert datasæt: (A) n = 11, DMSO MTZ-; B) n = 10, IWR-1 MTZ-; C) n = 11, DMSO MTZ+ D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (fra tre uafhængige forældregrupper, N = 3). (A) viser f.eks. data fra 177.460 pixels på tværs af 11 ROI'er. På y-akserne vises pixelintensitet baseret på en 8-bit farveskala, hvor 0 = sort og 255 = hvid. Rådata vises i 5-graders (x-akse) med 5-8-bit intensitetsværdi (y-akse) placeringer, hvor rød = maksimalt antal placeringer og mørkeblå = minimum placeringsantal. (E-H) Tværgående kryolektioner af repræsentativ (E,F) utilbibelt (MTZ-) 9 dpf larver og (G,H) ableret (MTZ+) 4 dpi larve fra 0,06% v/v DMSO og 15 μM IWR-1 behandlingsgrupper. RPE ROI'er fremhæves i magenta, og ekstremer med vinkelafstand er angivet (0° = dorsal, 180° = ventral). Generelt viser disse data fordeling af mørkere pixels (intensitetsværdier mellem 0-150) i (A,B,E,F) utilblerede ROI'er sammenlignet med (C,D,G,H) ablerede ROI'er, uanset behandling. Data fra ablerede ROI'er viser (C,G) centraliseret (100° ± 15°) fordeling af lysere pixels (intensitetsværdier mellem 150-250) i DMSO-behandlingsgruppen, der (D,H) udvides dorsalt (til ~50°) og lidt ventralt (med ~5°) i IWR-1-behandlede larver. (G,H) Disse centrale ablationszoner fraværende pigment fremhæves af blå pilespidser. Sorte pile angiver placeringen af den optiske nerve. Billeder fra DMSO-behandlede larver er også vist i figur 3. Skalabjælker = 40 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Grupperesultater og statistisk sammenligning afledt af automatiseret kvantificering af RPE-regenerering i RpEGEN. (A) 5-graders binned medianværdier og 95% konfidenskonvolutter afledt af rådataene for hver gruppe. Plottet viser lighed mellem MTZ-grupperne (sorte og grå linjer) på tværs af den dorsale (0°) til den ventrale (180°) længde af RPE med bemærkelsesværdige forskelle mellem og mellem MTZ+- grupperne (blå og røde linjer) i den centrale RPE (lyseblåt skraveret område mellem ~40-140°). Specifikt forekommer medianpixelintensiteten lysere (0 = sort og 255 = hvid) i IWR-1 MTZ+ 4 dpi sammenlignet med enhver anden behandlingsgruppe, hvilket svarer til nedsat central RPE-pigmentering. (B) En statistisk sammenligning af medianværdierne afledt af 1-graders beholdere på tværs af den dorsale (0°) til ventrale (180°) længde af RPE for DMSO MTZ+ 4 dpi og IWR-1 MTZ+ 4 dpi forstærker observationen i (A). p-værdier blev beregnet ved hjælp af en permutationssimulering med 20.000 gentagelser og en tosidet test for hver 1-graders skraldespand. Under nulhypotesen om, at de to grupper har lignende medianværdier for enhver tilsvarende 1-graders bin, indikerer en p-værdi ≤ 0,05 en statistisk signifikant forskel mellem gruppemedianerne (stiplet sort linje = 95% konfidensinterval (CI)). Tilstedeværelsen af p-værdier ≤ 0,05 på tværs af den centrale RPE (lyseblåt skraveret område mellem ~ 40-140 °) indikerer signifikant mindre pigmentering i ablerede (MTZ+) IWR-1-behandlede larver sammenlignet med ablerede (MTZ+) DMSO-behandlede søskendekontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Variabelt navn Variabel type Variabel størrelse Variabel beskrivelse
ROIname Celle {N x 1} Navne på de BEHANDLEDE ROI-filer
ROIxy Celle {N x 1} ROI-hjørner for hver ROI-fil, der behandles
IMGname Celle {N x 1} Navne på de behandlede TIF-billedfiler
IMG Celle {N x 1} 8-bit brightfield-billeddata for hver TIF, der behandles
ROIBW Celle {N x 1} Logisk (0 eller 1) ROI-maske med de samme dimensioner som IMG-billeder
Cline Celle m/ tabeller {N x 1} (n x 16) Centerlinjedata for individuelle billeder, herunder x, y, afstand, vinkel, indeks, antal punkter og statistik
CIdx Celle {N x 1} Centerline indice data vedrørende ROI maske peger på det nærmeste centerline punkt til beregning af CLine
CLineBW Celle {N x 1} Logisk (0 eller 1) matrix med de samme dimensioner som IMG-billeder, der angiver placeringen af midterlinjen (= 1)
RAW_data Bord N x 3 Tabel, der kombinerer alle de rå data for hver pixel i ROI'erne på tværs af alle de forskellige IMG-billeder
BIN_1_deg_all Bord N x 9 Tabel med 1-graders binned data og statistik ved hjælp af data fra RAW_data
BIN_5_deg_all Bord N x 9 Tabel med 5-graders binned data og statistik ved hjælp af data fra RAW_data
BIN_10_deg_all Bord N x 9 Tabel med 10-graders binned data og statistik ved hjælp af data fra RAW_data

