本文描述了一种测定放射性标记抗体与固定化抗原结合亲和力（KD）的方法。KD 是平衡解离常数，可通过饱和结合实验测定，即在不同浓度下测量放射性标记抗体与其抗原的总结合、特异性结合和非特异性结合。
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本文内容
摘要
摘要
测定结合亲和力（KD）是放射性标记抗体（rAb）表征中的一个重要方面。通常，结合亲和力以平衡解离常数 KD 表示，其数值等于在平衡状态下一半抗体结合位点被占据时的抗体浓度。该方法可推广应用于任何放射性标记抗体或其他蛋白质和多肽支架。与基于细胞的方法相比，使用固定化抗原的方法特别适用于验证抗体长期储存后的结合亲和力、区分双特异性抗体结构中抗原结合片段（Fab）臂的结合亲和力，以及判断不同细胞系之间抗原表达是否存在差异。该方法包括将固定量的抗原固定在可拆分的96孔板的指定孔中，随后用牛血清白蛋白（BSA）封闭所有孔中的非特异性结合位点。然后，将放射性标记抗体（rAb）以浓度梯度形式加入所有孔中。所选的浓度范围应能使 rAb 达到饱和状态，即所有抗原均持续被 rAb 结合的抗体浓度。在未固定抗原的指定孔中，可测定 rAb 的非特异性结合。通过从固定抗原孔中的总结合信号中减去非特异性结合信号，即可确定 rAb 与抗原的特异性结合。rAb 的 KD 值由所得的饱和结合曲线计算得出。例如，本研究以放射性标记的阿米万他单抗（amivantamab）为例测定其结合亲和力，该抗体为一种针对表皮生长因子受体（EGFR）和细胞质间充质-上皮转化因子（cMET）蛋白的双特异性抗体。
引言
放射性标记抗体（rAb）在医学领域具有多种用途。尽管大多数放射性标记抗体主要用于肿瘤学中的成像和治疗，但其在风湿病相关炎症、心脏病学和神经病学方面也有成像应用1。放射性标记抗体成像对病灶检测具有高灵敏度，有望辅助患者治疗方案的选择2,3,4,5。由于其对相应抗原的高度特异性，这些抗体也可用于治疗。在一种称为诊疗一体化（theranostics）的策略中，同一种放射性标记抗体被同时用于成像和治疗6。
理想情况下，用于放射性标记的抗体应是那些已通过非放射性标记方法证实具有高结合亲和力和特异性的抗体。抗体的放射性标记可通过将放射性核素直接化学修饰抗体，形成稳定的共价键（例如放射性碘标记），或通过与螯合剂偶联后再结合放射性金属的间接方法实现7,8。直接放射性标记（如放射性碘标记）会特异性修饰抗体上的酪氨酸和组氨酸残基。如果这些残基对与抗原的结合至关重要，则此类放射性偶联可能改变抗体的结合亲和力。相反，目前已有多种成熟的抗....
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方案
注意：协议的图示请参见图2。
图2：实验方案示意图。 行和列标签作为设置可拆分96孔板的参考指南。图中示例孔展示了抗原与BSA的预期结合情况。弯曲箭头表示仅含有BSA的孔中预期被洗脱的rAb。该图由BioRender.com制作。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 缓冲液的配制
- 配制 50 mL 固定缓冲液（50 mM Na2CO3
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结果
该方法用于计算结合亲和力（KD基于饱和结合实验测定rAb的亲和常数（K），其中将不同浓度的rAb加入固定量的固定化抗原中。结合曲线应呈现对数增长特征，初始阶段上升较陡，随着抗原位点趋于饱和，曲线逐渐进入平台期。为确保所测定的KD 准确时，rAb 的浓度必须足够高以达到饱和。在本实验中，放射性标记抗体与 DFO 偶联，并进行放射性标记 89Zr，如前所述19. 图3 显示典型的饱和结合曲线。放射性标记的阿米万他单抗（amivantamab）是一种针对表皮生长因子受体（EGFR）和细胞质间质-上皮转化因子（cMET）蛋白的双特异性抗体，其与EGFR结合（图 3A）和 cMET（图3B蛋白质19饱和结合曲线还展示了单臂放射性标记的Fab片段与EGFR结合的情况（图3.......
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讨论
在重组抗体（rAb）的开发过程中，确保重组抗体能够以高亲和力特异性结合其靶标至关重要。通过使用固定化抗原的放射性配体饱和结合实验，可以确定结合亲和力，从而判断放射性标记是否影响重组抗体的免疫反应活性。测定重组抗体与牛血清白蛋白（BSA）的结合情况，可用于量化非特异性结合，从而更准确地测量其对固定化抗原的特异性结合。该方法通过检测不同浓度重组抗体的结合情况，绘制饱和结合曲线，进而计算解离常数（KD）并确定其结合亲和力。
进行该检测时，必须具备待研究单克隆抗体（rAb）的抗原。该抗原需要含有抗体所结合的表位。在新型抗体的结合表位未知的情况下，使用非放射性标记的方法测定结合亲和力可能更为合适。在开始实验之前，建议进行文献检索。此前已在基于ELISA的检测中成功使用的感兴趣抗原，很可能也适用于本检测。
根据放射性核素的半衰期 根据伽马计数器的灵敏度，标准品可能需要一定时间衰变至伽马计数器可准确定量的放射性水平。若预计放射性水平过高，超出伽马计数器的检测范围，可对标准品进行稀释，随后在数据分析时乘以相应的.......
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致谢
作者感谢3D Imaging提供了[89Zr]Zr-草酸盐，并感谢强生制药公司的Sheri Moores博士提供了抗体。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| γ计数器 | Hidex | Hidex Automatic Gamma Counter | |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad | 版本 9.2；本研究用于统计分析 | |
| 免疫可断裂 MaxiSorp 96 孔板 | Thermo Scientific | 473768 | |
| 微孔板封板膜 | Corning | 4612 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190144 | |
| 碳酸氢钠 | JT Baker | 3506-01 | |
| 碳酸钠 | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 |
参考文献
- Krecisz, P., Czarnecka, K., Krolicki, L., Mikiciuk-Olasik, E., Szymanski, P. Radiolabeled Peptides and Antibodies in Medicine. Bioconjugate Chemistry. 32 (1), 25-42 (2021).
- Dun, Y., Huang, G., Liu, J., Wei, W. ImmunoPET imaging of hematological malignancie....
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重印与许可