Tabel 1: Beskrivelse af variabler eksporteret fra RpEGEN.m-scriptet til MAT-filen. Definitionerne er som følger: ROI(s) = region(er) af interesse; TIF = tagget billedfilformat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver metoden til genetisk ablat rpE og undersøgelsesmekanismer for degeneration og regenerering i larvelagrede zebrafisk. Denne protokol er også blevet udført med succes i voksne zebrafisk3, men med mindre omfattende karakterisering, hvorfor larver er i fokus her. Kritiske aspekter af denne del af protokollen (trin 1-4) omfatter: 1) tilføjelse af 1,5x PTU til embryoner før begyndelsen af melanogenese, 2) deforkortende PTU-behandlede embryoner på 2-3 dpf, 3) omhyggelig screening for eGFP og 4) timing af vandforandringer under genetisk ablation med MTZ. PTU hæmmer melaninsyntese21,22 og er blevet anvendt i dette RPE-ablationsparadigme for at lette screening for rpe65a: nfsB-eGFP-transgenekspression og for at muliggøre karakterisering af RPE-degenerative og regenerative processer baseret på henholdsvis fravær og efterfølgende tilbagevenden af pigmenteret væv 3. Da PTU vil hæmme yderligere pigmentering, men ikke depigmentvæv, når melanogenese er begyndt21, skal PTU tilsættes inden pigmenteringen begynder, som begynder omkring 24 hpf i zebrafisk25. Her og i tidligere undersøgelser 4,5 er PTU blevet tilsat ved ca. 6 hpf26 for at sikre hæmning, før melaninsyntesen begynder. Mens PTU muliggør visualisering af vigtige protokoltrin, kan PTU-behandling påvirke nogle aspekter af udviklingen (som diskuteret i trin 2.3) og forringe embryoudklækning. Sidstnævnte proces kan, hvis den forsinkes for længe, føre til morfologi- og motilitetsunderskud og påvirke levedygtigheden40; således er deforkorting (udklækning) embryoner enten enzymatisk med pronase eller manuelt ved hjælp af tang på 2-3 dpf vigtig for at opretholde og standardisere larvens sundhed inden genetisk ablation. En anden vigtig overvejelse for at undgå problemer med ældre larves sundhed og levedygtighed (uden relation til PTU-behandling) er, at larver bør begynde standardiserede fodringsregimer, hvis de forbliver ude af et akvatisk facilitetssystem forbi 9 dpf / 4 dpi til forsøg41.

Som forklaret driver rpe65a transgenekspression i moden RPE i de centrale to tredjedele af det bageste øje. Ekspression af eGFP i PTU-behandlede 5 dpf larver er normalt let detekteret og synligt intens (lys), som vist i figur 1. Larver, der svagt udtrykker eGFP ved 5 dpf sammenlignet med søskende med lyst udtryk, kan også observeres. Variation i ekspressionsintensitetsforhold (dvs. lyse vs. svage) mellem generationer kan også eksistere, hvor nogle generationer har mere svagt udtrykte larver end andre. Under alle omstændigheder repræsenterer larver med svagt eGFP-udtryk normalt et mindretal af dyrene i hver kobling. Mens det er ukendt, om svagt udtrykkende larver viser mindre alvorlige RPE-skadefænotyper, er ablationer blevet udført i den lyse eGFP + kohorte fra hver kobling, og forholdsvis svage søskende er blevet aflivet ved screening og udelukket fra analyse. Tilsvarende er omfattende karakterisering af zebrafiskens RPE-ablations- og regenereringsfænotyper blevet udført i larver heterozygot for rpe65a: nfsB-eGFP-transgenet ved at overskride rpe65a: nfsB-eGFP heterozygote voksne til vildtype voksne3. Det vides dog usandsynligt, om larver homozygote for rpe65a:nfsB-eGFP viser mere alvorlige ablationsfænotyper. Andre bestræbelser på at standardisere ablationsprotokollen omfatter tilsætning af lige store, målte volumener (f.eks. 30 ml pr. 10 cm petriskål) til MTZ- og MTZ+ retter i løbet af den genetiske ablationsperiode på 24 timer. Ligeledes har larver i farmakologiske behandlingsretter modtaget lige store, målte mængder (f.eks. 5 ml pr. 6 brønd) og rettidig genopfyldning af friske forbindelser (f.eks. Hver 24. time). Ved håndtering af tallerkener med forskellige MTZ- og/eller farmakologiske forbindelsesbehandlinger bør der træffes omhyggelige foranstaltninger for at forhindre spild og utilsigtet krydskontaminering under transport og vandforandringer.

Zebrafisk RPE ablationsprotokollen kan ændres til at omfatte farmakologisk manipulation (trin 5). Dette er tidligere blevet gjort for at identificere immunrespons5, mTOR4 og Wnt3 signalveje som kritiske regulatorer af RPE regenerering; sidstnævnte har vist sig at kunne gentages her og blev brugt til at validere RpEGEN. Ud over at belyse kritiske RPE-regenereringsveje er farmakologisk manipulation blevet anvendt i vid udstrækning til zebrafisk retinal regenereringsundersøgelser 10,42,43,44,45,46,47. Inden inkorporering i RPE-ablationsprotokollen bør farmakologiske agenser evalueres nøje for toksicitet, virkning og behandlingsvarighed. Dette kan gøres ved: at udføre dosisresponsforsøg for at vurdere toksicitet48; vurdering af ekspression af kendte målgener/proteiner 4,5 og evaluering af kendte funktionelle konsekvenser af farmakologisk manipulation, for eksempel udtømning af leukocytter med PLX3397-behandling 48,49,50,51. Her blev DMSO (vehicle control) og IWR-1 tilsat 24 timer før genetisk ablation, og larverne blev screenet umiddelbart før farmakologisk forbehandling på 4 dpf. Mens eGFP+ larver kan skelnes fra eGFP-larver på 4 dpf, kan intensiteten af eGFP forekomme ret svag, hvorfor larver blev screenet for eGFP-ekspression på 5 dpf (repræsentative resultater). Screening for eGFP før 4 dpf kan være vanskelig, da ekspressionen kan være så lav, at den ikke kan påvises for øjet. Således kan forbehandling med farmakologiske midler før 4 dpf (dvs. på 2 dpf)4 tilsættes til uscreenede larver, der vil blive adskilt på 5 dpf, når eGFP er tydeligt synlig. I ethvert scenarie, hvor larver skal manipuleres (f.eks. under screening, indlejring til billeddannelse osv.), bør farmakologiske behandlingsbetingelser opretholdes, og uanset screeningsalder bør RPE ableres med MTZ på 5 dpf.

Ud over den genetiske ablationsprotokol skitseres trinvise instruktioner til forbehandling af konfokalmikroskopbilleder og automatiseret kvantificering af RPE-regenerering ved hjælp af RpEGEN (trin 6-7). RpEGEN blev oprettet for at standardisere RPE-regenereringskvantificering på tværs af brugere og øge robustheden af outputdatasættet, samtidig med at iboende forstyrrelser, der kan komme med den kedelige manuelle kvantificering, der tidligere er udført, minimeres. Kritiske aspekter af denne del af protokollen udføres under ROI-generering (trin 6). For det første skal billedet/øjet være i dorsal op, distal venstre orientering (f.eks. figur 3A-D, figur 4), da RpEGEN er optimeret til denne retningsbestemthed. Det er også afgørende, at de dorsale og ventrale terminalender af RPE ROI'erne tilspidses til en spids spids som vist i figur 3B',B",D',D" (magentalinjer). Hvis disse ender i stedet er kvadreret eller afrundet, kan RpEGEN-scriptet have svært ved at bestemme midterlinjeskelettets start- og slutpixels og kan generere sporer ved terminale ROI-ender snarere end en centraliseret linje (figur 4B). Sporer i terminalens ROI-ender kan føre til forkortelse af midterlinjen under de-spurring (figur 4D) og / eller problemer med vinkelafstandsmålinger i den perifere RPE (figur 4G). Identiske navngivningssystemer for TIF- og ROI-filerne, der svarer til hver enkelt larve, er også et vigtigt skridt og bydende nødvendigt for parring af 8-bit TIF-filen med det korrekte ROI i RpEGEN. Uoverensstemmende TIF- og ROI-filnavne vil resultere i manglende generering af RpEGEN-behandlingsarbejdsgangen, der er beskrevet i afsnittet Repræsentative resultater (figur 4), og i sidste ende forhindre RPE-regenereringskvantificering ved hjælp af dette script.

Samlet set giver denne protokol instruktioner til med succes at ablate RPE i larvezebrafisk, at manipulere signalveje, der kan være af interesse før, under eller efter RPE-skade, og at kvantificere RPE-regenerering på en standardiseret måde med begrænsede iboende forstyrrelser. I forbindelse med tilgængelige in vivo- og in vitro-modeller til undersøgelse af RPE's regenerative potentiale er zebrafisken unik i sin evne til iboende RPE-regenerering14. Dette er imidlertid en akut model af RPE-skade, ikke kronisk, ligesom RPE-degenerative sygdomme, der er målrettet mod terapeutisk udvikling (f.eks. AMD). Selv om dette er en begrænsning af modellen, er det stadig en glimrende platform til at studere mekanismerne for RPE-regenerering, som stort set er ukendte, og som kan tilpasses i fremtiden for at studere kronisk skade og sygdom. De værktøjer og metoder, der er beskrevet heri, er alsidige og kan også anvendes til undersøgelser af cellulære processer, der er involveret i det degenerative respons, og til at studere skæbnen for RPE-tilstødende væv efter ablation. Ligeledes kan RpEGEN-scriptet ændres, så det passer til brugernes dataoutputbehov; f.eks. at udføre rumlige analyser af andre markører end pigment (f.eks. in situ-hybridiseringssonder, proteinekspression osv.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.L.L. er medopfinder på US Patent #9.458.428, som beskriver en fremskyndet metode til at udlede retinal pigmentepitel fra humane pluripotente stamceller; dette er ikke relateret til indholdet heri. J.M.G. og G.B.F. har intet at oplyse.

Acknowledgments

Arbejdet beskrevet heri blev støttet af National Institutes of Health (RO1-EY29410 til J.M.G og NIH CORE Grant P30-EY08098 til Institut for Oftalmologi); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (til L.L.L. og J.M.G.); og E. Ronald Salvitti Chair i oftalmologiforskning (til J.M.G.). Yderligere støtte blev modtaget fra Wiegand Fellowship in Ophthalmology (til L.L.L), Eye & Ear Foundation of Pittsburgh og et ubegrænset tilskud fra Research to Prevent Blindness, New York, NY. Forfattere vil også gerne takke Amanda Platt for teknisk bistand og Dr. Hugh Hammer og akvatikpersonalet for fremragende dyreplejestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Biologi udgave 181 zebrafisk retinal pigmentepitel nitroreductase metronidazol genetisk ablation regenerering pigmentering farmakologiske forbindelser RpEGEN
Nitroreductase/metronidazolmedieret ablation og en MATLAB-platform (RpEGEN) til undersøgelse af regenerering af zebrafiskens retinale pigmentepitel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter